食用菌種分離方法圖解

1. 採用組織分離法培育菌種要經過哪些步驟

菌棒分離法，包括耳（菇）木分離法和代料基質分離法，通常稱之為「基內菌絲分離法」。菌棒分離法是獲得膠質菌的常用方法。菌棒分離法的主要步驟如下：

（1）耳木分離法

耳木的採集，必須在木耳、銀耳出耳盛期，在已經長過子實體的耳木上，選擇菌絲生長旺盛，周圍無雜菌的部分，用鋸截取一小段，先把耳木表面的雜物洗凈，然後風干或充分晾乾，使耳木乾燥。在分離之前，先把耳木通過酒精燈火焰，重復燎過多次，燒去表面的雜菌孢子，再用75%酒精表面消毒。組織塊必須從耳木中菌絲蔓延生長的部位選取，用無菌解剖刀挑取一小塊耳木組織，接入PDA培養基上，挑取的組織塊越小越好，可減少雜菌污染，提高分離成功率。培養基高壓滅菌後加入廣譜抗菌素（每毫升培養基加鏈黴素或青黴素50～100單位），抑制細菌生長。認真檢查組織分離獲得的菌絲體，淘汰雜菌。挑取菌落邊緣菌絲，接種到新的培養基上，獲得純培養。

（2）代料基質分離法

選擇子實體發生早、產量高、無病蟲害的栽培瓶或栽培袋，待子實體長至八成熟時，從中篩選出最佳的一瓶（或袋），去掉子實體，然後用75%的酒精消毒整個栽培瓶（或袋），同時將接種工具和待接培養料一起放入接種箱內，用甲醛熏蒸消毒。分離時，去掉料面老菌絲，用接種針挑取小塊長有菌絲的培養料，接入試管內，適宜溫度下培養。選取菌絲生長良好的試管轉管純化。

