DNA甲基化的常用的轉化方法

❶ DNA甲基化測序方法介紹

內容來自於  生信人社區  歡迎關注。

DNA 甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。

DNA 甲基化及CpG島

DNA 甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一,可能存在於所有高等生物中。DNA 甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發生於胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉變為5'甲基胞嘧啶。這種DNA 修飾方式並沒有改變基因序列，但是它調控了基因的表達。脊椎動物基因的甲基化狀態有三種：持續的低甲基化狀態,如管家基因；去甲基化狀態,如發育階段中的一些基因；高度甲基化狀態,如女性的一條失活的X染色體。

哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現的頻率僅有1%，遠低於基因組中的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區域中，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，形成所謂的CpG島。通常，CpG島大約含有500多個鹼基。在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化，CpG島通常位於基因的啟動子區或是第一個外顯子區。健康人中，CpG島中的CpG位點通常是處於非甲基化狀態，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩定的保留。當腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，以致於染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失。

隨著高通量測序技術（NGS）技術的發展，使我們能夠從全基因組水平來分析5』甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，由此能夠發現很多傳統的基因組學研究所不能發現的東西，這就是所謂的「DNA甲基化測序」！

DNA甲基化測序方法按原理可以分成三大類：

一、重亞硫酸鹽測序；

二、基於限制性內切酶的測序；

三、靶向富集甲基化位點測序；

基於以上原理又有數種不同的測序方法，下面，就介紹10種DNA甲基化測序的常用方法及參考文獻：

1) 重亞硫酸鹽測序

該方法可以從單個鹼基水平分析基因組中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重煙硫酸鹽對基因組DNA進行處理，將未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶。而發生了甲基化的胞嘧啶未發生脫氨基，因而，可以基於此將經重亞硫酸鹽處理的和未處理的測序樣本進行比較來發現甲基化的位點。

【相關文獻】

Shotgun bisulphite sequencing of theArabidopsis genome reveals DNA methylation patterning

Highly integrated single-base resolutionmaps of the epigenome in Arabidopsis

2）重亞硫酸鹽處理後接頭標記技術(PBAT)

為了避免重亞硫酸鹽處理時模板的丟失，通常會在重亞硫酸鹽處理後進行接頭連接和隨機引物的擴增。

【相關文獻】

Amplification-free whole-genome bisulfitesequencing by post-bisulfite adaptor tagging

3）限制性內切酶-重亞硫酸鹽靶向測序(RRBS)

該技術是指對基因組上CpG島或CpG甲基化較密集的區域進行靶向測序。樣本首先經幾種限制酶進行消化處理，然後經重亞硫酸鹽處理，最後再測序。這種方法可以發現單個核苷酸水平的甲基化。

【相關文獻】

Reced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis

4）氧化-重亞硫酸鹽測序(oxBS-Seq)

5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)是5』甲基胞嘧啶脫甲基成胞嘧啶過程的中間產物，重亞硫酸鹽測序無法對二者進行區分。通過氧化-重亞硫酸鹽測序，5』甲基胞嘧啶保留，而5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)被氧化，進而脫氨基成尿嘧啶。通過將經過氧化處理和未處理的樣本進行測序比較，即可從單個鹼基水平分辨5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)和5』甲基胞嘧啶。

【相關文獻】

Quantitative sequencing of 5-formylcytosinein DNA at single-base resolution.

5）TET輔助的重亞硫酸鹽測序(TAB-seq)

TAB-seq採用葡萄糖亞胺與5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)作用來保護免受TET蛋白的氧化。5』甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脫氨基成尿嘧啶，進而可以從單個鹼基水平鑒定5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)。

【相關文獻】

Base-resolution analysis of5-hydroxymethylcytosine in the Mammalian genome

6）甲基化敏感性的限制酶測序(MRE-Seq)

MRE-Seq將甲基化作用的敏感性和限制酶的特異性結合起來進而鑒定CpG島的甲基化狀態。

【相關文獻】

Genome-scale DNA methylation analysis

7）HELP-Seq

HELP-Seq採用HpaII及其甲基化不敏感的限制性內切酶MSPI處理，來對基因組內及基因組間的甲基化位點進行比較，進而實現甲基化測序。

【相關文獻】

Comparative isoschizomer profiling ofcytosine methylation: the HELP assay

8）甲基化DNA免疫共沉澱測序(MeDIP)

