電生理學常用實驗方法

『壹』 注意研究有哪些方法拜託各位大神

注意實驗的研究方法有很多種，主要的有 提示範式、搜索範式、過濾范數碼漏式、雙任務範式以及電生理學的研究方法。提示範式（Cuing Paradigms）的基本原理是：用刺激或指導語來引導被試注意一個明確的輸入源，然後把對這一輸入源的加工和對其他輸入源的加工作比較。搜索範式的基本原理是：要求被試尋找一個或多個混雜在非目標刺激中的目標刺激，實驗時這些刺激可以同時呈現，也可以相繼呈現。過濾範式（Filtering Paradigms）的基本原理是：使被試的注意指向一個信息源，而實驗者評估的則是那些未被注意的信息的加工過程，以此模扮來研究注意的某些特徵。過濾範式下有不同的變形：整體－局部範式，雙側範式和負啟動範式。雙任務範式則關心注意是如何在多個並行任務間起到指向和調節作用的。注意的電生理學研究方法主要有腦電圖技術和事件相關電位技術。由於腦電圖技術只是在完全清醒條件下對人的注意進行生理分析，而未真正涉及注意的本質，所以薯爛現在注意的電生理研究更多使用事件相關電位技術。

『貳』 電生理技術的測量技術

電生理測量技術包括生物電測量技術和生物體電特性測量技術等方面。 生物電測量技術用電極將微弱的生物電引出，經生物電放大器將它放大，再經示波器等顯示其波形並記錄下來，以便觀察、分析和保存。
①電極：引導生物電的電極分大電極和微電極兩類。大電極通常可以是金屬絲，也可以是面積為幾平方厘米的金屬片（銀、不銹鋼等）。把大電極放在待測部位即能記錄到該處存在的生物電。它記錄到的是許多細胞（例如一個器官）的電活動綜合而成的生物電。例如把大電極放在胸前心臟附近，就能記錄到心臟跳動時發生的電活動——心電，分析心電能幫助了解心臟的功能狀況。用同樣方法可記錄到腦電、肌電等多種器官和組織的電活動，這些對於診斷疾病都有重要價值。現在已被廣泛地應用於醫學、獸醫學和畜牧業等方面。微電極的尖端直徑小於1微米，也可大至幾微米（玻璃管、金屬絲）。用微電極可在細胞水平上對生物電現象進行觀測和研究。將微電極插到細胞的附近，甚至插入細胞體內，就能記錄到少數幾個以至單個細胞的電活動。還可把細胞染料通過微電極注入細胞內使之染色，便於用顯微鏡觀察細胞的形態，研究形態和功能之間的關系。
②生物電放大器：細胞發生的生物電的能量很低，必須用放大器放大才能觀測。大電極用的生物電放大器應該雜訊低、漂移小，具有很強的抑制外界和生物體內電干擾的能力。玻璃微電極的尖端由於電阻很高（在5～100兆歐之間），而引起訊號衰減，高頻失真等。所以微電極放大器需具有極高的輸入電阻和減小輸入電容的補償電路，使生物電能保真地放大。微電路插入細胞體內記錄時，對放大器的柵流須有嚴格的限制（如應小於10^-11安），以防止柵流對細胞興奮性的影響。
③顯示和記錄：常用的有磁帶記錄儀、筆寫記錄器、XY記錄儀和示波器。磁帶記錄儀記錄實驗過程中的生物電、生理指標變化等全部信息，實驗後再作進一步的分析處理。由於有些生物電具有甚低頻甚至直流成分，需採用調制技術才能將它們記錄在磁帶上。通常把變化不太快的生物電（如心電、腦電等）直接用筆寫記錄器描記下來，使用方便，能當場獲得記錄。由於採用新技術，筆寫記錄儀的頻率響應已擴展到2000赫以上，一些較快的生物電也能被直接描記。XY記錄儀的記錄筆可沿X軸和Y軸兩個方向運動，兩軸分別表示不同的參數。對於變化很快的生物電（如神經細胞的峰形放電等）從前常用示波器來觀察，它頻率響應高，觀察方便。但記錄時，因需用示波器照相機拍攝熒光屏上的波形，使用不大方便。現在多採用模擬數字轉換器將信號轉換為數字信號，利用軟體顯示並保存到電腦中。
④遙測技術：記錄自由活動、劇烈運動或在遙遠的空間的人或實驗動物的生物電的方法。通常是將訊號放大、調制後用無線電波發射。在記錄處接收無線電波後，經放大、解調，恢復為原來的生物電再予顯示和記錄。遙測的距離從幾米到幾千千米以上（如從宇宙飛船到地面）。生物電遙測系統是多種多樣的，有的要求體積小、重量輕、便於攜帶，有的要求能越過很大的距離，有的要求能遙測多路訊號等。 信號分析：把生理信號分解成組成它的各有關成分。用得較多的是富里哀分析，可把信號分解成它的基波和各次諧波的組合；又如把記錄到的多個運動單位的復合動作電位分解成各運動單位的動作電位。
信號的提取：把淹沒在雜訊中的微弱生理訊號，用計算機處理提取出來。「平均」是一種常用的方法，把N次刺激引起的反應訊號進行平均，能提高信噪比根號N倍。
信號的識別：對於長時間中偶爾出現的現象的觀測，用計算機長時間不斷監視訊號，發現規定的偶發現象，把它的波形和發生的時間記錄下來，供研究用。
信號的判別：從記錄到的生理訊號來判斷生物體屬於什麼狀態。如從心電向量圖的分析來診斷心臟疾患。 通過對從體表許多電極記錄到的波形的分析，推測出體內生物電訊號源的位置及其隨時間變化的情況。如從人體表面的100路心電記錄來推算出心臟電偶極子、電多極子的位置及其運動的軌跡。