2. 食用菌制種技術的分離與培養

食用菌菌種分離方法有四種，即組織分離法、孢子分離法、耳木分離法和土中菌絲分離法。
（一）組織分離法
組織分離法是利用子實體內部組織來獲得純菌種的方法，根據不同的分離材料大體可分為三種。
1、子實體組織分離
①、種菇的選擇 從優良的品系中選取優良的個體作種菇，以單生菇、菇形圓整、無病蟲害菇作分離材料。
②分離 把種菇帶入接種箱內，用75%酒精表面消毒，用解剖刀在菌柄中部縱切一刀，然後撕開，挑取菌蓋與菌柄交界處的一小塊組織，接種到PDA培養基上，數天後就可看到組織塊及培養基上有白色菌絲，即表明分離成功。
2、菌核組織分離 茯苓、豬苓、雷丸等葯用菌，常利用菌核分離得到菌種。分離方法是將菌核表面消毒後，用解剖刀切開，取中間組織1小塊，接入PDA培養基上，20℃—25℃培養。
3、菌索分離 密環菌，假密環菌常用菌索來分離。方法是將菌索表面消毒後，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用無菌剪刀剪成小段。移接在PDA培養基上，20℃—25℃培養，有白色菌絲長出且無污染，即表明分離成功。
（二）孢子分離法
孢子分離法是利用菌類的成熟孢子能自動彈射的原理，在無菌操作條件下，使孢子在適宜的培養基上萌發長成菌絲體而獲得菌種。
1、種菇的選擇 孢子分離用的形態不同，孢子分離的方法也不同。
①整菇插種法：是將整隻成熟度適當的種菇，經表面消毒後，插入孢子採集器內，放在適當的溫度下，讓其彈射孢子的方法。蘑菇、香菇、草菇等食用菌常用此法採集孢子。
②鉤懸法：將新鮮的成熟度適當的耳片用無菌水沖洗後懸掛在無菌的三角瓶內或有孔鍾罩內，在一定溫度下讓其彈射孢子。木耳、銀耳常用此法採收孢子。
（三）、耳木（菇木）分離法
耳木（菇木）分離法是利用耳木或菇木中的菌絲體得到菌種的方法。
1、耳木的採集與選擇 一般在該菌的生長季節里，選取生長的子實體大、肉質厚、成熟度適當、無雜菌感染的耳木或菇木進行分離。
2、分離方法 在所選耳棒長有子實體的部位，橫斷面鋸下鋸成1cm厚薄的木片，帶入已經消毒的接種箱（或接種室）內。將上述木片浸入0.1%升汞溶液中30s—60s，用無菌水沖洗數次，以沖去殘留的升汞液，放在無菌紗布上吸干水分，多面手用滅過菌的榔頭，解剖刀切去樹皮部分，把木片劈成小塊，隨後用鑷子將小木塊放入PDA培養基上，每管放一塊，放適宜溫度下培養。
（四）土中菌絲分離法
它是利用菌類地下的菌絲體來分離得到菌種的一種方法。主要用於腐殖質腐生菌的分離，用前述三種方法能分離得到菌種，一般不採用這一方法。但在野外採集時，菇類子實體已腐爛，而又十分需要該菌種時，就要用此法分離。具體操作如下：
①取菇體下與菇根相連的菌絲體，盡可能取較清潔的菌絲束。
②由於土壤中含有各種微生物，如細菌、放線菌、黴菌等，因此分離時要用無菌水反復沖洗菌絲束，把附著的泥土等雜物沖洗干凈，把無菌棉花或紗布吸干水分。
③取菌絲束尖端部分，接入有細菌抑制劑的培養基中，25℃左右培養，無雜菌污染即分離成功。
④菌絲的鑒定。在土中獲得的菌絲，其可靠性較小，必須經過出菇鑒定，才能確認是該菌的菌種。 接種後的原種或栽培種全部拿出培養箱或培養室，根據不同食用菌菌絲發育最適溫 度進行培養。培養2～3天後，菌絲開始生長時，要每天定期檢查，如發現黃、綠、橘紅、黑色雜菌時，要及時揀出清理。尤其是塑料袋菌種，檢查工作到菌絲長滿為止。培養室切忌陽光直射，但也不要完全黑暗；注意通風換氣，室內保持清潔，空氣相對濕度不要超過65%；同時菌種瓶、袋不要堆疊過高，瓶間要有空隙，以防溫度過高造成菌絲衰老，生活力降低。特別是對加溫的培養室要注意：一要保持室內溫度的穩定，因在溫差較大的情況(特別是母種培養)會形成冷凝水，而使菌絲倒伏變黃。有條件的話，可根據菇類的菌絲生長對溫度的要求，按品種分開放在不同溫度的培養室(箱)內培養。同時要注意經常調換原種、栽培種排放的位置以使同一批菌種菌絲生長一致。二要注意通風換氣，以免室內二氧化碳濃度過高而影響菌絲生長。

