A. 怎樣篩選目的基因
有4種方法：
1、從基因文庫中獲得目的基因.
方法：
第一步,通過PCR方法將目的基因已知的部分核苷酸序列擴增出來,進行放射性同位素標記（也可以用別的標記方法進行,如生物素、熒光素等）,即用標記了放射性同位素的目的DNA片段作為探針,與擴增出來的DNA雜交.
第二步,將基因文庫中的所有菌落轉移至硝酸纖維膜上（也可以用其他類型的膜）,然後,通過處理溶解消化掉細菌中的蛋白質,並使DNA固定在膜上.
第三步,按Southern雜交的方法進行雜交.
第四步,在X光底片上出現黑斑的菌落,這表明這個菌落中含有所需要的目的基因（若選用別的標記方法,有陽性信號的菌落則含有所需要的目的基因）.
第五步,從該菌落中再提取目的基因.
2、PCR 篩選法方法：
第一步：將反應體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應所需的離子等）加熱至90～95 ℃,使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開,變成單鏈DNA,作為互補鏈聚合反應的模板.
第二步：將反應體系降溫至55～60 ℃,使兩種引物分別與模板DNA鏈3′端的互補序列互補配對,這個過程稱為復性.
第三步：將反應體系升溫至70～75 ℃,在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下,將與模板互補的單個核苷酸加到引物所提供的3-OH上,使DNA鏈延伸,產生一條與模板鏈互補的DNA鏈.
上述三步反應完成後,一個DNA分子就變成了兩個DNA分子,隨著重復次數的增多,DNA分子就以2n的形式增加.PCR的反應過程都是在PCR擴增儀中完成的.
3、核酸雜交法、
DNA和DNA分子之間的雜交.目的基因是否整合到受體生物的染色體DNA中,這在真核生物中是目的基因可否穩定存在和遺傳的關鍵.如何證明這一點,就需要通過Southern雜交技術.基本做法是：
第一步,將受體生物DNA提取出來,經過適當的酶切後,走瓊脂糖凝膠電泳,將不同大小的片段分開；
第二步,將凝膠上的DNA片段轉移到硝酸纖維素膜上；
第三步,用標記了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作為探針與硝酸纖維素膜上的DNA進行雜交；
第四步,將X光底片壓在硝酸纖維素膜上,在暗處使底片感光；
第五步,將X光底片沖洗,如果在底片上出現黑色條帶,則表明受體植物染色體DNA上有目的基因.
4、免疫篩選法
Western雜交──蛋白質分子（抗原—抗體）之間的雜交.它是檢測目的基因是否表達出蛋白質的一種方法.具體做法是：
第一步,將目的基因在大腸桿菌中表達出蛋白質；
第二步,將表達出的蛋白質注射動物進行免疫,產生相應的抗體,並提取出抗體（一抗）；
第三步,從轉基因生物中提取蛋白質,走凝膠電泳；
第四步,將凝膠中的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；
第五步,將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交,這時抗體（一抗）與目的基因表達的蛋白（抗原）會特異結合.由於這種抗原—抗體的結合顯示不出條帶,所以加入一種稱為二抗的抗體,它可以與一抗結合,二抗抗體上帶有特殊的標記.如果目的基因表達出了蛋白質,則結果為陽性.
