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常用的免疫熒光染色方法

發布時間:2023-07-26 15:44:46

① 免疫熒光的方法有什麼注意環節

② 常用的細胞染色方法有哪些

常用的細胞染色方法有:

1、簡單染色法,常用鹼性染料如美藍等進行簡單染色;

2、革蘭氏染色法,主要包括結晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脫色以及番紅復染四個過程;

3、瑞氏染色法,瑞氏染料溶劑主要是由伊紅美藍組成;

4、吉姆薩染色法,吉姆薩染色原理與結果和瑞特染色法基本相同;

5、細胞免疫熒光染色法,免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合。

染色是生物顯微玻片標本製作中最重要的環節之一。先把破壞細胞膜的選擇透過性,再使用染色劑,將生物組織浸入染色劑內,使組織細胞的某一部分染上與其他部分不同的顏色或深度不同的顏色,產生不同的折射率,以便觀察。

另外,銀染法也較常用。當組織塊浸入硝酸銀溶液中時,有的組織結構能直接把硝酸銀還原,使銀粒附於其上,呈棕黑色或棕黃色。有些結構本身對硝酸銀無直接還原能力,若加入還原劑,可使硝酸銀還原沉澱顯色。


(2)常用的免疫熒光染色方法擴展閱讀:

染色細胞固定有物理法與化學法,物理法為乾燥和火焰固定,化學法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。

1、偶氮偶聯法:利用人工合成的酶底物,在酶作用下,產生分解產物,再與重氮鹽結合引起偶氮偶聯,使其形成不溶性的偶氮色素,以此證明酶的存在。

2、聯苯胺法:粒細胞和單核細胞中的過氧化物酶作用於過氧化氫,釋放新生態氧,使無色的聯苯胺形成藍色沉澱。

3、普魯士藍法:細胞內、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用,形成藍色亞鐵氰化鐵沉澱。

4、雪夫反應:過碘酸氧化細胞內糖類中乙二醇基形成乙醛基,醛基與雪夫試劑作用,使無色品紅形成紅色沉澱。

5、金屬沉著法:其他尚有物理學方法,如脂溶性染料染色(顯示脂質)、熒光顯示、放射自顯影以及體外活體染色亦常用於臨床血液細胞學診斷。

③ 急求間接免疫熒光雙染實驗步驟

FITC:

操作步驟

將純化的IgG抗體對PH9~9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜,
透析後抗體液移入小燒杯中



稱取適量IFTC,加入二甲亞碸(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO)
使終濃度為1mgFITC/1mlDMSO
FITC/IgG比例:如IgG濃度為1mg/ml,FITC/IgG比例約為50μgFITC/mgIgG;
如IgG為5~10mg/ml,則比例為25μgFITC/ml IgG
在10ml小燒杯中先放入抗體



按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析後的抗體溶液中



將標記物用PBS加至2.5ml,磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h



用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游離熒光素,先用25ml PBS淋洗G25柱



收集PBS洗脫第一個熒光素結合蛋白峰,測定F/P
比值。第二個熒光素峰為游離熒光素

計算:

2.87×A495
F/P=————————
A280-0.35×A495

合適的F/P值為2~4。


注意事項:
1.FITC保存於4℃暗處,使用前待試劑瓶升至室溫時開蓋稱取,以避免潮解。
2.FITC-DMSO液要臨用時配製。
3.碳酸鹽緩沖液要新鮮配製。

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