A. 免疫學技術知識總結 第二章
第二章 抗體制備技術
抗體的基本概念：多克隆抗體（多個淋巴細胞克隆所分泌的抗體）和單克隆抗體（單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體）
單克隆抗體的特點：
高度均質（同一亞類），化學組成均一，不含或很少含Ig
特異性強，只針對某一種抗原表位
親和力強
抗原用量少，無須純化
無批間差異
來源穩定，可達批生產，容易標准化
不易形成沉澱線
操作比較麻煩
什麼條件下需要制備單抗：
目的蛋白有類似的結構
抗原不純，無法分開
多抗的效果不好（已經排除非特異性反應）
希望將抗體用於治療，研製成葯物
希望將抗體用於診斷，研製成診斷試劑。
第一節 多克隆抗體的之別
一、多克隆抗體制備的原理
抗體制備、動物免疫、抗體純化
二、多抗的基本條件
1. 免疫原的制備
顆粒性抗原：細胞、病毒、細菌等，一般具有較強的免疫原性，可以不加佐劑，直接進行腹腔注射。
可溶性抗原：可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核細胞或者真核細胞中表達，可溶性抗原需要與弗氏佐劑完全或不完全混勻，才可以進行免疫。
（1） 完全抗原的提取：細胞破碎法、抗原提取、抗原的純化
（2）半抗原與載體的交聯：載體的選擇、半抗原與載體偶聯的方法、偶聯復合物的鑒定
（3）合成肽抗原：免疫原性肽的選擇、肽的合成和純化
2. 免疫動物的選擇：
3. 佐劑的准備：
佐劑的種類：無機佐劑、有機佐劑、合成佐劑、油劑
三、多克隆抗體制備的基本方法
1. 抗原計量、免疫途徑與免疫日程
免疫動物的方法：
免疫原值被：
無佐劑免疫法：適用於顆粒性抗原
弗氏佐劑免疫法：適用於可溶性抗原
鋁佐劑免疫法：適用於人的免疫
免疫動物（一般選擇雌性動物，溫順並且可以生產）
皮內免疫法
皮下或肌肉免疫法
淋巴結免疫法
混合法
抗體效價滿意後靜脈注射加強免疫
常見的注射方法；皮下注射、皮內注射、尾靜脈注射、靜脈注射
2. 小樣試血與采血
抗血清的獲得：眼眶取血、頸動脈放血、心臟采血
免疫效果評價：取血（兔耳動脈、鼠尾靜脈）、檢測（雙向免疫擴散、ELISA）
3. 抗體的分離和純化技術
鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析、親和層析法、電泳分離法
親和層析法原理：利用蛋白質之間的特異性結合（抗原-抗體、受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結合，捕捉與他相配的物質，洗脫另外一種物質，並且洗脫一般用改變pH的方法。
主要步驟：將蛋白質與活化柱子結合，將腹水或者血清處理後過柱子，用結合緩沖液洗柱子（知道A280為零），永安氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液，測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品。
4. 抗體的鑒定
蛋白質濃度的測定：紫外分光比色法、雙縮脲法、福林酚法、
免疫效果評價：雙向免疫擴散、ELISA
純度分析：免疫印跡（WB）
抗體類別分析：免疫金試條
親和力分析：ELISA、熒光偏振
5. 抗體的保存
抗體的濃縮：吸收、蒸發、超濾
抗體的保存：濃縮抗議+甘油+防腐劑
免疫效果不佳的原因可能是：抗原純度不夠、免疫原性低、免疫途徑乳化不合格、免疫劑量不合適、動物疾病或者種屬差異小。
第二節 單克隆抗體制備技術
一、單克隆抗體制備的原理
1個B細胞只能產生1個抗體。方法是細胞工程雜交技術和B細胞雜交瘤技術
需要將單克隆B細胞和腫瘤細胞相結合才可以永久產生單抗
Barski等發現細胞額自然融合現象，但是頻率很低
岡田等發現滅火的仙台稟賦和聚乙二醇能顯著提高細胞融合的效率。
二、單抗制備的基本條件
需要培養正常的B細胞以及B細胞融合的腫瘤細胞
1. 動物的免疫抗原與載體、動物的選擇、免疫途徑
舉例：小鼠免疫
第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑——小鼠背部皮下注射（4周後）
第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑——小鼠背部皮下注射（3周後）
第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（10天後檢測血清效價）
加強免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（3天後）
細胞融合
2. 酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養
細胞DNA合成途徑：
次黃嘌呤（H）通過嘌呤合成跑路途經合成HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）進一步合成鳥嘌呤核苷酸
胸腺嘧啶核苷（T）通過嘧啶合成旁路途經合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），進一步合成胸腺嘧啶脫氧核苷酸
氨基酸、谷氨醯胺、鳥核苷單磷酸通過核酸生物合成主要途徑結合上面兩步合成的鳥嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脫氧核苷酸形成DNA
將第三步當中氨基端變為氨基碟呤（A），則無法形成DNA。
因此酶缺陷型細胞的篩選就是HAT篩選
3. 單抗檢測方法的建立
免疫酶技術
免疫熒光技術
免疫擴散技術
三、單抗制備的基本方法
1. 酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養
組織培養的基本條件：
儀器：包括CO2培養箱、倒置顯微鏡、超凈台、液氮罐、低速低溫離心機
試劑：培養液、HAT選擇培養液、HT培養液、血清、抗生素
耗材：培養板、培養品、吸管、移液管
骨髓瘤細胞系的選擇要點：
（1） 所選的骨髓瘤細胞應與提供免疫脾細胞的動物品系相同
（2） 自身不產生免疫球蛋白的重鏈和輕鏈
（3） 對氨基碟呤敏感
（4） 與免疫脾細胞融合後產生穩定分泌的Ig雜交細胞
2. 飼養細胞的制備
飼養細胞的作用：
（1） 增加細胞濃度，滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的要求
（2） 吞噬清楚死亡的細胞
（3） 分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長
飼養細胞的種類和制備方法
（1） 小鼠腹腔巨噬細胞
（2） 小鼠脾細胞
（3） 成纖維細胞
3. 脾細胞的分離
（1） 拉頸椎處死小鼠
（2） 無菌操作取出脾臟
（3） 清洗、研磨
（4） 收集細胞
（5） 離心洗滌
（6） 細胞計數
4. 細胞融合：骨髓瘤細胞和脾細胞按照1:10或1:5的比例混合並加入促融劑PEG
