組織學切片最常用的切片方法

A. 醫院做的切片檢查是怎麼進行的

從患者身體的病變部位取出小塊組織（根據不同情況可採用鉗取、切除或穿刺吸取等方法）或手術切除標本製成病理切片，觀察細胞和組織的形態結構變化，以確定病變性質，作出病理診斷。

為探討器官、組織或細胞所發生的疾病過程，可採用某種病理形態學檢查的方法，檢查他們所發生的病變，探討病變產生的原因、發病機理、病變的發生發展過程，最後做出病理診斷。

(1)組織學切片最常用的切片方法擴展閱讀：

切片檢查已經大量應用於臨床工作及科學研究。在臨床方面主要進行屍體病理檢查及手術病理檢查。手術病理檢查的目的。

為了明確診斷及驗證術前的診斷，提高臨床的診斷水平；診斷明確後，可決定下步治療方案及估計預後，進而提高臨床的治療水平。通過臨床病理分析，也可獲得大量極有價值的科研資料。

單純形態學觀察進行病理診斷的方法，即純定性的方法、形態學的方法僅能進行粗略的定量估計，如根據瘤細胞的核分裂數目，尤其是病理性核分裂來判斷惡性腫瘤的惡性變 。

B. 常用切片技術有哪些

切片伴隨著顯微鏡技術和免疫實驗等的發展而得到廣泛的應用。本文對其中的冰凍切片、石蠟切片、碳蠟切片、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實驗方法相關操作步驟

C. 常用的組織切片法有哪些

大概有冰凍切片、石蠟切片、碳蠟切片、超薄切片、塑料切片等幾種常用的實驗方法，

D. 怎麼做標本

標本製作分很多種：血塗片、植物壓片、金相切片等
舉一個組織標本製作的方法
石蠟切片標本製作法：
這是最常用的組織學標本的製作方法。這種方法包括以下幾個步 驟：取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色和封固。

1．取材、固定：動物組織在死後及離體後會很快解體，這可能是由於細菌或是由於組織 本身所含酶的分解所致。所以，被檢動物在乙醚麻醉下或以不同方法處死後，應立即進行取 材和固定，以停止其分解作用，盡可能保存細胞、組織生前結構和成分，還能抵抗後繼各步 驟處理時所產生的影響。 1)取材：即從動物體內取下被檢的器官或組織。以肝為例，取材的步驟為：將動物麻醉 或處死後，腹部向上固著在蠟盤上，打開腹部，暴露肝，用鋒銳的小剪或手術刀細致而又迅 速地取下一塊厚度和大小適宜(0．5cm』)的肝，立即投入固定液內『：。：
2)固定：固定是把組織用化學試劑浸泡，使其蛋白質等成分迅速凝固，盡量保持生前形 態結構而不發生死後的變化。固定時所使用的化學溶液，稱為固定液。
常用固定液的配方：
①Susa液(HeidenhainfsSusafluid) I液： 氯化汞(升汞)飽和水溶液 B液： 氯化鈉 三氯醋酸 冰醋酸 40％甲醛 蒸餾水 50．0ml o．58g 2．08g 4．oIml 20．0m1 80．0ml臨用時取等量的I液和2液混合後，將組織塊投入，固定12h。
Helly液（Helly`s fluid) 重鉻酸鉀 2．5g 氯化汞 5．0g 硫酸鈉 1．0g 蒸餾水 100．0m1 40％甲醛 5．0m1(臨用時加入) 。
⑧甲醛(10％nelltralformalin) 40％甲醒 10．0m1 蒸餾水 90．0m1。
④Bouin液(Bouinfsfluid) 苦味酸飽和水溶液 75．0m1 40％甲醛 25．0m1 冰醋5．0m1。
⑤Carnoy液(Carnoy`s fluid) 無水酒精 6ml 氯仿 3m1 冰醋酸 1m1 。

