轉染的常用方法

『壹』 幾種細胞轉染技術原理和特點分析

轉染方法的選擇對實驗結果影響很大，不少轉染方法都需對細胞數量，DNA與轉染試劑比例，培養及檢測時間進行優化。傳統的轉染技術，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質體法各有利弊，其主要原理及應用特點見下表：轉染方法原理應用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞穩定轉染 瞬時性轉染不適用於原代細胞 操作簡便但重復性差 有些細胞不適用DEAE-右旋糖苷法帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復合物被細胞內吞瞬時性轉染相對簡便、結果可重復 但對細胞有一定的毒副作用 轉染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入穩定轉染瞬時性轉染所有細胞適用性廣但細胞致死率高，DNA和細胞用量大， 需根據不同細胞類型優化電穿孔實驗條件病毒介導法通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中穩定轉染可用於難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等逆轉錄病毒 特定宿主細胞但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期 需考慮安全因素腺病毒通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中瞬時轉染 特定宿主細胞可用於難轉染的細胞 需考慮安全因素陽離子脂質體法帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞穩定轉染瞬時性轉染所有細胞適用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染時需除血清。轉染效果隨細胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉澱，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放，表達瞬時性轉染可用於：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核穩定轉染 瞬時性轉染轉染細胞數有限 多用於工程改造或轉基因動物的胚胎細胞 除上述傳統方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術，以其適用宿主范圍廣，操作簡便，對細胞毒性小，轉染效率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI) 的轉染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結構不易於進一步改性，且其合成工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每「第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網路在任何pH下都能充當有效的「質子海綿」(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞，其效果好於脂質聚醯胺，經進一步的改性後，其轉染性能好於樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設計更復雜的基因載體時，PEI 經常做為核心組成成分。 線型PEI(Line PEI,LPEI) 與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI(Branched PEI,BPEI) 要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA 轉染復合物的細胞毒性較低，有利於細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利於形成小的轉染復合物，從而提高轉染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發現這種PEI的毒性低，但轉染效率卻較高。 GenEscort 是採用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI 與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯劑交聯，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。

『貳』 細胞轉染的方法

1. DEAE-葡聚糖法。
   

2. 磷酸鈣共沉澱轉染。

3. 電穿孔法。

4. 脂質體法。

5. 病毒介導的感染，病毒感染增強劑。

6. 非脂質體轉染 。
   

『叄』 細胞轉染原理

細胞 轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。

簡介
轉染 ，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬於通過物理方法將基因導入細胞的範例；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉澱法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優勢。但是，病毒轉染方法的准備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。

需要指出的一點，無論採用哪種轉染技術，要獲得最優的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優化。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養條件和細胞生長狀態，到轉染方法的操作細節，都需要考慮。

方法
脂質體轉染法
陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成 DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用於把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前實驗室最方便的轉染方法之一，其轉染率較高，優於磷酸鈣法。由於脂質體對細胞有一定的毒性，所以轉染時間一般不超過24小時。常用細胞類型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。

電穿孔轉染法
電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內，這種方法就是電穿孔。當遇到某些脂質體轉染效率很低或兒乎無法轉入時建議用電穿孔法轉染。一般情況下，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現在針對細胞死亡開發出了一種電轉保護劑，可以大大的降低細胞的死亡率，同時提高電穿孔轉染效率。

病毒感染
對於脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染的細胞系建議用病毒感染，此法可以快速100%感染，檢測成功率高。

『肆』 細胞轉染的常用步驟

1. 轉染試劑的准備
① 將400ul去核酸酶水加入管中，震盪10秒鍾，溶解脂狀物。
② 震盪後將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震盪。
2. 選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質體 體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震盪後在加入合適體積的轉染試劑，再次震盪。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鍾。
4. 吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。
5. 加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。
6. 到時後，根據細胞種類決定是否移除混合液，之後加入完全培養基繼續培養24－48小時。

『伍』 如何選擇不同的轉染方法

市面上的轉染試劑品種很多，商家們還在不斷推出新產品，如此多的選擇難免令人感到無所適從，怎樣才能找到最適合自己的產品呢？轉染試劑的選擇主要取決於細胞類型、細胞種屬和下游實驗。

