細胞刮刀的使用方法

① 細胞刮刀會刮壞細胞嗎

正常情況下是不會的，實驗室用的晶安生物25cm細胞刮刀，希望可以幫到您。

② 染色質免疫共沉澱的一般流程

ChIP 的一般流程：
甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。
在PCR分析這一塊，比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向於Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做晶元分析，做法在ChIP的基礎上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據公司的要求來准備樣品）。
具體操作流程：
第一天：
（一）、細胞的甲醛交聯與超聲破碎。
1、取出1平皿細胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養基共有9ml）。
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯：加甘氨酸至終濃度為0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸於平皿中。混勻後，在室溫下放置5min即可。
4、吸盡培養基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。
5、細胞刮刀收集細胞於15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預冷後2000rpm 5min收集細胞。
6、倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。假設MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800ul。
7、超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。
（二）、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結束後，10000g 4℃離心10min。去除不溶物質。
留取300ul做實驗，其餘保存於-80℃。
300ul中，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65℃處理3h解交聯，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉混勻1h。
10、1h後，在4℃靜置10min沉澱，700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉過夜。
（三）、檢驗超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎後產物，加入4ul 5M NaCl，65℃處理2h解交聯。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。
第二天：
（一）、免疫復合物的沉澱及清洗。
12、孵育過夜後，每管中加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉2h。
13、4℃靜置10min後，700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉澱復合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉10min，4℃靜置10min沉澱，700rpm離心1min，除去上清。
洗滌溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.LiCl wash buffer-one wash
d.TE buffer-two wash
15、清洗完畢後，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul10%SDS，100ul 1MNaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉15min，靜置離心後，收集上清。重復洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。
混勻，65℃解交聯過夜。
第三天：
（一）、DNA樣品的回收
17、解交聯結束後，每管加入1ul RNaseA（MBI），37℃孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5MEDTA，20ul 1MTris.HCl（PH6.5），2ul 10mg/ml蛋白酶K。
45℃處理2h。
19、DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶於100ul ddH2O。
（二）、PCR分析

③ 細胞刮刀可以重復使用嗎

只要能夠徹底清洗就可以重檔稿復使用。但是如臘渣果經費允許的話，盡量不要重復使用，因為清輪蠢悄洗、滅菌過程很繁瑣，不能保證徹底無菌，另外，清洗後會對鏟面造成損害，可能會影響使用效果。但是塑料的不建議重復使用，讀書時候實驗室都是老師統一訂購的，用的是晶安生物的。

④ 收集細胞蛋白要不要用細胞刮

收集細胞蛋升滲白是需要用細胞刮的，步驟是這樣，先吸取培養基，預冷pbs清洗細胞三次，再用細胞刮刮脫細鏈陪胞到離心管，離心15分棚笑蠢鍾，轉移洗凈就好了。

⑤ chip實驗原理及步驟

第三天：

(一)、DNA樣品的回收

17、解交聯結束後，每管加入1ulRNaseA(MBI)，37度孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl(PH6.5)，2ul10mg/ml蛋白酶K。45度處理2h。

19、DNA片段的回收―――omega膠回收試劑盒。終的樣品溶於100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP技術總結

(一)關於細胞

細胞的生長狀態要好。因為細胞的生長狀態直接影響細胞內部的基因表達調控網路，也很有

可能影響你所研究的TF與其靶Promoter的結合。一般細胞長到75%-80%比較好。

(二)關於抗體

抗體是實驗成敗的致命因素之一!必須是IP級別的抗體，另外如果經濟條件許可的話，盡量買大廠的抗體。不推薦國產抗體和santacruz的抗體，即使是IP級別的。

單抗與多抗的選擇也需要仔細考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強，背景低。但是單抗有一個致命的弱點，就是識別位點單一，而在ChIP甲醛交聯的過程中，很有可能該位點被其它蛋白或核酸結合而被封閉，導致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有這個問題，但是多抗特異性較差，背景可能會偏高。

一般而言，如果沒有十足把握(單抗的識別位點遠離靶蛋白與核酸結合的區域)，選擇多抗比較穩妥一些。

(三)關於交聯與超聲破碎

這一塊的確是ChIP實驗中比較難把握的部分。交聯的程度會影響到超聲破碎的效果，交聯的程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。

交聯不充分，只有一部分靶蛋白與其Promoter相結合，富集得到的Promoter的量不高，實驗假陰性。交聯過充分，基因組上結合了太多的蛋白，對超聲破碎造成障礙。另外也會增加背景。

一般來講，按照經驗，交聯條件取決於細胞類型。不同的細胞系，交聯的條件也不一樣。例如：NIH-3T3的交聯條件是室溫(25攝氏度)下15min，1%的甲醛濃度，而別的細胞系則可能完全不一樣。而超聲破碎的條件，機器不一樣，條件也不一樣。當然如果你有bioruptor這樣的神器，那麼超聲破碎對你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范圍也是可以接受的。