B. 獲得目的基因有幾種主要方法
獲得目的基因常用的方法有PCR法、化學合成法、cDNA法及建立基因文庫的方法來篩選
直接獲取
1.從基因文庫中獲取 這個沒什麼就是現成的基因儲存在受體菌上你用的時候提取出來就好了（基因組文庫法 就是原教材中的用限制性內切酶直接獲取。利用λ噬菌體載體構建基因組文庫的一般操作程序如下：① 選用特定限制性內切酶， DNA進行部分酶解，得到DNA限制性片段② 選用適當的限制性內切酶酶解λ噬菌體載體DNA。③ 經適當處理，將基因組DNA限制性片段與λ噬菌體載體進行體外重組。④ 利用體外包裝系統將重組體包裝成完整的顆粒。⑤ 以重組噬菌體顆粒侵染大腸桿菌，形成大量噬菌斑，從而形成含有整個DNA的重組DNA群體，即文庫。）經典解釋
2.cDNA文庫法（即原教材中提到的逆轉錄法）。cDNA文庫，是指匯集以某生物成熟mRNA為模板逆轉錄而成的cDNA序列的重組DNA群體。雖然可用基因組文庫法來獲取真核生物的目的基因，但是由於高等真核生物基因組DNA文庫比其cDNA文庫大得多，相關工作量同樣大得多。更為重要的是，在真核生物基因組中合有大量的間隔序列或內含子，但在大腸桿菌等原核生物中沒有類似序列的存在，所以大腸桿菌不能從真核生物基因的初級轉錄本中去除間隔序列，即不能表達真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在間隔序列（已在拼接過程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA為模板，逆轉錄而成的cDNA可被大腸桿菌表達。因此，在基因工程中，cDNA文庫法是從真核生物細胞中分離目的基因的常用方法。
3.直接分離基因最常用的方法是「鳥槍法」，又叫「散彈射擊法」。這種方法有如用獵槍發射的散彈打鳥，無論哪一顆彈粒擊中目標，都能把鳥打下來。鳥槍法的具體做法是：用限制酶（即限制性內切酶）將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然後通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在受體細胞中大量復制（在遺傳學中叫做擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法吧帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲，抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。
用「鳥槍法」獲取目的基因的優點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。
人工合成
1.(主要是序列已知的基因)。主要是通過DNA自動合成儀，通過固相亞磷酸醯胺法合成，具體過程可以網上查詢，反正是可以按照已知序列將核苷酸一個一個連接上去成為核苷酸序列，一般適於分子較小而不易獲得的基因。對於大的基因一般是先用化學合成法合成引物，再利用引物獲得目的基因。
2.聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑
C. 當前有哪些篩選基因突變的有效方法
1.功能互補法：使突變株表達，與空白相對比
2.核酸雜交法：喚型搭使用突變株基因單鏈與原基因雜交和拿，能完租陸全配就未能成功
3.定位克隆
4.差別雜交分離目地基因
D. 基因功能驗證有幾種方法
1、利用基因重組的技術進行基因敲除，根據目的基因序列設計合成出同源基因片段，利用基因打靶技術將攜帶同源基因好槐缺片段的基因打靶載體，用電穿孔的技術導入同源的胚胎幹細胞中，利用同源基因片段取代靶基因，達友辯到基因敲除的目的。
2、篩選出基因打靶成功的細胞，用選擇性培養基篩選出基因打靶成功的細胞。
3、將打靶成功的細胞導入小鼠體內，觀察表形。將打靶成功的細胞導入小鼠囊胚中，再將囊胚導入假孕小鼠體內，發育成為基因敲除的小鼠，觀察目的基因改變後的小鼠的生物學性狀改變，達到驗證目的基因功明搏能的目的。
E. 基因文庫常用的篩選的方法有哪些
常用的文庫篩選方法有核酸探針雜交法 抗體免疫法和差異雜交法等
F. 如何快速篩選組織特異性表達的基因
這樣可以消除遺傳背景的差異可以篩神攜選組織特異性表達的基因，分別對不同組織碧鬧進行轉錄組測序即可，比如一個個體上的不同悔瞎罩組織，但要保證不同組織來自相同的遺傳背景，謝謝
G. 從生物體克隆目的基因的方法有哪些
1.PCR擴增克隆法
PCR擴增克隆法是在已知植物基因序列的基礎上，進行基因序列克隆的一種方法。先從基因文庫（genebank）中找到有關基因序列，據此合成一對寡聚核苷酸引物，從植物中提取染色體DNA或RNA，進行PCR擴增。擴增的片段純化後插入合適的質粒載體上，用酶切分析和序列分析檢測重組子，並與已知基因序列比較，以獲得目的基因。
2.功能克隆法
功能克隆（functionalcloning）是根據性狀的基本生化特徵，在鑒定已知基因功能後進行克隆。該法在純化相應的編碼蛋白質後，構建cDNA文庫或基因組文庫。然後從文庫中用下述兩種方法進行基因篩選，其一是將純化的蛋白質進行氨基酸測序，據此合成寡核苷酸探針，從cDNA文庫或基因組文庫中篩選編碼基因；其二是將編碼蛋白質製成相應抗體探針，從cDNA載體表達文庫中篩選相應克隆。實行功能克隆的關鍵步驟是分離出高純度蛋白質。對於產物不明的基因，不能利用這一方法進行克隆。
3.定位（圖位）克隆法
定位（圖位）克隆法（positionalcloning）根據目的基因在染色體上的位置，進而通過染色體步移（chromosomewalking）進行克隆。需預先建立具有目的基因的適宜遺傳分離群體（近等基因系或分離群體），將目的基因精確定位在染色體特定的位置之後，用目的基因兩側緊密連鎖的分子標記（RFLP標記）為探針，篩選基因組文庫，得到陽性克隆，然後以陽性克隆的末端作為探針，獲得含有目標基因的大片段克隆，然後以這些新的DNA為探針，獲得更趨近目的基因的DNA片段，不斷縮小篩選區域，逐步向目的基因靠近，最終克隆到該基因。
