諾如病毒的常用實驗室診斷方法

『壹』 早期病毒感染的實驗室快速診斷方法有哪些

病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測。臨床醫師根據流行病學資料，疾病的症狀與體征綜合判斷可能為何種病毒感染，留取適宜的標本送檢。

一、檢材的採集與送檢

病毒性疾病通常採集血液、鼻咽分泌液、咯痰、糞便、腦脊液、皰疹內容物、活檢組織或屍檢組織等。

供分離病毒、檢出核酸及抗原的標本的，要求：

(一)盡早採取 在發病初期(急性期)採取，較易檢出病毒，越遲陽性率越低。

(二)部位適宜 由感染部位採取，如呼吸道感染採取鼻咽洗漱液或咯痰；腸道感染採取糞便；腦內感染採取腦脊液；皮膚感染採取病灶組織；有病毒血症時採取血液。

(三)冷藏速送 病毒離活體後在室溫下很易死亡，故採得檢材應盡快送檢。若距離實驗室較遠，應將檢材放入裝有冰塊或乾冰的空器內送檢。病變組織則應保存於50%的甘油緩沖鹽水中。污染檢材，如鼻咽分泌液、糞便等應加入青黴素、鏈黴素或慶大毒素等，以免雜菌污染細胞或雞胚，而影響病毒分離。

檢測特異性抗體需要採取急性期與恢復期雙份血清，第一份盡可能在發病後立即採取，第二份在發病後2～3周採取。血清標本放4℃-20℃保存，試驗前血清標本以56℃30分鍾處理去除非特異性物質及補體。無菌性腦炎患者也可取腦脊液檢測特異性lgM。

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『貳』 諾如病毒是什麼病

諾如病毒 Hot廣東河源一小學23名學生感染「諾如病毒」2015-01-11 14:26 更多圖片(3張) 諾瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人類杯狀病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中諾如病毒（Norovirus,NV）屬的原型代表株。NV是一組形態相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。諾瓦克病毒最早是從1968年在美國諾瓦克市暴發的一次急性腹瀉的患者糞便中分離的病原。此後，世界各地陸續自胃腸炎患者糞便中分離出多種形態與之相似但抗原性略異的病毒樣顆粒，均以發現地點命名，如：Hawaii Virus（HV）、Snow Mountain Virus（SMV）、Mexico Virus（MxV）Southampton Virus（SOV）等，先是稱為小圓結構病毒（Small Round Structural Virus,SRSV），後稱為諾瓦克樣病毒（Norwalk-like virus,NLV）直至2002年8月第八屆國際病毒命名委員會批准名稱為諾如病毒（Norovirus,NV）。諾如病毒與在日本發現的札幌樣病毒（Sapporo-like Virus，SLV），正式名稱為札如病毒(Sapovirus,SV)，合稱為人類杯狀病毒。 諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內均有流行，全年均可發生感染，感染對象主要是成人和學齡兒童，寒冷季節呈現高發。美國每年在所有的非細菌性腹瀉暴發中，60-90%是由諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發達國家也都有類似結果。在中國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15%左右，血清抗體水平調查表明中國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。1995 年，中國報道了首例諾如病毒感染，之後山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州 浙江嘉興 等地區先後發生多起諾如病毒感染性腹瀉暴發疫情。 中文名：諾如病毒 外文名：Norovirus 概述：一組杯狀病毒屬病毒 實驗診斷：標本採集 實驗室檢查 爆發案例：中國 德國 日本 病毒特點：諾如病毒屬的原型代表株 界：微生物界 門：病毒門 分享