細胞融合的方法：PEG融合、仙台病毒、電融合
5. HAT選擇性培養
HAT選擇性培養的原理：細胞的DNA生物合成右主要途徑和補償途徑。當A存在是，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，須通過補償途徑合成DNA，這時就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。
由於選用西黃嘌呤鳥嘌呤荷塘轉移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在細胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）細胞作為親本，該校只能通過群全條件的DNA培養基才可合成，因此雜種細胞通過互補作用獲得HGPPT或者TK基因。只有雜種細胞可以活，酶缺乏性細胞完全無法存活，單克隆B細胞一般不能長期生長，就起到了分離雜交細胞的作用。
細胞生長情況：融合3-4天之後，可以看到刑訴骨髓瘤細胞，混元透亮的克隆。融合後第7-9天去培養上清，檢測特異性抗體。
篩選後存活的細胞就是脾細胞和骨髓瘤細胞融合細胞。
6. 陽性克隆的篩選
分泌單克隆抗體雜交瘤細胞的檢測方法
免疫酶技術：簡介ELISA法
免疫熒光技術：間接免疫熒光測定法、流式細胞分析技術（陰性對照：骨髓瘤細胞培養上清，陽性對照：免疫鼠血清）
7. 克隆化培養：陽性細胞的單克隆化
克隆是指由單個細胞繁殖、擴增而形成的性狀均一的細胞集落的過程。
常見方法有：有限稀釋法和軟瓊脂克隆技術
有限稀釋法：從陽性分泌孔收集雜交瘤細胞。
軟瓊脂克隆技術：從陽性分泌孔中收集雜交瘤細胞，一適當濃度雜交瘤細胞加入到軟瓊脂培養基中，形成有一個細胞增殖來的細胞集群。
單克隆抗體的鑒定：
（1） 抗體敏感性檢測：對腹水和培養基上清進行效價測定
（2） 抗體特異性鑒定：是否與其他抗原右交互反應。
（3） 抗體效價測定
（4） 抗體亞類鑒定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM
（5） 抗體親和力鑒定
（6） 識別表位分析
8. 單克隆抗體的擴大生產：細胞培養法、小鼠體內誘生法、生物反應器
細胞培養法：雜交瘤細胞、培養瓶或罐中培養、收集上清液、純化抗體
動物體內誘生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液體是啦或降植烷、腹腔內接種雜交瘤細胞、收集腹水
生物反應器：發酵罐培養
單抗培養常見的問題：
（1） 污染：培養環境、操作
（2） 融合細胞不生長：PEG、血清、HAT培養基
（3） 抗體分泌不足：支原體污染、細胞突變、培養體系有問題
（4） 雜交瘤細胞難以克隆化：血清質量、細胞活性
第三節 基因工程抗體制備技術
基因工程抗體：通過基因工程的手段，按照個人意願進行細胞人工改造的技術。
優點主要有：特異性高、質量穩定、成本低廉、工藝簡單、異源性滴低、穿透性好、功能豐富。
一、鼠源抗體人源化
鼠源抗體應用中的障礙：免疫原性、半衰期短、抗體功能片段失活。
1. 嵌合抗體：可變區基因克隆、表達載體的構建、嵌合抗體的表達
2. 改型抗體
二、小分子抗體：Fab抗體、Fv抗體和單鏈抗體、單域抗體、最小識別單位
小分子抗體的優點：
（1）可在原核體系中表達，降低生產成本。
（2）因為其分子量小，穿透能力強，易進入病灶部位，有利於對腫瘤等疾病的治療。
（3）不含Fc片段，不與Fc受體結合，可減少因廣泛分布的Fc受體而帶來的不利影響。
（4）在體內半衰期短，有利於體內毒性物質的消除
（5）易於進一步基因工程分改造。
三、]基於抗體的應用
1. CAR-T免疫治療：
CAR-T免疫療法：即嵌合抗原受體T細胞免疫療法，是一種新型的過繼性細胞療法，即利用病人自身的免疫細胞來清除癌細胞的細胞療法，並非葯物。
CAR-T技術：通過整個嵌合抗原受體的經過基因修飾的T細胞抵抗腫瘤細胞的療法。嵌合抗原受體可以特異性識別腫瘤相關抗原或者腫瘤特異性抗原，識別結合後將激活及增值信號傳遞到T細胞內，引起T細胞激活，增殖釋放細胞因子，從而殺傷腫瘤細胞。
2. 免疫檢查點
3. 免疫毒素
4. ADC
5. 雙特異性抗體
第四節 [endif]抗體庫技術
抗體庫技術：即用基因克隆技術將全套抗體輕重鏈可變區基因克隆出來，重組到原核表達載體上，通過原核系統直接表達有功能的抗體分子片段，並篩選出特異性的抗體分子和可變區基因。
一、噬菌體展示技術原理：噬菌體展示技術是將外源蛋白質或者DNA序列查到噬菌體外殼上的適當位置，使外源基因隨著外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨著噬菌體的重新組裝而展現倒是菌體表面的生物技術。到目前為止，人們已經靠發出單鏈絲狀噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統等。
二、噬菌體抗體制備的基本程序
1. 收集淋巴細胞提取mRNA並轉錄到cDNA或直接提取斯堡基因組的DNA
2. 擴增DNA的抗體可變區基因
3. [構建重組噬菌體庫
4. 篩選所需特徵的重組噬菌體
5. 採用突變或鏈置換使親和力成熟
三、噬菌體抗體技術的特點
1. 篩選步驟簡單、快速、有效
2. 擴大了篩選流量，一次就可以篩選多於1010個的克隆
3. 抗體基因型與表現性聯系密切，基因穩定且容易改造
4. 模擬天然免疫系統親和力成熟過程
5. 無需人工接種
6. 可替代動物多克隆抗體
7. 構建康體苦時。輕重鏈可變區基因在體外隨機組合，可產生體內部存在的輕重鏈組合，得到新的特異性抗體。
8. 可以在預案和系統中表達，大規模生產方便，且成本低。
四、抗體庫技術的應用
1. 制備全人源抗體
2. 改良基因工程抗體
B. 請問檢測動物機體免疫功能的方法都有哪些
細胞免疫（CMⅠ）是由多種細胞相互作用的結果。免疫細胞間相互作用導致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數量和功能與包括各類因子活性測定，因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復雜，且很難標准化
一、遲發型過敏反應的體外檢測方法
皮膚試驗和接觸性過敏的誘發是檢測遲發型過敏反應（DTH）的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發對曾經使病人致敏的抗原的再次應答，而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質發生致敏的能力。