MeDIP是一種採用抗體或甲基化DNA結合蛋白來捕獲富集甲基化DNA的技術，這種技術可以發現基因組中高度甲基化的區域，如CpG島，但不能進行單個鹼基水平的分析。

【相關文獻】

Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal andtransformed human cells

9)甲基化結合域捕獲技術(MBD-CAP)

MBD-CAP技術利用甲基化DNA能夠結合蛋白MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI來對甲基化的DNA進行免疫沉澱。與MeDIP技術相似，該技術也是可以發現基因組中高度甲基化的區域，不能從單個鹼基水平分析甲基化。

【相關文獻】

High-resolution mapping of DNAhypermethylation and hypomethylation in lung cancer

10）基於探針的靶向富集技術

甲基化測序靶向富集技術採用合成寡核苷酸探針來捕獲CpG島、基因啟動子區域以及其他一些顯著性甲基化的區域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有這種商品化的試劑盒。

最後，Pacific Biosciences（Pacbio）公司的這項SMRT DNA測序技術採用動力學原理來直接檢測甲基化的胞嘧啶。

其中三代測序技術針對真核中的5mc檢測需要的深度較深，大概要250x,但是利用特殊的試劑會降低其深度。

❷ DNA甲基化的去甲基化

有兩種方式： 1） 被動途徑： 由於核因子N F 粘附甲基化的DNA，使粘附點附近的DNA不能被完全甲基化，從而阻斷DNM T1 的作用； 2） 主動途徑： 是由去甲基酶的作用，將甲基基團移去的過程。在DNA 甲基化阻遏基因表達的過程中，甲基化CpG 粘附蛋白起著重要作用。雖然甲基化DNA 可直接作用於甲基化敏感轉錄因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、N F2KB、Cmyb、Ets，使它們失去結合DNA 的功能從而阻斷轉錄，但是，甲基化CpG 粘附分子可作用於甲基化非敏感轉錄因子（SP1、CTF、YY1）,使它們失活，從而阻斷轉錄。人們已發現5 種帶有恆定的甲基化DNA 結合域（MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3 參與甲基化有關的轉錄阻遏；MBD1 有糖基轉移酶活性，可將T 從錯配鹼基對TöG 中移去，MBD4 基因的突變還與線粒體不穩定的腫瘤發生有關。在MBD2 缺陷的小鼠細胞中，不含M ECP1 復合物，不能有效阻止甲基化基因的表達。這表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的選擇，以及DNA 甲基化與組蛋白去乙醯化、染色質重組相互聯系中的有重要作用。
哺乳動物一生中DNA甲基化水平經歷2次顯著變化，第一次發生在受精卵最初幾次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上幾乎所有從親代遺傳來的甲基化標志；第二次發生在胚胎植入子宮時，一種新的甲基化遍布整個基因組，甲基化酶使DNA重新建立一個新的甲基化模式。細胞內新的甲基化模式一旦建成，即可通過甲基化以「甲基化維持」的形式將新的DNA甲基化傳遞給所有子細胞DNA分子。
程曉東發現DNA甲基化運作機制『轉載』
摘要：埃默里大學醫學院的科學家們發現了哺乳動物真核細胞用於復制甲基化信息的分子機制。科學家們通過X射線衍射晶體分析法對UHRF1蛋白的SRA區域進行結構分析，他們發現在復制酶拷貝DNA序列的時候，這一蛋白起書簽樣的作用。

❸ 易基因｜一文讀懂：十大DNA甲基化研究核心問題

DNA甲基化是最早被發現、也是研究最深入的表觀遺傳調控機制之一，近年來關於DNA甲基化的研究成果屢屢見刊。我翻閱各類文獻，為大家總結了十大DNA甲基化研究核心問題，包括什麼是DNA甲基化，DNA甲基化的主要形式、DNA甲基化與去甲基化、植物中的DNA甲基化、DNA甲基化的主要功能、DNA甲基化作為生物標志物的潛力、DNA甲基化的主要研究方向、DNA甲基化檢測方法、樣本不同如何選擇DNA甲基化檢測技術、DNA甲基化數據挖掘等，讓您一文讀懂DNA甲基化。

1、什麼是DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）為DNA化學修飾的一種形式，是指DNA分子在DNA甲基轉移酶的作用下將甲基選擇性地添加到特定鹼基上的過程。DNA甲基化能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現，是最重要的表觀遺傳調控方式之一。