4.轉座子標記法
轉座子（transposon）是可從一個基因位置轉移到另一位置的DNA片段，而原來位置的DNA片段（轉座子）並未消失，發生轉移的只是轉座子的拷貝。基因轉座可引起插入突變，使插入位置的基因失活，並誘導產生突變型。通過標記基因就可以檢測出突變基因的位置，進而克隆該突變基因。這樣將轉座子作為基因定位的標記，並通過轉座子在染色體上的插入和嵌合來克隆基因稱為轉座子標記法（transposontagging）。para>5.減法雜交法
該法根據植物表現型差異或基因在不同組織或器官的表達差異來克隆植物基因。特異性表達的基因，其mRNA表現不同。分別從表達特異性基因的植物組織和無特異性基因的組織中提取mRNA，反轉錄為cDNA，兩者雜交。在兩種組織中都表達的基因產物形成雜交分子，而特異mRNA轉錄的cDNA仍保持單鏈狀態，將這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達的基因，這一策略被稱作減法雜。
6.mRNA差異顯示法
該法可有效鑒別並克隆差異表達的基因。提取不同的mRNA後可用共同的引物反轉錄成cDNA，進行PCR擴增，獲得差異表達的cDNA序列，作為探針，在cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因，並作功能分析。該法可直觀篩選差異表達的基因，比減法雜交操作方便、迅速，需要總RNA量少，效率高，短期內可完成cDNA的擴增、鑒定和克隆。
H. 基因分析的方法
高等真核生物的基因組一般具有80 000～100 000個基因，而每一個細胞大約只表達其中的15%〔1〕。基因在不同細胞間及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發育與分化、衰老與死亡、內環境穩定、細胞周期調控等。比較細胞間基因表達的差異為我們揭示生命活動的規律提供了依據。
由於真核細胞 mRNA 3′端一般含有 poly（ a）尾，因此現有的方法基本上都是利用共同引物將不同的 mRNA反轉錄成 cDNA，以 cDNA為對象研究基因表達的差異。1992年 Liang等〔2〕建立了一種差異顯示反轉錄 pCR法（ differential display reverse transcription PCR， dDRT-PCR），為檢測成批基因表達的差異開辟了新天地。迄今為止已出現了大量應用該技術的研究報道〔3，4〕。然而，盡管應用 dDRT-PCR方法已經取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復率低，至少有20%的差異條帶不能被准確重復〔5〕；(2)假陽性率可以高達90%〔6〕；(3)獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。近年來，針對 dDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測差異表達基因的方法出現，現僅就這方面的進展做一簡要介紹。
1.基因表達指紋（ gene expression fingerprinting， gEF）： gEF技術使用生物素標記的引物 bio-T13合成 cDNA第一鏈，用 dGTP對其進行末端加尾，再以富含 c的引物引發合成 cDNA第二鏈。用限制性內切酶消化雙鏈 cDNA，以交聯有抗生物素蛋白的微球捕獲 cDNA3′端，以 t4DNA連接酶連接同前述內切酶相對應的適配子，並以 bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進行特異的 pCR擴增，得到大量的特異 cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標記後，固定於微球上的 cDNA片段經過一系列酶切，產生的酶切片段從微球表面釋放出來，其中那些含有標記末端的片段經凝膠電泳後構成 mRNA指紋圖譜。通過分析不同細胞間的指紋圖譜就能得到差異表達的序列〔7〕。 gEF技術所需的工作量較 dDRT-PCR明顯減少，由於用酶切反應替代了條件不嚴格的 pCR反應，其重復性也較好，假陽性率低，並且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。 gEF技術最大的缺點在於電泳技術的局限。由於它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經過幾輪酶切之後常會得到1 000～2 000條電泳帶，而現有的 pAGE電泳很少能分辨超過400條帶，故只有15%～30%的 mRNA能夠被辨認出來，因此得到的只能是高表達基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡單有效的方法；如果希望得到有關某種細胞的基因表達譜，可能比較困難；採用雙向電泳技術可能會有所幫助〔8〕。