3. 平菇組織分離的方法和步驟如下

平菇母種沒長滿能用，平菇母種繁殖技術。一、平菇組織分離技術組織分離是采菇體的部分組織進行繁殖母種的方法。盡管平菇的任何部分都能分離培養出母種，但是多年的實踐經驗表明，選用菌柄和菌褶交接處的菌肉最好。平菇組織分離的方法和步驟如下： 1、種菇選擇：一般選擇在適宜出菇期出菇早、出菇整齊、特徵典型、無病蟲害、產量高的栽培袋，從中選擇菌肉肥厚、大小適中、顏色正常、尚未散孢、長至七八分成熟的優質菇作種菇。 2、種菇消毒：用0.1%升汞溶液或75%酒精浸泡或擦拭，無菌水沖洗，吸干表面的水分。 3、切塊接種：將分離種菇沿菌柄中心縱向掰成兩半，用解剖刀在菌蓋和菌柄交界處劃成田字形，取黃豆粒大一小塊菌肉組織，接在PDA培養基上。 4、培養純化：溫度控制在22℃~25℃之間，培養1~2天，長出白色絨毛狀菌絲體，4~5天通過篩選，挑出菌絲潔白、清晰、生長整齊、健壯的試管母種繼續培養，將有雜菌、長勢纖弱的淘汰。7~10天菌絲長滿斜面。 二、平菇孢子簡易分離法筆者將多孢子分離與組織分離有機結台，使退化品種的優良特性得以恢復。現簡升如下，以供同行參考。制備培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，VB1微量，瓊脂18g，水1000mL，pH值自然。按常規方法制試管斜面。選擇種菇選取生長健壯，八成熟，無病蟲害的平菇一朵，用鋒利小刀在其上切取菇形美觀的菇肉組織一片待用。收集孢於及培養純化在無菌條件下，撥出斜面試管口的棉塞，用試管口從菇種菌褶處頂穿菇種片，使一小片菇種陷入管口以內，迅速塞好棉塞。於24－26℃條件下恆溫培養6小時後取出。在酒精燈火焰附近去掉棉塞，用消毒小鉤鉤出管內的小片菇種，將棉塞連同試管口在火焰上灼燒後，迅速塞上棉塞，於24～26℃恆溫培養1周，待孢子萌發，井長成成片菌絲後，切取生長迅速、無雜菌污染的菌絲團轉管。待菌絲長滿管後備用。組織分離將孢子分離所得試管菌種，按常規方法接入棉子殼培養基的原種瓶中(750mL)，待菌絲長滿瓶後自然出菇。選取菇體健壯、菇形正常，無病蟲害的菇體組織分離後得純菌種，經栽培出菇試驗後便可用於生產。三、平菇菌種的復壯－組織分離使用組織分離復壯平菇菌種，簡便易行、效果明顯，很適宜一般種植戶。其操作技術要點是： 1.在菇床、菌牆或菌袋中選擇出菇早、無雜菌病毒侵染、株型緊湊、圓整肉厚、色澤美觀、七八成熟的第一潮菇的肥壯菇體作種菇； 2.在種菇中部取最大的3-4張菇片，用70%的酒精輕擦表面後置於接種箱內消毒； 3.將菇片縱向撕開，在菇蓋與菇柄交界處取一米粒大小的菇肉組織接於PDA培養基上。每隻菇片可接數支試管，每次應多分離幾支試管，方便選優； 4.將試管置於適溫下培養； 5.培養期間每天都要檢查發菌情況，從中選擇菌絲濃白粗壯、邊緣整齊、長速正常、無綠、黃及漿糊狀等雜菌斑點的，表現最好的分離種轉接於木屑麩皮培養基上，於適溫下培養； 6.菌絲發滿後，在接種箱內去掉棉塞，用蠟封口，用黑膜包裹後於4-9℃的冰箱內保藏； 7.在下一個生產季節與原始保藏種作對比試驗，擇優作為生產用種。每季都如此復壯，能逐步提高菌種各方面的性狀，使發菌加快，抗逆抗雜性增強，質量明顯提高。 8.有條件的可以先採用孢子分離法進行分離培養，並栽培出菇，然後從中選擇較好的菇體（種菇選擇標准同上），再採用上述方法進行組織分離，其復壯效果更好。注意：孢子分離的母種不能直接應用到生產中。

4. 求細菌分離純化的詳細方法

平板劃線分離，在平板培養出單個細菌菌落後可以做鏡檢觀察。

稀釋倒平板法：先把微生物懸液作一系列的稀釋，分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻後傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固後，製成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時間即可出現菌落。

如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨後挑取該單個菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養。

培養基與菌種分離

培養基與菌種分離是從含有多種微生物的樣品中獲得純種微生物的操作技術。菌種分離主要在培養皿上進行，常用的方法是稀釋法和劃線法。使用這兩種方法的目的是是微生物的一個個體通過繁殖，在固體培養基上長出肉眼能見的群體，根據培養特徵，用接種針調取所需菌種並在顯微鏡下檢查，證明為單一形狀的菌體。常用的培養基是選擇培養基。

如分離分解纖維素的微生物用的培養基是以纖維素為碳源的培養基，因為從這種培養基上長出來的只能是分解纖維素的微生物。

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