2、DNA甲基化的主要形式

5-甲基胞嘧啶（5-mC）：最重要的一種DNA甲基化修飾，廣泛存在於植物、動物等真核生物基因組中, 稱譽為「第五鹼基」。

5-羥甲基胞嘧啶世衫臘（5-hmC）：哺乳動物的「第六鹼基」。

N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）：在細菌、藻類及動植物基因組中存在。

7-甲基鳥嘌呤（7-mG）

3、DNA甲基化與去甲基化（5mC）：

DNA甲基化反應分為2種類型：一種是2條鏈均未甲基化的DNA被甲基化，稱為從頭甲基化（denovo methylation）；另一種是雙鏈DNA的其中一條鏈已存在甲基化，另一條未甲基化的鏈被甲基化，這種類型稱為保留甲基化（maintenance methylation）。

甲基化的DNA可以發生去甲基化。DNA的去甲基化由基因內部的片段及與其結合的因子所調控，包括：

主動去甲基化(Active demethyaltion)：哺乳動物TET酶主動去甲基化，5mC經過TET作用轉化成5hmC。

被動物甲基化(Passive demethylation)：DNA通過不斷復制丟失/稀釋甲基化。

4、植物中的DNA甲基化

對於植物而言，面對生長環境塌頌的改變，表觀遺傳的變異會改變植物DNA的構象，從而改變染色質和蛋白質的結構，達到調節基因組的作用。研究發現，當植物面臨生物脅迫和非生物脅迫時，植物基因組中DNA甲基化會發生改變，並且這些改變會遺傳給後代。所以DNA甲基化的改變能夠豐富植物物種的多樣性，加強植物的環境適應性。

不同於哺乳動物基因組只有CG甲基化，植物基因組甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的鹼基）甲基化。而維持這三種不同的DNA甲基化的分子機制非常復雜。

5、DNA甲基化的主要功能

DNA甲基化能引起染色體結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式改變，從而控制基因的表達。

保持基因組遺傳物質的穩定性（TE的高甲基化）

調控基因的表達（順式作用元件的動態甲基化，如Promoter/Enhancer等）

DNA甲基化參與基因轉錄調控、細胞分化、胚胎發育、X染色體失活、基因印記和腫瘤的發生等過程。

6、DNA甲基化作為生物標志物的潛力

相比基因組，DNA甲基化能夠反應環境的影響

DNA甲基化不像基因組那麼一成不變，也不像轉錄組和蛋白組那麼搜滑不穩定。

DNA甲基化處於動態變化中，能夠像年輪一樣記錄環境因素的影響。

DNA甲基化標志物是最有應用前景的表觀遺傳標志物 。

7、DNA甲基化的主要研究方向

8、DNA甲基化檢測方法

目前研究中常用的DNA甲基化測序方法包括全基因組（WGBS、oxWGBS等）、簡化基因組（dRRBS、RRBS、XRBS等）、靶向基因組（液相捕獲）、靶向基因（TBS）和850K晶元等，適用於多種不同應用場景。

WGBS和RRBS用於基因組范圍內研究探索，並篩選目標基因（候選DNA甲基化標記物）

TBS用於後續目標基因的甲基化驗證

9、樣本不同，如何選擇DNA甲基化檢測技術

易基因結合十餘年DNA甲基化研究經驗，全面總結了不同樣本類型對於不同DNA甲基化檢測工具選擇的不同，技術推薦標准可以分為三點：

最有力方案（金標准）：WGBS/微量WGBS/scWGBS 

最具性價比方案：RRBS/dRRBS/XRBS（動物）

大規模臨床轉化/目標區域甲基化驗證：TBS 

10、DNA甲基化數據挖掘

DNA甲基化一般遵循三個步驟進行數據挖掘。首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。最後，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網路關聯等。

❹ 如何進行DNA甲基化分析

DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發生於胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5』-端的胞嘧啶轉變為5』-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現對基因表達的調控。脊椎動物DNA的甲基化狀態與生長發育調控密切相關，比如在腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，導致抑癌基因表達的下降。
1、甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理後甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
2、亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨後設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，最後對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產物克隆至載體後進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3、高解析度熔解曲線法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾後的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理後，未甲基化的胞嘧啶經PCR擴增後轉變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發生改變，從而導致熔解溫度的變化（圖1）。
其中，樣品要求：細胞（≥106 個）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等樣品材料，基因組DNA（體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl）。