2．脫水、透明、浸蠟、包埋：這幾個步驟是為了將組織包埋在較硬的物質即石蠟中，以 便於制備薄的切片。
1)脫水：普通固定液多是水溶液，必須先脫去水分，為浸蠟創造條件。脫水劑通常用酒 精。脫水的步驟是逐步升高酒精溶液的濃度，以去凈組織塊內的水分，並完全由無水酒精取 代。Susa液固定的組織塊，須先入含碘的95％酒精，脫水並洗去組織內的汞沉澱，然後換 90％、95％酒精和無水酒精。10％甲醛液固定後的組織塊，脫水時應依次經70％、80％、 90％、95％酒精和無水酒精。
2)透明：因石蠟不溶於酒精而溶於二甲苯，因而組織塊經脫水後須再用二甲苯替代出酒 精。組織塊浸入二甲苯後逐漸變得透明，故此步驟稱為透明。透明時間依組織塊大小及性質 而定。
3)浸蠟：將透明好的組織塊置入已在溫箱(56—58℃)內熔化的石蠟內，放置適當時間， 使石蠟浸入組織並替換出二甲苯。
4)包埋：在包埋器的內壁塗一層甘油，傾入熔化的石蠟，將浸透蠟的組織塊放到裡面， 擺好方位，挨蠟液表面凝固後，將包埋器投入冷水浴中，使石蠟冷卻凝固，即得堅硬的組織 蠟塊，經過修整即可用於切片。

3．切片：一般用輪轉式切片機製作組織學切片。切片機一般結構為：切片刀固定台、載 物台(機頭或標本固定台)、切片厚度調節裝置、機輪等部件。切片時：①將組織蠟塊固著在 木托或金屬托上，再將蠟塊托固定於載物台；⑧將磨好的切片刀固定於切片刀固定台，調好 蠟塊與刀的距離；②調整切片厚度調節裝置，一般調至切6ym厚度的小格上；④轉動機輪，每 轉動一周，載物台就向切片刀側移動6ym，同時還垂直下降上升往返一次，於是切得6ym厚 度的切片一張；如機輪連續轉動，就可得一條連續的切片蠟帶。
取下切片，置於塗布一層蛋白甘油的載玻片上，滴上適量水，於酒精燈上徐徐加溫，至 切片在水面展平，傾去水，擺好切片位置，放入烤片箱。待切片乾燥並牢固地附著於載玻片 後，即可取出，進行染色。

4．染色、封固：染色的目的是使組織內的不同結構染上不同藏色以便於在顯微鏡下觀察。 染色的方法很多，可根據研究目的選用。組織學和病理學教學標本最常用的基本染色方法是 蘇木精·伊紅染色(H．E染色)。該方法可將細胞核染成藍紫色，細鮑質染成粉紅色，使細 胞結構對比分明。因此，現將該方法介紹如下。至於在實習過程中遇到的其它特殊染色法，將 分別介紹於首次出現之處。
蘇木精·伊紅染色(hematoxylin and eosinstain，簡稱H．E染色)：
1)染色的配方：
①Erich蘇木精染液(Ehrlich』shematoxylin) ； 蘇木精 2．98 95％酒精 100．0ml 蒸餾水 100．0m1 鉀礬 3．0g 冰醋酸 10．0m1 甘油 100．Oml 『的染液在至氣中氧化2個月左右即可使用。
②1％伊紅染液(1％Eosin) 伊紅 1．08 蒸餾水 100．0
2)染色步驟：
①脫蠟：將裱好的乾燥切片放入二甲苯浸2次，每次放置5。10min，以便將石蠟脫凈。．
②下行酒精到水：脫蠟後，切片入無水酒精浸2次，每次2min，以便洗去二甲苯；然後 經95％、90％、80％和70％酒精，每次2min；隨後入蒸餾水浸洗。若組織是用含汞的固定液 (如Susa液、Helly液)固定，還須經含碘的70％酒精脫汞後再入70％酒精及蒸餾水。
②蘇木精染色：將蒸餾水浸洗後的切片放入Ehrich蘇木精染液中，浸染5一10min。
④藍化和分色：切片由染液取出以後，用自來水沖洗，挨切片變成藍色後，再用稀鹽酸 70％酒精溶液進行分色，脫去多餘的染料(因為蘇木精染色後，往往胞核著色較深，胞質及 結締組織纖維等亦稍著色，影響下步染色及觀察)。然後再用自來水沖洗，使之藍化，約需15 ~30min。
⑤伊紅染色：切片用蒸餾水浸洗後，放入1％伊紅染液，浸染5—10min。
⑧上行酒精脫水：將切片用蒸餾水洗去附在載玻片上的染液後，經70％、80％、90％95％ 酒精和2次無水酒精脫水，每次一般為2min。：
⑦透明：切片入二甲苯2次，每次2min。
⑦封固：從二甲苯中取出切片，在切片的組織上滴加適量樹膠(balsam)，上面再加一蓋 玻片，使樹膠布滿於蓋玻片與載玻片之間的間隙，封固即告完成。將封好的切片標本放入烤 箱．待蓋玻片粘著牢固後，即得可供長期觀察和保存的H．E染色標本。