『叄』 記錄神經元活性的電生理方法-1： 神經元放電特性及電生理平台組成

參考文獻：
《Guide to Research Techniques in Neuroscience》
《The Axon Guide: A guide to Electrophysiology and Biophysics Laboratory Techniques》

視頻：
膜片鉗電生理技術_嗶哩嗶哩

網站：
膜片鉗技術|電生理學|電生理學工具-Molecular Devices官網
膜片鉗電生理技術 - JoVE

主要是根據電極插入檢測樣本神經元細胞的位置來劃分：

膜片鉗有不同的鉗制方式，如：

根據需求，不同的電生理記錄方法可以寬森跡分別用於記錄 體內 和 體外 的神經元細胞的電特性 ( the electrical properties )。(後面將哪種情況下用哪種合適)。

我們首先得知道，電生理研究的是什麼？
研究神經元的電生理活動，就研究 不同刺激下 神經元的放電性質(頻率，強弱，時長等)，所以我們必須先了解神經元的電特性。

細節這里不講(另一篇再整理)，這里有幾點需要知道的：

工欲善其事，必先慎並利其器
知道了我們想幹嘛，我們先看看春碧看記錄神經元電生理活動的設備

The Patch-Clamp Rig

我們先從源頭開始講，那當然是微電極 Microelectrode, ME

These metal electrodes not only provide more stable isolation of single units than micropipettes, but they tend to sample from a larger morphological variety of cells and also help in better localization of electrode tracks to identify where recordings took place in whole brains.

Smaller tips have higher resistances, and they restrict the area from which potentials can be recorded, thus permitting the isolation of the activity of either a fiber or a cell. Large tips and low resistances pick up the activity from a number of neurons and are of limited use in efforts to identify the functional properties of single cells.

Tips with very high resistances are also of little use, as they cannot record neural activity unless they are very close to the cell membrane or actually inside a cell.

The headstage is the central hub that connects the electronic equipment to the tissue preparation. It contains an electrode holder that stabilizes the microelectrode ring recordings and also directly connects the microelectrode to the first stage of amplifier electronics needed to detect the electrical signals. The headstage passes the signal to the main amplifier for the main signal processing. The headstage is carefully positioned by the micromanipulator and is also attached to the microdrive.

Accurately placing a patch electrode onto a 10-20 μm cell requires an optical system that can magnify up to 300- or 400- fold with contrast enhancement (e.g. Nomarski/DIC ( 微分干涉相差顯微鏡 ), Phase, or Hoffman) and a micromanipulator that stably positions the electrode in 3D space. An inverted microscope(倒置顯微鏡) is preferable because it allows easier access for electrodes from above the preparation and also provides a larger, more solid platform to bolt the micromanipulator. (更好地為微電極騰出操作的空間) A micromanipulator has the ability to move the electrode in very minute distances along the X, Y, and Z axes. The micromanipulator can then hold that position indefinitely.