細胞系不同，它們所需的轉染條件自然也不相同。舉例來說，懸浮培養的鼠類原代細胞，就比貼壁培養的人類細胞更難轉染。此外，神經元和巨噬細胞也令人頗為頭疼，標准方法很難將siRNA轉染進去。

不論是哪種情況，經驗數據都具有無可取代的價值。查閱文獻，與其他研究者多交流都能獲得寶貴的信息。當然，我們也可以在供應商提供的資料中，查看已成功轉染的細胞類型。盡管這些資料中可能並沒有siRNA轉染的專門信息，但了解轉染試劑已經成功轉染了哪些細胞，是很有幫助的。

此外，我們可以向商家索要一點樣品，或者向同事借用一些，對自己的細胞進行試驗。幸運的話，在幾天內就可以鎖定合意的產品。在這里花少許時間，總好過因為實驗結果不理想而要重頭再來吧。

『陸』 體內轉染的原理和操作方法是什麼

EntransterTM-in vivo體內轉染試劑通過納米技術合成，通過物理作用與核酸結合，濃縮包裹核酸，從而保護核酸免受免疫系統破壞，同時增強核酸進入細胞核中表達。不含任何動物來源成分，由於處於納米尺度，粒徑小，不易引起免疫反應，不影響動物和器官組織的功能，可以多次在同一動物注射。

『柒』 轉染的分類

包括：
1.DEAE-葡聚糖法
DEAE-葡聚糖是最早應用哺乳動物細胞轉染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負電的核酸結合後接近細胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉染成功地應用於瞬時表達的研究，但用於穩定轉染卻不是十分可靠。
2.磷酸鈣法
磷酸鈣法是磷酸鈣共沉澱轉染法，因為試劑易取得，價格便宜而被廣泛用於瞬時轉染和穩定轉染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然後加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉澱，最後把含有沉澱的混懸液加到培養的細胞上，通過細胞胞膜的內吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細胞內的核酸酶活性而保護外源DNA免受降解.
3.人工脂質體法。
人工脂質體法採用陽離子脂質體，具有較高的轉染效率，不但可以轉染其他化學方法不易轉染的細胞系，而且還能轉染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質。此外，脂質體體外轉染同時適用於瞬時表達和穩定表達，與以往不同的是脂質體還可以介導DNA和RNA轉入動物和人的體內用於基因治療。LipoFiterTM脂質體轉染試劑()是一種適合於把質粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白復合物轉染到培養的真核細胞中的高效陽離子脂質體轉染試劑。它可以和帶負電荷的核酸結合後形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內吞成為內體進入細胞質，隨後DNA復合物被釋放進入細胞核內，至於DNA是如何穿過核膜的，其機理目前還不十分清楚。 外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法、脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由於電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期准備較復雜、而且可能對於細胞有較大影響；所以現在對於很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多採用脂質體法。
利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對於效率的提高有巨大的作用。 （1）材料
293T細胞、MyoD表達質粒和EGFP表達質粒、DMEM培養基、鏈黴素/青黴素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑（TransFast）
（2）器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計數板、渦旋振盪器、恆溫水浴箱、台式離心機、35mm培養皿、轉染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD 細胞傳代
(1)試驗准備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養皿，離心管。
(2)棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鍾（37。C，5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。
(4)加入1ml的含血清培養基終止反應。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。
(6)將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養液重懸細胞，細胞計數後選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。
(8)將合適體積完全培養液加入離心管中，混勻細胞後輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。
(9)將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染。
細胞轉染
1）轉染試劑的准備
A.將400ul去核酸酶水加入管中，震盪10秒鍾，溶解脂狀物。
B.震盪後將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震盪。
2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震盪後在加入合適體積的轉染試劑，再次震盪。
5）將混合液在室溫放置10—15分鍾。
6)吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。
7）加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。
8）到時後，根據細胞種類決定是否移除混合液，之後加入完全培養基繼續培養24－48小時。
第二次細胞傳代
1） 在轉染後24小時，觀察實驗結果並記錄綠色熒光蛋白表達情況。
2） 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新放入培養皿中。
3） 在正常條件下培養24小時後按照染色要求條件固定。

『捌』 怎樣才是理想的細胞轉染方法

博凌科為解答：理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小、重復性好、安全、簡單等優點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低 的優勢。但是，病毒轉染方法的准備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。