(四)關於操作

希望盡可能的保持低溫(4度)。沉澱的時候可以先在4度放置一會，等它自然沉降一些，再超低轉速(500rpm等)離心使其完全沉降。雖然說明書上說ChIP實驗的過程中有幾個可以停頓的地方，我還是希望你能夠連續把它做完，直到PCR結果出來為止。盡量避免實驗中不可預知的影響因素。

(五)關於解交聯

雖然說明書上說4小時已經足夠，但是我還是希望你可以解交聯過夜。因為在那樣的環境里，DNA不會降解，過夜解交聯更充分些。只是不要忘記在EP管口封上封口膜。

(六)關於DNA片段的回收

需要注意的是：樣品中SDS樣品較高，普通的PCR產物回收試劑盒回收，很有可能會在終的樣品中混入SDS，影響PCR實驗結果。小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉澱。

⑥ 什麼是染色質免疫共沉澱技術（ChIP）

染色質免疫共沉澱技術是在保持組蛋白和DNA聯合的同時，通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質被切成很小的片斷，並沉澱下來的技術。

這項技術主要用來分析目標基因有沒有活性、或者分析一種已知蛋白（轉錄因子）的靶基因有哪些。該技術主要應用於以下幾方面：

1.組蛋白修飾酶的抗體作為「生物標記」

2.轉錄調控分析

3.葯物開發研究

4.有絲分裂研究

5.DNA損失與凋亡分析

(6)細胞刮刀的使用方法擴展閱讀：

實驗步驟：

1、細胞固定

甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯反應是完全可逆的，便於在後續步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯所用的甲醛終濃度為1%，交聯時間通常為5分鍾到1個小時，具體時間根據實驗而定。

值得注意的是，交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短，則交聯不完全，產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。

2、染色質斷裂

交聯後的染色質可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標蛋白，利於抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。

所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。

技術應用：

1、Micrococcal Nuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果更精緻，更均一。另外，酶反應的條件比較溫和，對DNA和DNA-蛋白復合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用於新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時，經常採用沒經過甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。

因為N-ChIP沒經過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和DNA的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對於甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。

2、染色質免疫沉澱的DNA適用於多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可採用狹縫雜交（Slot blot）的方法，把靶序列特異性探針與染色質免疫沉澱的DNA雜交，來驗證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結合。

還可以根據靶序列設計引物，用半定量PCR的方法進行測定，或採用Real-time PCR方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可採用Southern雜交。但因為免疫沉澱的DNA量較少，所以在研究時通常要用PCR方法擴增DNA探針，再進行整個基因組掃描。

還可以把沉澱的DNA克隆到載體中，進行測序，尋找該序列附近的開放閱讀框，發現新的基因調節序列。

3、目前，隨著人類基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點。由於基因組中的信息量非常大，上述常規方法通常無法滿足科研的需要。近年來發展起來的ChIP-chip技術將基因組DNA晶元（chip）技術與染色質免疫沉澱技術（ChIP）相結合，為研究目的蛋白與整個基因組相互作用提供了可能。

ChIP-chip 技術通過標記染色質免疫沉澱富集的DNA片段，和另一個被標記不同探針的對照組樣品一起，與DNA晶元雜交，再利用各種生物信息學方法對收集到的信號進行分析，具體的實驗步驟請參考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。

ChIP-chip技術已經被廣泛應用於研究轉錄因子在整個基因組中的信號網路，染色質修飾機制在基因組中的調控，DNA的復制，修復以及修飾，基因的轉錄與核運輸等諸多方面。

4、染色質免疫沉澱技術還可用於分析兩種蛋白共同結合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基礎上不解交聯，而繼續進行另一個目的蛋白的免疫沉澱，從而得到與兩種目的蛋白都結合的DNA序列。

值得注意的是，因為通過兩次免疫沉澱富集的DNA量比較少，所以在分析時通常要把多次免疫沉澱的DNA濃縮後再進行操作。

5、隨著染色質免疫沉澱技術受到廣泛的關注，運用該技術發表的文章也逐漸增多，大家越來越多的開始關注如何改進ChIP的方法。Millipore最新推出的Magna ChIP試劑盒，利用磁珠分離DNA-蛋白-抗體復合物，提高了ChIP的效率，簡化了操作的過程，縮短了實驗的時間，還為同時進行多個目的蛋白的研究提供了可能，是經常使用ChIP技術的研究人員的理想選擇。

6、近年來ChIP技術也被用於研究RNA-蛋白的相互作用，其原理與DNA類似，也包括甲醛固定，超聲波破細胞，免疫沉澱，交聯逆轉，RNA純化和RNA鑒定等步驟。所不同的是，交聯逆轉只用Proteinase K，要進行RNA純化和不含RNase的DNase處理，分析時用RT-PCR，晶元雜交要用cDNA晶元等。

⑦ 細胞刮能重復使用嗎

我們每次處理完細胞後都會將細鄭仿胞刮放到75%酒精里浸泡，重復利用，剛開始細胞也一直好好的。之前細胞刮刮過污染的細胞，依然在75%的酒精里浸泡，重復利用，但後來培養的細胞總是污染，具體從什麼時侯開始一直污染肢叢缺我也歷辯記不清了。