E. 請教教我，做標本。非常感謝

標本製作分很多種：血塗片、植物壓片、金相切片等
舉一個組織標本製作的方法
石蠟切片標本製作法：
這是最常用的組織學標本的製作方法。這種方法包括以下幾個步 驟：取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色和封固。

1．取材、固定：動物組織在死後及離體後會很快解體，這可能是由於細菌或是由於組織 本身所含酶的分解所致。所以，被檢動物在乙醚麻醉下或以不同方法處死後，應立即進行取 材和固定，以停止其分解作用，盡可能保存細胞、組織生前結構和成分，還能抵抗後繼各步 驟處理時所產生的影響。 1)取材：即從動物體內取下被檢的器官或組織。以肝為例，取材的步驟為：將動物麻醉 或處死後，腹部向上固著在蠟盤上，打開腹部，暴露肝，用鋒銳的小剪或手術刀細致而又迅 速地取下一塊厚度和大小適宜(0．5cm』)的肝，立即投入固定液內『：。：
2)固定：固定是把組織用化學試劑浸泡，使其蛋白質等成分迅速凝固，盡量保持生前形 態結構而不發生死後的變化。固定時所使用的化學溶液，稱為固定液。
常用固定液的配方：
①Susa液(HeidenhainfsSusafluid) I液： 氯化汞(升汞)飽和水溶液 B液： 氯化鈉 三氯醋酸 冰醋酸 40％甲醛 蒸餾水 50．0ml o．58g 2．08g 4．oIml 20．0m1 80．0ml臨用時取等量的I液和2液混合後，將組織塊投入，固定12h。
Helly液（Helly`s fluid) 重鉻酸鉀 2．5g 氯化汞 5．0g 硫酸鈉 1．0g 蒸餾水 100．0m1 40％甲醛 5．0m1(臨用時加入) 。
⑧甲醛(10％nelltralformalin) 40％甲醒 10．0m1 蒸餾水 90．0m1。
④Bouin液(Bouinfsfluid) 苦味酸飽和水溶液 75．0m1 40％甲醛 25．0m1 冰醋5．0m1。
⑤Carnoy液(Carnoy`s fluid) 無水酒精 6ml 氯仿 3m1 冰醋酸 1m1 。

2．脫水、透明、浸蠟、包埋：這幾個步驟是為了將組織包埋在較硬的物質即石蠟中，以 便於制備薄的切片。
1)脫水：普通固定液多是水溶液，必須先脫去水分，為浸蠟創造條件。脫水劑通常用酒 精。脫水的步驟是逐步升高酒精溶液的濃度，以去凈組織塊內的水分，並完全由無水酒精取 代。Susa液固定的組織塊，須先入含碘的95％酒精，脫水並洗去組織內的汞沉澱，然後換 90％、95％酒精和無水酒精。10％甲醛液固定後的組織塊，脫水時應依次經70％、80％、 90％、95％酒精和無水酒精。
2)透明：因石蠟不溶於酒精而溶於二甲苯，因而組織塊經脫水後須再用二甲苯替代出酒 精。組織塊浸入二甲苯後逐漸變得透明，故此步驟稱為透明。透明時間依組織塊大小及性質 而定。
3)浸蠟：將透明好的組織塊置入已在溫箱(56—58℃)內熔化的石蠟內，放置適當時間， 使石蠟浸入組織並替換出二甲苯。
4)包埋：在包埋器的內壁塗一層甘油，傾入熔化的石蠟，將浸透蠟的組織塊放到裡面， 擺好方位，挨蠟液表面凝固後，將包埋器投入冷水浴中，使石蠟冷卻凝固，即得堅硬的組織 蠟塊，經過修整即可用於切片。