1．皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH，常用的抗原有結核菌純蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人類試驗時在前臂皮內注射少量可溶性抗原，24～48小後，測量紅腫硬結的大小，硬結直徑大於10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力，若皮試無反應，可用更高濃度的抗原重復試驗，若仍無反應即為陰性，需排除皮試技術誤差，也可能受試者從未接觸過此抗原，也可能由於細胞免疫功能缺損，或由於細胞免疫功能缺損，或由於嚴重感染（麻疹、慢性播散性結核）造成的無反應性。
2．接觸性過敏常應用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質結合而導至DTH反應。在動物試驗時，初次皮膚上塗抹DNCB後間隔7～10天再激發刺激，則皮膚出現即為陽性。此試驗人類已不使用。
二、細胞免疫的體外檢測方法
體外檢測淋巴細胞的數量和功能，最易採集的是血標本，首先需分離或純化淋巴細胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液，當將血液重疊於淋巴細胞分層液之上離心時，由於紅細胞（1.092）、多形核白細胞（1.090）、淋巴細胞（1.070）的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細分出這一薄層的細胞，其中淋巴細胞佔80%，單核細胞佔20%，淋巴細胞中T細胞佔80%，B細胞佔4%～10%，其作為非DT、非B細胞。
1．T細胞計數
（1）E花環法：人類T細胞表面有SRBC受體（CD2）能與SRBC結合形成玫瑰花環樣結構，將經分層液分離現的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經37℃培養5～10分鍾放4℃過夜，取細胞懸計數，外周血淋巴細胞中約70%～80%淋巴細胞結成花環即為T細胞。目前此方法已用來分離T細胞，而不用做T細胞計數。
（2）用單克隆抗體計數T細胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結合，再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3+細胞即總T細胞。正常人在PBM中T細胞佔70%～80%。正常人的CD4+細胞和CD8+細胞之和應與CD3+細胞數一致。CD4+細胞與CD8+細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小於1.7。
2．T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加，最圖導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴細胞數，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞，用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉化率。最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法，稱為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色甲（fromazan）產物。該產物的多少與活性細胞數正相關。結果可用酶標檢測儀（595mm）測量匯豐銀行密度，做為MTT法的檢查指標。此法的結果與3H-TdR摻入法平行，並能反應試驗中的活細胞數（表20-3）。
表20－3 淋巴細胞增殖反應的刺激物
分裂原
T細胞
B細胞
植物血凝素（PHA）
+
－
刀豆蛋白A（ConA）
+
－
美洲商陸（PWM）
+
+
葡萄球菌蛋白A（SPA）
±＊
+
副傷寒桿B（SPB）
±
+
註： PWH主要是T細胞分裂原，也可通過刺激T細胞分泌可溶性因子誘導B細胞增殖分化；
＊SPA誘導B細胞分裂不需要T細胞協助，但誘導B細胞激活抗體分泌細胞需要T細胞協助
3．細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒（殺傷）作用。常用的栓測細胞毒效應的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合，於37℃培養1小時左右，51Cr即可進入靶細胞，與胞漿蛋白結合，洗去游離的51Cr後，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合（比例約為50：1或100：1）靶細胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細胞吸收。用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值，即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。
細胞毒試驗檢測Tc細胞效應功能是否健全，及經IgG介導的ADCC效應，或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。
4．混合淋巴細胞的反應（MIR） 是體外研究T細胞的較好的方法，雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養4～5天，在最後8小時摻入51TdR摻入法測T細胞的反應性。或用細胞毒法觀察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合（靶細胞來自與刺激細胞相同的個體）如果T細胞受刺激後產生了細胞毒T細胞，可殺死活的細胞，根據靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子）和LIF（白細胞移動抑制因子）來評估細胞免疫功能。近年來應用測定IL-2的免疫酶技術，操作簡單，並能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細胞與分裂原一起培養24小時，然後測定清液中的IL-2活性。在細胞免疫功能缺損時，特別是AIDS病人，IL-2分泌明顯降低。而有些疾病，如多發性硬化、類風濕關節炎、移植排斥反應等病人體內血清中IL-2水平升高，表明病人T細胞活性增高。發生移植排斥反應的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶聯免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細胞脫落的IL-2受體（CD25），一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的，IL-2和IL-2受體的檢測可用於對某些疾病的監測，如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。
