細胞常用實驗方法

① 細胞活力測定常用的簡便方法

又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤葯物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點:由於MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶於水，需被溶解後才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的准確性產生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。

② 細胞活力測定常用的簡便方法是

MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤葯物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由於MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶於水，需被溶解後才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的准確性產生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。
細胞活力常用百分比表示，活力的大小對試驗結果有很大影響。細胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是台盼藍（trypanblue）染色法。台盼藍又稱錐藍，是一種陰離子型染料，這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內，使死細胞著色呈藍色。

③ 細胞培養的具體步驟和要求以及注意事項

一、細胞復甦

將凍存細胞從液氮中取出後，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10ml DMEM培養基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養基，輕輕吹打，接種於10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時．去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1ml DMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經高壓滅菌，保存於40C），吹勻，吸取10微升進行計數，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%～90%時，去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

凍存液的配製：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

注意事項

（1）進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經捲起或者白大褂的袖口已經扎緊。

③確定酒精燈內的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）後在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（2）細胞污染的預防

①實驗用品防止污染。細胞培養所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌要仔細，並在無菌實驗檢測陰性後才能使用。操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂後才能進入細胞間。

④實驗開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全櫃之外的物品，必須及時對手套進行消毒。

⑤進入細胞培養間後關好門，坐下來盡量少走動以免影響生物安全櫃的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大規模污染。

⑥細胞操作時動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，並將瓶口放在火焰周圍簡單轉動燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實驗操作時生物安全櫃的隔板要盡可能放低，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區，以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應當倒放在遠離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。

⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發現接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（3）防止細胞交叉污染

①在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，最好作上標記便於辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發生t昆亂。

②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養基中污染其他細胞。

③所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，必須及時保種凍存，一旦發生污染可重新復甦細胞，繼續培養。

(3)細胞常用實驗方法擴展閱讀：

細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸鹼度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖並維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。

不論對於整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。

細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以藉此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

④ 細胞培養一般方法有哪些

細胞培養首先分為原代培養和傳代培養.
一、原代培養需要從組織中消化、分離、純化出單細胞,然後繼續進行傳代、凍存；
二、傳代培養首先進行細胞復甦:
1.應遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調至37-38度,取出凍存的細胞迅速放入後交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化.
2.在無菌台內將完全培養基加入培養瓶內,然後用無菌吸管從凍存管內取出細胞,置培養瓶內輕輕搖晃,使細胞均勻後置培養箱內培養,24h後換液；也可復甦當時離心（1000rpm 5min左右）後,完全培養基重懸培養,適時換液.
細胞傳代:
1.貼壁細胞:
對於貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基,吸的越干凈越好,以免中和後加入的消化液,使強度減弱.PBS清洗2-3次,去除血清和死細胞,50ml培養瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進行消化,(根據配製強度經驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養箱約2分鍾,鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落後,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml完全培養基後,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然後收集離心（1000rpm 5min左右）,新鮮培養基重懸沉澱,加入完全培養基後繼續培養或實驗.
2.懸浮細胞:
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶內,加入完全培養基繼續培養,如要高濃度或需更換新培養基,可先離心（1000rpm,5min左右）後加入完全培養基,輕輕吹勻後,分置其它培養瓶內加入完全培養基繼續培養.

⑤ 體外培養細胞的實驗觀察方有哪些法

體外培養細胞的實驗觀察方法有：

相差顯微鏡直接觀察法，為了觀察細胞的結構，則需要通過其他途徑提高結構的反差。

暗視野顯微鏡觀察細胞，暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器，在黑暗的背景中呈現明亮的像。

縮時顯微鏡攝影觀察，縮時顯微鏡攝影術可直接記錄細胞的連續動態變化過程。

離體活細胞染色觀察等

⑥ 細胞生物學實驗中常用來固定細胞或細胞器的方法有哪些

細胞固定化方法有：Adsorption（吸附）；covalent bonding（共價結合）；Cross linking（交聯）；Entrapment（包埋）、Encapsulation（微膠囊） 。下面對這幾種做具體介紹。
一、吸附法
1，原理
利用載體和細胞表面所帶電荷的靜電引力（van der Walls forces），使細胞吸附於載體上。吸附法可分為物理吸附和離子吸附兩種。該法操作簡單，固定化過程對細胞活性影響小。
2，載體的材料
採用吸附法固定細胞，所用的載體主要有：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、
多孔陶瓷、離子交換樹脂和等。塑料
3，影響吸附固定化的因素
（1）Z-電位
（2）細胞的性質和細胞壁的組成
（3）載體的性質
（4）pH
二、共價結合法
利用細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無機或有機載體反應，形成共價鍵將細胞固定。用該法制備的固定化細胞一般為死細胞。

三、交聯法
利用雙功能或多功能試劑與細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）反應，從而使細胞固定。常用的交聯劑包括：戊二醛、甲苯二異氰酸酯、雙重氮聯苯胺。
由於交聯試劑的毒性，這一方法具有一定的局限性。
四、包埋法
包埋法是細胞固定化最常用的方法。包埋法可以分為：
1，微膠囊法：利用半透性聚合物薄膜將細胞包裹起來，形成微型膠囊；
2，凝膠包埋法：是在無菌條件下，將生物細胞和膠溶液混合在一起，然後再經過相應的造粒處理，形成直徑為1-4mm的膠粒。
常用的包埋劑為：聚丙烯醯胺、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、二醋酸纖維、三醋酸纖維、明膠等。
五、固定化方法的比較
吸附法：條件溫和、方法簡便、載體可再生。但操作穩定性差。
共價法：操作穩定性高。但由於試劑的毒性，易引起細胞的破壞。
交聯法：可得到高細胞濃度，但機械強度低，無法再生，不適於實際應用。
包埋法：細胞和載體間沒有束縛，固定化後，細胞仍保持較高活力。但這類方法只適用於小分子底物。

⑦ 生物技術常用的實驗方法及具體原理、步驟

生物技術這個范圍真的太大，細胞工程，基因工程，酶工程，胚胎移植都算，麻煩LZ再想想要問什麼
一般生物實驗有3原則（高中）：單一變數，平行重復，安全可行。結合這個可以推導出相應原理和步驟。(我高中就很少去背原理，都是推的）