3．切片：一般用輪轉式切片機製作組織學切片。切片機一般結構為：切片刀固定台、載 物台(機頭或標本固定台)、切片厚度調節裝置、機輪等部件。切片時：①將組織蠟塊固著在 木托或金屬托上，再將蠟塊托固定於載物台；⑧將磨好的切片刀固定於切片刀固定台，調好 蠟塊與刀的距離；②調整切片厚度調節裝置，一般調至切6ym厚度的小格上；④轉動機輪，每 轉動一周，載物台就向切片刀側移動6ym，同時還垂直下降上升往返一次，於是切得6ym厚 度的切片一張；如機輪連續轉動，就可得一條連續的切片蠟帶。
取下切片，置於塗布一層蛋白甘油的載玻片上，滴上適量水，於酒精燈上徐徐加溫，至 切片在水面展平，傾去水，擺好切片位置，放入烤片箱。待切片乾燥並牢固地附著於載玻片 後，即可取出，進行染色。

4．染色、封固：染色的目的是使組織內的不同結構染上不同藏色以便於在顯微鏡下觀察。 染色的方法很多，可根據研究目的選用。組織學和病理學教學標本最常用的基本染色方法是 蘇木精·伊紅染色(H．E染色)。該方法可將細胞核染成藍紫色，細鮑質染成粉紅色，使細 胞結構對比分明。因此，現將該方法介紹如下。至於在實習過程中遇到的其它特殊染色法，將 分別介紹於首次出現之處。
蘇木精·伊紅染色(hematoxylin and eosinstain，簡稱H．E染色)：
1)染色的配方：
①Erich蘇木精染液(Ehrlich』shematoxylin) ； 蘇木精 2．98 95％酒精 100．0ml 蒸餾水 100．0m1 鉀礬 3．0g 冰醋酸 10．0m1 甘油 100．Oml 『的染液在至氣中氧化2個月左右即可使用。
②1％伊紅染液(1％Eosin) 伊紅 1．08 蒸餾水 100．0
2)染色步驟：
①脫蠟：將裱好的乾燥切片放入二甲苯浸2次，每次放置5。10min，以便將石蠟脫凈。．
②下行酒精到水：脫蠟後，切片入無水酒精浸2次，每次2min，以便洗去二甲苯；然後 經95％、90％、80％和70％酒精，每次2min；隨後入蒸餾水浸洗。若組織是用含汞的固定液 (如Susa液、Helly液)固定，還須經含碘的70％酒精脫汞後再入70％酒精及蒸餾水。
②蘇木精染色：將蒸餾水浸洗後的切片放入Ehrich蘇木精染液中，浸染5一10min。
④藍化和分色：切片由染液取出以後，用自來水沖洗，挨切片變成藍色後，再用稀鹽酸 70％酒精溶液進行分色，脫去多餘的染料(因為蘇木精染色後，往往胞核著色較深，胞質及 結締組織纖維等亦稍著色，影響下步染色及觀察)。然後再用自來水沖洗，使之藍化，約需15 ~30min。
⑤伊紅染色：切片用蒸餾水浸洗後，放入1％伊紅染液，浸染5—10min。
⑧上行酒精脫水：將切片用蒸餾水洗去附在載玻片上的染液後，經70％、80％、90％95％ 酒精和2次無水酒精脫水，每次一般為2min。：
⑦透明：切片入二甲苯2次，每次2min。
⑦封固：從二甲苯中取出切片，在切片的組織上滴加適量樹膠(balsam)，上面再加一蓋 玻片，使樹膠布滿於蓋玻片與載玻片之間的間隙，封固即告完成。將封好的切片標本放入烤 箱．待蓋玻片粘著牢固後，即得可供長期觀察和保存的H．E染色標本。