對體外培養的細胞進行細胞因子產生能力檢測是檢查細胞培養上清液中細胞因子的生物活性或抗原性。現已可用核酸雜交技術，即從組織中或細胞中提取RNA，與同位素或酶標記的該種細胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗，即印跡（dot blotting）或Northern印跡，若查出有某種因子的mRNA存在，即說明該細胞在所處培養條件下有產生某種細胞因子的能力。
C. 免疫分析方法有哪些
（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）。RIA技術是使用以放射性同位素（如125I、32P、3H等）作標記的抗原或抗體，用γ－射線探測儀或液體閃爍計數器測定γ－射線或β－射線的放射性強度，來測定抗體或抗原量的技術。它包括以標記抗原為特點的放射免疫分析和以標記抗體為特點的免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。前者以液相競爭結合法居多，既測大分子抗原又測小分子抗原；後者以固相法測大分子抗原為主。
RIA在早期建立的農葯免疫分析方法中佔了很大比重，建立了狄氏劑、艾氏劑、2，4－D和2，4，5－T、對硫磷和百草枯等農葯的放射免疫分析法。盡管該方法靈敏度非常敏銳（RIA通常為10-9g、10-12g，甚至10-15g），應用范圍廣，但進行RIA需使用昂貴的計數器，也存在放射線輻射和污染等問題，因此在農葯殘留檢測領域的應用和發展受到了一定的限制，並逐步為其他免疫分析方法所取代。
（2）酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）。EIA是繼RIA之後發展起來的一項免疫分析技術。其檢測原理與放射免疫法類似，但所用的標記物為酶，它將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來，通過測定結合於固相的酶的活力來測定被測定物的量。用做標記物的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）和鹼性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GO）、脲酶（urease）等。酶標記反應的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多數採用96孔酶標板（MTP）作為固相支持物。這種板的檢測容量大，樣本數量多，只需有台簡單的酶標儀就可得出准確的檢測數據。也有學者採用磁珠作為固相材料進行EIA研究，其原理是將高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等）包裹到金屬小顆粒（Fe2O3，Fe3O4）外面，再通過化學方法鍵合上氨基（－NH2）、羧基（－COOH）、羥基（－OH）等活性基團，再與抗體或抗原耦聯，製成免疫性微珠。該方法的優點是微珠比表面積大，吸附能力強，能懸浮在液相中快速均勻的捕獲樣品中的待測物，通過外加磁場後能夠實現微珠與樣品液的快速分離，從而減少檢測時間、提高檢測靈敏度。
由於酶標試劑制備容易、穩定、價廉，酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術，故近年來EIA技術發展很快，已開發了多種EIA方法。其中酶聯免疫法（，ELISA）是目前農葯殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。
（3）熒光免疫分析法（fluorescenceimmunoassay，FIA）。FIA檢測的基本原理是將抗原抗體的高度特異性與熒光的敏感可測性有機地結合，以熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原分子，制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體結合物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時，能夠吸收光能進入激發態。當其從激發態回復基態時，能以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，產生熒光。繪制農葯濃度－熒光強度曲線，可以定性、定量檢測樣品中的農葯殘留量。
適用於抗體、抗原或半抗原分子標記的熒光素須符合要求：①應具有能與蛋白質分子形成穩定共價鍵的化學基團，或易轉變成這類反應形式而不破壞其熒光結構；②標記後，熒光素與抗體或抗原各自的化學結構和性質均不發生改變；③熒光效率高，與蛋白質結合的需要量很少；④熒光素與蛋白質結合的過程簡單、快速，游離的熒光素及其降解產物容易除去；⑤結合物在一般儲存條件下性能穩定，可保存使用較長時間。
（4）化學發光免疫分析法（luminescentimmunoassay，LCIA）。LCIA又可分為化學發光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLCIA）和生物發光免疫測定（bio-luminescentImmunoassay，BLCIA）。
1976年，Shroeder首先用生物素（B）－親和素（A）系統建立了均相化學發光免疫測定技術，爾後Halman和Velan又將其引伸到非均相體系，現已滲入到生物學研究的各個領域。其原理是以發光指示抗原與抗體的結合，當發游標記物與相應的抗體或抗原結合後，底物與酶作用，或與發光劑產生氧化還原反應，或使熒光物質（例如紅熒烯等）激發，釋放光能。最後用光度計測定其發光強度，進行定量分析。常用發游標記物有辣根過氧化物酶（HRP）、魯米諾（luminol）、異魯米諾（isoluminol）、咯粉鹼（lophine）、光澤精（lucigen）、雙（2、4、6－三氯苯）草酸酯、聯苯三酚和6[N-（4－二氨基丁基）－N－乙基]－氨基-2，3－二氫吩嗪-1，4－二酮（ABEI）等。用上述發游標記物標記的抗體（或抗原）在一定的pH緩沖溶液中與相應的抗原（或抗體）結合時，在協同因子（例如H2O2等）的作用下發光，其發光強度與被測物的濃度成正比，故可以用於定量分析。
發光免疫測定具有特異性強、靈敏度高（檢測限量達10-15mol/L）、快速（1～3h）、發光材料易得等優點。但其發光過程和強度常受到發光物質本身的化學結構、介質的pH、協同發光物質和金屬離子雜質等影響。
（5）金免疫層析分析法（goldimmuno-chromatographyassay，GICA）。GICA檢測原理是將配體（抗體或抗原）以線狀包被固化於硝酸纖維素膜等微孔薄膜上，膠體金標記另以配體或其他物質並以干態固定在吸水材料上，通過毛細作用，使樣品溶液在層析條上泳動，當泳動至膠體金標記物處時，如樣品中含有待檢受體，則發生第一步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物繼續泳動至線狀包被區時，發生第二步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物被截留在包被的線狀區，通過標記的膠體金而顯紅色條帶（檢測帶），而游離的標記物則越過檢測帶，與結合的標記物自動分離。通過檢測帶上顏色的有無或色澤深淺來實現定性或定量測定2。