『叄』 諾如病毒的實驗診斷

電鏡法
直接電鏡法(EM)和免疫電鏡法(IEM)，EM 法觀察的靈敏度較低，要求每毫升糞便樣品中至少有大約 106個病毒粒子，因此只能用於患病早期病毒大量排出時採集的樣本檢測。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要應用患者恢復期血清捕捉同型抗原，從而增加檢出率。電鏡法的缺陷在於設備昂貴，不能廣泛普及；檢測結果與操作者的技能和經驗有直接關系；靈敏度相對較低；不適於大規模流行病學調查。
免疫法
包括放射免疫法(RIA)、生物素-親和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶聯免疫法(ELISA)。RIA法的靈敏度比IEM 法可 提高10～100倍，可以檢測出抗體升高的水平，為流行病學提供更有參考價值的資料。RIA 法的不足之處在於它需要 6 d，且需要放射性同位素標記。為了簡化方法，美國疾病預防控制中心建立了生物素-親和素免疫法，其靈敏度與 RIA 法相當，該方法已成為美國疾病預防控制中心檢測NLV抗原和抗體的標准實驗方法之一。1992年Jiang 等重組桿狀病毒表達NV衣殼蛋白成功後，建立起的 NV 酶聯免疫檢測方法快速、靈敏、經濟，其不足之處是免疫反應的株型特異性太強，所以應用范圍還比較窄。酶鏈免疫法特異性強，靈敏度高，診斷迅速，且較經濟，是可廣泛應用的檢測方法。由於NLV培養還未成功，原來用作試劑的病毒抗原數量受到限制，用分子生物學技術已經可以人工重組NV的衣殼蛋白，從而解決了上述問題。
分子生物學檢測方法
雜交技術和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)除了能更准確、靈敏地檢測標本中的NV，尤其是低濃度的NV感染外，最大的優點在於可以進一步對病毒進行基因型的研究，不會受到獲得分型單克隆抗體的限制，對流行病學研究具有重要意義。
等溫核酸擴增法 (NASBA)直接擴增RNA 來檢測 NV，樣品中病原RNA得到指數級擴增，產物通過瓊脂糖凝膠電泳或斑點印跡雜交鑒定結果。該方法的靈敏度略低於 RT-PCR 法；整個過程只有一步RNA擴增，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；縮短了操作時間；假陽性率低。 RT-PCR檢測食物中NV存在樣品病毒量含量低，樣品量大且成分復雜等問題，因此病毒富集濃縮、樣品處理是檢測的關鍵，其中有兩個重要方面影響檢測結果，一是樣品中病毒濃縮後的回收率，二是抽提核酸的完整程度和純度。
病毒濃縮
病毒濃縮 NV 濃縮方法一般分為兩大類，一類為有機絮凝沉澱法，主要使用聚乙二醇（PEG）沉澱，PEG 是具有強烈吸水性以及凝聚和沉澱蛋白作用的高分子聚合物，先改變樣品 pH 值，使毒粒與樣品微粒分開，PEG 把病毒沉澱下來，達到濃縮的目的。目前對於固體樣品 PEG 沉澱法是最有效的濃縮方法。
膜過濾法是另一類有效濃縮病毒的方法，通過改變膜的pH值使之與帶有電荷的毒粒結合捕捉病毒，這種方法通常用在濃縮大體積的黏度小、內容顆粒小的液體食品或水中。檢測海水、生活污水中的NV曾用過這種方法，為瓶裝水和其他飲料濃縮NV提供了參考。
核酸提取
食品樣品成分復雜，所含有的脂肪、蛋白質、金屬離子等物質都是 RT-PCR 反應抑制因子。NV是單鏈RNA病毒，核酸提取方法的優劣取決於兩個方面：核酸的質量和去除抑制因子的能力。應用較成熟廣泛的是胍法 RNA 提取法，即（異）硫氰酸胍-苯酚-氯仿聯合裂解抽提法，該方法改進後製成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等產品，與石英砂、磁珠等多孔顆粒相結合，已結合了poly(dT) 或特異探針的磁珠能較高程度的提純mRNA，去除反應抑制因子。石英砂或磁珠純化 RNA與傳統的有機試劑（異丙醇、乙醇）沉澱 RNA 相比起來，效果較好，只是成本偏高。