F. 組織學最常用的製片方法是

石蠟切片。石蠟切片操作要點。

切片前，把切片機上相關鎖桿或螺旋擰緊，否則可能出現跳片、切片厚薄不均現象。

刮凈包埋盒周邊的余蠟，否則樣品夾持可能松動，影響切片質量。

正確修塊，先粗修，厚度大約在15-30微米，質地較硬的組織或較小的組織應再薄一些。粗修至組織全部暴露後，再進行細修。

選擇蠟塊握雀冷凍方式，冰盒優於冷凍台。使用冰盒能加水潤濕蠟塊，冷凍速度快，體積小，使用成本低，無須外接電源。

切片時輕握手輪，用力均勻輕柔，搖速不宜過快或過慢。過快會導致切片厚薄不均，切片難以展開；過慢會使切片增厚。切片要求完整、薄、均勻。

正確固定

組織離體後，必須在1小時內固定。固定液須是組織體積的4-10倍，濃度准確，過稀或過濃都會影響組織中扮形態和固定效果。如發現固定液變質，如甲醛液體產生白色沉澱，應立即更段培早換。

固定溫度宜室溫或放於35-37℃的全封閉組織處理機內，溫度過高，會加快組織自溶和過度收縮，破壞細胞內的抗原和DNA。固定時間不超過40小時，根據室溫和標本不同而調整。

G. 組織學常用的切片是石蠟切片，常用的染色法是和伊紅染色，簡稱__染色，

蘇木精，HE，嗜酸性，嗜鹼性

H. 200分求科研實驗切片的操作

石蠟切片法 ：
石蠟切片法是以石蠟作包埋劑,用旋轉切片機將材料切成薄片,經一系列處理製成永久製片的方法.在研究植物的細胞,組織,胚胎以及形態等方面石蠟切片法是最理想的製片方法.
石蠟切片法的一般流程為:取材→固定→抽氣→洗滌→脫水→透明→浸蠟→包埋→修塊→切片→粘片→染色→封片.
取材
用鋒利的刀片切取新鮮的植物材料,選定適宜的材料,立即固定.
取材的注意事項如下:
(1)取材料要新鮮.動作要迅速,以免擠壓損壞組織;取病理材料時,應設置對照材料.
(2)所取材料大小要適當:根和莖一般直徑≤5mm,切取成5-10mm小段;葉片一般取過中脈處,切成2-5mm寬,5-8mm長.在切材料時,必須注意刀片與中軸成直角,兩切面平行,否則製成的切片細胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材時間可根據切片要求有所區別.如:在進行植物發育的研究過程時,需要找到細胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00時取材,此時植物細胞分裂活動較明顯.
(4)取材不易過老,否則製片有難度(過老的材料須在滑走切片機上進行);對縱切的材料適當多取材,如根尖,莖尖等,因為切到材料正中的概率較低.
(二)固定
將已切好的材料盡快地浸入相當於材料10-15倍體積的固定液中.藉助固定液的作用,使細胞的新陳代謝瞬時停止,並保持細胞或組織的形態構造及其內含物的狀態不發生變化.從而達到使組織變硬從而便於切片,增強內含物的折光度,令細胞易於著色的目的,同時具有防腐作用.以新鮮配製固定液效果較好.固定的時間依材料的種類,性質,大小等而定.材料固定完畢,保存於加蓋的容器內,貼上標簽.
良好的固定劑,應是穿透力強,使細胞立刻致死,原生質全部凝固;不發生任何變形,增強折光率,並且不妨礙染色.
常用固定液:
簡單固定液 以一種化學葯品配製的固定液.
⑴ 乙醇 為凝固型固定劑.常用無水乙醇或95%乙醇.
⑵ 甲醛 為非凝固性固定劑.具強烈刺激性氣味.純凈的甲醛為無色透明液體.固定用的濃度為4%-10%.
⑶ 醋酸 為凝固型固定劑.為無色透明的液體,刺激性極強,低溫下凝結成冰,故又名冰醋酸.
2. 混合固定液:
由幾種試劑,適量配製而成.混合遵循原則:① 優缺點互補;② 膨脹與收縮相互平衡;③ 強氧化劑與還原劑應分別配置.
常用混合固定液有下列幾種:
⑴ FAA 固定液(福爾馬林-冰醋酸-乙醇) 廣泛適用於根,莖,葉,花葯,子房的組織切片,所以又稱為萬能固定液.一般固定時間不低於24 h.該固定液優點是在較低溫度下(10℃左右)適用於材料的長期保存,可兼作保存液.並且固定的材料,不妨礙染色,但用於細胞學上的固定效果較差.