2金標試紙條檢測
GICA法具有快速（5～20min）、廉價、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、攜帶方便等優點。但相對於其他免疫分析方法，該方法檢測靈敏度稍低，主要適合現場快速定性或半定量測定。目前該方法已被應用於醫學和生物學等眾多研究領域，尤其在發達國家已經得到了廣泛的應用。
（6）免疫分析與儀器分析技術的聯用技術。使用單一的IA技術進行農葯殘留分析獲得的信息量少，而理化分析方法的選擇性又比較差。Kramer等人將免疫分析法和液相色譜法（LC）聯合起來使用，從而簡化了分析方法，提高了檢測效率。LC-IA的聯用，將LC的高分離能力和IA的高靈敏性和高特異性融為一體。該分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜（GC/MS）的聯用可減少結構相似的農葯或代謝產物分析中的交叉反應，以降低假陽性。
D. 免疫檢測方法
免疫檢測方法大全2017
免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測，對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究，而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理，簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識，歡迎閱讀。
第一節抗原或抗體的檢測
一、檢測的原理
藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。
1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。
2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。
對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。
(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。
(2)抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔，比較3隻家兔產生抗體的多少，即滴定3隻兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比，濃度高，故應稀釋抗原。
二、抗原或抗體檢測的實用意義
1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。
2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：
(1)各種微生物及其大分子產物：用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。
(2)生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。
(3)人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。
(4)各種半抗原物質：某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用於各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。
三、抗原或抗體檢測的方法
由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：
(一)沉澱反應
可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物，這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。
1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉澱環，故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。
2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注於玻片上，製成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉澱圈，沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易於觀察結果，可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10～20μg/ml，常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果
3.免疫比濁法 當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。
4，雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉澱線，本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測，或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。
5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，於負極側的孔內加入抗原，於正極側的孔內加入抗體，通電後，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。
6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義
7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法，用於AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡)，然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應，最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果
第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;
第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;
第三步：將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;
第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;
第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體
(二)凝集反應
細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(agglutination)。
1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。
2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。
3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小(不如IgM結合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。
(三)補體參與抗原抗體反應
這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。
1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致紅細胞溶解，此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。
2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反應中的補體，引起細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。
3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合，由於濃度低不出現可見反應時，應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應，它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統，由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入指示系統，如出現溶血現象，說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反應陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體，則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。
在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由於本試驗影響因素多，結果不穩定現已被新檢測方法所代替。
四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應
用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。
1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。
(1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞塗片或組織切片上進行染色，經抗原抗體反應後，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在，此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查，也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應的多種標記抗體。
(2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒游標記的第二抗體，觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體
免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光，用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。
2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理，應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。
放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：
(1)液相法：將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間後，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。在反應系統中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後，即可查出待檢標本中胰島素的含量
(2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然後加待檢標本，最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管
放射免疫分析法應用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。
3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物後顯色，以顏色變化判斷試驗結果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性，製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。
(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上)，加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本(可能含有相應抗體)，再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體)，經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
(3)BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。
;