A microdrive is used to lower or raise the microelectrode to a specific depth in tissue in very fine steps. It is usually preferable to use remote-controlled microdrive systems to eliminate hand vibration. Thus, the headstage (and consequently the electrode) can be set into place by hand using the micromanipulator and then finely adjusted in and out of tissue using a microdrive for the final approach to the cell.

An instrument that contains the circuitry required to measure electrical currents passing through ion channels or changes in cell membrane potential. The amplifier contains the circuitry necessary to measure current passing through the cell membrane both in magnitude and direction. The amplifier can also measure the cell membrane potential in response to the movement of current.

To initiate current movement, the experimenter can deliver a voltage command (鉗制電壓) to the cell, and the cell will respond by passing the current necessary to maintain that voltage command. (電壓鉗，用於測過膜電流。) Conversely, the experimenter may also inject current and then measure the change in membrane potential resulting from that change in current. (電流鉗，注入衡定電流測膜電位變化，模擬生理狀態下離子流動觸發動作電位)

*The current acquired by the amplifier is an analog signal, but in order to perform data analysis needed for high resolution patch-clamp measurements, the analog signal must be converted into a digital one. *

然後既然提到了 帶寬 和 采樣頻率 ，就來說說為什麼這兩者會影響采樣的質量。首先要弄清楚一點， 帶寬 是也是表示頻率，單位是 Hz，帶寬代表的是 數據本身的頻率 ，而 采樣頻率 指的是 從數據中抽樣的頻率 。如下圖，左邊是 原始數據的頻率 ，右邊是 采樣數據的頻率 。很明顯可以看出，采樣頻率越高，數據還原度越高。

然而，帶寬只是代表，而並不等於 數據本身的頻率 ，因為模擬信號存在著衰減的情況。先來看看從microelectrode 到 Digitizer 的結構。

模擬信號輸入路徑(Analog-Input-Path)

The analog input path attenuates, amplifies, filters, and/or couples the signal to optimize it in preparation for digitization by the ADC. The ADC samples the conditioned waveform and converts the analog input signal to digital values that represent the analog input waveform. The frequency response of the input path causes an inherent loss of amplitude and phase information.

帶寬Bandwidth
It is defined as the frequency at which a sinusoidal input signal is attenuated to 70.7 percent of its original amplitude, which is also known as the -3 dB point. It is defined as the frequency at which a sinusoidal input signal is attenuated to 70.7 percent of its original amplitude, which is also known as the -3 dB point.

Bandwidth describes the analog front end』s ability to get a signal from the outside world to the ADC (analog-to-digital converter) with minimal amplitude loss—from the tip of the probe or test fixture to the input of the ADC. In other words, the bandwidth describes the range of frequencies an oscilloscope can accurately measure.

(不知道這一塊有沒有講清楚，到這里電信號是如何產生，以及如何採集已經基本講完了，後面就是數據的可視化，屏蔽環境噪音等)

Oscilloscope & Loudspeaker System & Computer & Software

An oscilloscope receives the electrical signal from the amplifier and displays the membrane voltage over time. This is the major source of data output in electrophysiology experiments. They can also be heard by connecting the output of the amplifier to a loudspeaker. Action potentials make a distinctive popping sound, so recording the activity of an active neuron can sound like popcorn popping. Loudspeakers can be helpful when trying to locate a neuron of interest, because different types of neurons have distinctive firing patterns.

Computers have greatly aided electrophysiological studies by automating stimulus delivery and electrical signal recording. Computers can easily manipulate many parameters ring recordings, such as the recording thresholds and stimulus delivery timing. Computers also allow simple real-time data analysis, displaying the results of an experiment, even while the experiment is occurring.

這一篇主要講了：
1. 主要的電生理技術
2. 神經元電特性
3. 電生理實驗的設備

還沒講的有(放到後面吧，看那麼多大家也累了)：
1. 什麼是電流鉗？什麼是電壓鉗？
2. 實現的電路原理 (現在只是簡單介紹了一些信號採集的過程)
3. 信號處理 (最原始數據是怎麼變成我們拿到手的數據的，這部分我可能能力不足先跳過)
4. 胞外記錄，胞內記錄，膜片鉗的應用
5. 文章中的電生理圖怎麼看？figure (其實就是拿到手的 data 怎麼加工變成文章展示出來的 data)
6. 其他拓展應用，如果結合光遺傳