2．基因表達系統分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）： sAGE法的建立基於兩條理論。首先，一段來自某個轉錄子確定位置的核苷酸，其長度只要有9～10個 bp，就能夠特異地確認該轉錄子。第二，對短片段標簽的鏈接有利於在同一克隆中對多個標簽測序。 sAGE也是用生物素標記的 bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈 cDNA，然後以限制酶（錨定酶）進行酶切，捕獲 cDNA3′端。在此處產物被分為兩部分，分別與包含有 iIS型內切酶（標簽酶）位點的 a、 b連接子相接。 iIS型內切酶的特點是作用位點處於識別位點之外。這樣經過酶切，就有可能得到只有9～10bp的標簽序列。每兩個標簽的鈍端結合後成為 pCR的模板，以基於 a、 b連接子的引物進行 pCR反應的結果是得到了大量每條包含兩個不同來源標簽的序列，接下來再用錨定酶酶切、連接，就能將多個不同的標簽鏈接在一起（大約為每條包含數十個不同來源的標簽），克隆至質粒載體中後集中測序〔9，10〕。 sAGE的最終結果是通過計算機統計得到的，根據某個標簽出現頻率的高低來判斷並計算其所屬基因表達的豐度。對於在資料庫中找不到對應序列的標簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識別位點的4bp）對 cDNA文庫進行篩選，以尋找新基因。 sAGE可以檢測不同細胞間已知基因表達的具體差異，精確到每個細胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達譜，系統地分析基因表達的差異。它的缺點在於工作量非常大，有大量的測序及計算機分析任務；而且，對於尋找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選 cDNA文庫是很不嚴格的，根據我們的經驗，往往是假陽性結果居多。
3 . cDNA3′端限制酶切片段顯示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端 rFD利用帶有「踵」結構的錨定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一鏈，以 okayama和 berg的置換法合成 cDNA第二鏈，然後將雙鏈 cDNA以限制酶消化。本方法的適配子由 a1和 a2兩條寡核苷酸構成，其序列與所用限制酶識別位點相符合，先將 a2的5′端磷酸化，再加入 a1退火，就會形成一個 y型結構；把 y型適配子與酶切後的 cDNA片段相連接，以適配子及錨定引物中所含序列為特異引物進行 pCR反應，則只有 cDNA3′末端的一段被擴增出來，這時的產物可用凝膠電泳表示出來構成差異表達圖譜。對於每次切割6bp的限制酶來說，每種大概只能切割8%的 cDNA，因此至少需要12種以上的限制酶才能使所有 cDNA都顯示出來〔11〕。 cDNA3′端 rFD與 gEF的思路比較相似，由於它利用多種限制酶進行酶切，因此不會象 gEF因凝膠電泳解析度不夠而漏掉信息。它的重復性較好，假陽性率低，尤其是對於已知基因，可以根據選擇內切酶的作用位點確定該基因在凝膠電泳中的位置並判斷其含量，從而避免了進一步的分析。對於精力有限的研究人員，這可能是個值得一試的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相類似的缺點，它得到的片段中包含的編碼信息比較少，需要多花一些時間對所得到的差異條帶進一步分析。
4.分子指數的 rNA指紋（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）:MI是一種能夠較好地顯示 mRNA中編碼序列的方法。它利用Ⅱ s型內切酶的作用位點在識別位點之外可以形成一個4bp的突出端的特點，設計43共64種（最外側一個核苷酸隨機）適配子，使得獲取編碼序列片段成為可能。首先是以常規方法合成雙鏈 cDNA，用Ⅱ類限制酶進行酶切後連接5′端磷酸化的相應適配子，再以Ⅱ s類
I. 基因診斷常用技術方法
基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達功能是否正常，從而達到診斷疾病的一種方法。它是繼形態學、生物化學和免疫學診斷之後的第四代診埋物斷技術，它的誕生與發展得益於分子生物學理論和技術的迅速發展。
常用基因診斷技術：
一、Southern印跡法（Southern blot）
基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束後，經過80℃烘烤的DNA，將原位地固定於膜上。
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定於膜上的單鏈基因DNA分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。
二、聚合酶鏈反應
近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。
三、高納擴增片段長度多態性
小衛星DNA和微衛星DNA的長度多態性可以通過PCR擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析.
四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法
當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針彎念液，與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來.
PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。
五、單鏈構象多態性診斷法
單鏈構象多態性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用於DNA中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。
J. 如何從基因文庫中篩選目的基因
有3種方法：核酸雜交法、PCR篩選法、免疫篩選法