⑵ 納瓦興(Navaschjn's)固定液 1912年首創.適用於細胞學與組織學研究的切片觀察.但滲透慢,不能長期保存;主要用於顯示分裂相.
(三)抽氣
植物材料內部多由於含有空氣,導致固定液不能完全深入.材料投入固定液後需要立即抽氣.以便讓固定液有效透入材料組織中,並排除材料內氣泡的干擾.
一般抽氣時間為20-30 min.抽過氣的材料在停止抽氣,應沉入底部.
(四)洗滌
固定液中的成分有可能會妨礙染色或發生沉澱或結晶,影響觀察;有的還會繼續作用,使材料變質等.因此,在使用材料時,需根據固定液的種類,用水,緩沖液或70%乙醇洗去滲入細胞內部的固定液.如:用FAA固定的材料在脫水時用70%乙醇反復洗滌數次.如用水洗滌,可將材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用紗布將管口扎緊,置於水槽內,進行流水沖洗.流水沖洗時間一般為12-24 h.
(五)脫水
材料經洗滌後含有部分水分,會使材料分解.而且透明劑與水是不相混合的,不利於材料的透明和包埋等後期處理.因此需用脫水劑逐漸除去材料中的水分,以便讓石蠟滲透進細胞.所以,脫水是製片的關鍵環節.脫水劑要求能與水混合,而且能與其他有機溶劑互相替代.
脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進行,防止吸收空氣中的水分;在更換高一級的脫水劑時,最好不要移動材料,以免損壞材料.
(六)透明
透明劑要具有既能與脫水劑相混合又能和石蠟相混合的性質,可以將材料中的脫水劑置換出來,使石蠟能順利進入材料中.
二甲苯是目前應用最廣的透明劑,作用迅速,但易使材料變脆..
(七)浸蠟
是指逐步清除材料中的透明劑,以使石蠟充分滲透於材料內部的過程.這樣,材料的各部分都能保持原來的結構與位置,切片不致發生破裂或其他變形.
浸蠟是一個漸進的過程,常用的正丁醇.
每次浸蠟的時間,視材料大小而調節.
(八)包埋
材料經過足夠時間的浸蠟後,需包入蠟塊,以備切片.
操作方法:根據切片材料大小,確定所需紙盒的尺寸,用表面光滑的磅紙預先疊好紙盒.
(九)切片
即將包埋好的材料塊用切片機切成所需厚度的切片帶.
(十)貼片
是用黏貼劑把切片平鋪貼在載玻片上,以便於染色和觀察.
常用的粘片劑有下列二種:
(1) 明膠黏片劑
(2) 蛋清黏片劑
(十一) 染色
即根據植物細胞中不同的化學性質,用染料分別進行染色,以利於觀察切片中細胞與組織的形態與構造及其內含物等.染色基本程序為脫蠟,染色,分色封片.
染色方法可分為下列幾類:
① 單染 只用一種染料染色.
② 雙重染色 兩種染料染色,如番紅--固綠;蘇木精---曙紅.
③ 多重染色 多種染料染色,如番紅—固綠—桔紅G;酸性品紅—苯胺藍—桔紅G等.
(十二) 封藏
封藏於中性樹膠中,使材料能在顯微鏡下清晰地顯示出來,並能長期保存.
方法:將含材料的載玻片放在吸水紙上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴樹膠(必須在二甲苯乾燥前進行),用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側,稍微傾斜使其左側與封藏劑接觸,然後再緩慢地放下,避免產生氣泡.
冷凍切片法：
冷凍切片的製作方法

（1）低溫恆冷箱冷凍切片製作法

1．本室現有Shandon As 620 E型恆溫箱冷凍切片機的主要性能。該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態，並可持續10mins。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部後面的製冷柵上的霜除掉，並可持續15mins。有照明鍵一個，啟動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個，當進行一周的工作或者一天的工作後，啟動該鍵，可對工作間進行消毒。當每天工作完畢時，可啟動密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進退鍵，兩個為微小進退鍵，還有一個手動旋鈕，調節修組織塊時的進退。

冷凍箱內左邊的冷凍台，溫度可達-60℃左右，冷凍箱的中間為一台切片機，工作間的溫度在0-30℃間可任意調節，並在箱面上的熒屏顯示出來。

2．操作方法及步驟：

①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。

②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放於冷凍台上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小台後，再放上細小組織，滴上包埋劑。

③將冷凍好的組織塊，夾緊於切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。

④調好欲切的厚度，根據不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。

⑤調好防卷板。製作冰凍切片，關鍵在於防卷板的調節上，這就要求操作者要細心，准確地將其調較好，調校至適當的位置。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。

⑥應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經固定的腦組織，肝組織和淋巴結時，冷凍箱中的溫度不能調太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調至-30℃。

3．冰凍切片時的注意事項：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片後就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘於刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放於不同的支承器上，於冷凍台上凍起來，然後依據不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。

③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂「砍柴看柴勢」，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。

④組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當冰凍發生時，這些水份就存留於組織中，形成了冰晶。

⑤當切片時，如果發現冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調高冰凍點。

⑥用於附貼切片的載玻片，不能存放於冷凍處，於室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由於兩種物質間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由於溫度相同，沒有發生上述的現象。

4．冰凍切片的快速染色法

冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定1分鍾後即可染色。以往，為了防止切片脫落，當切片附貼於載玻片後，即用電吹風吹乾後再固定。根據實驗對比認為這種做法欠妥未經固定的切片，強熱作用後，蛋白發生變性，核內含有的物質由於熱的作用融合在一起，染色後鏡下分辨不出核內的各種物質。冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細胞內各種物質都在沒有任何變化的情況下被固定起來，經一年多來1000例冰凍切片的製作實踐認為這樣製作固定切片好，核染色質清晰，核仁明顯，其他物質都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分鍾。

② 水洗。

③ 染蘇木素3－5分鍾。

④分化。

⑤ 於鹼水中返藍20秒。

⑥ 伊紅染色10－20秒。

⑦脫水，透明，中性樹膠封固。

冰凍組織1－2分鍾，切片1分鍾，固定1分鍾，染色共五分鍾。總共在10分鍾內完成快速製片過程，結果與石蠟切片不相上下。

冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法在目前來說已很少使用，因此在這里不作闡述。

I. 組織學常用切片技術的原理都是一樣的嗎

是的。
在組織學中，最常用到的有石蠟切片與冰凍切片。兩者各有優缺點，在實驗的應用上也有所不同，比如石蠟切老攜敗片常用於進行免疫組化實驗，冰凍切片常用於免疫熒光實驗。而兩個實驗都是應用免疫學基本原理——即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色隱前來確定組織細胞內蛋白質，對其進行定位、侍顫定性及相對定量的研究。
石蠟切片與冰凍切片在組織學中，蕞常用到的有石蠟切片與冰凍切片。

J. 誰有組織切片的製作過程

一、制備顯微標本的切片法
一石蠟包埋切片製作法
這是最常用的切片法。以石蠟作為組織的填充支持介質，將整塊組織加以包埋，最後凝固成均勻一致的固態結構。用切片機製取極薄的切片。為了讓石蠟能浸入組織內部，需將組織經過脫水等處理。過程大致如下：
⑴固定：生物標本脫離機體或培養環境，細胞會發生自溶，腐敗分解。因此，需用固定劑處理，使蛋白質凝固停止瀕死或死後變化。凡供永久保存的標本都需經固定處理。
常用的固定劑是甲醛、乙醇等，能使蛋白質凝固。還有由幾種試劑配成的固定液，例如Carnoy固定液，由無水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更強，不含水分，可避免水溶性物質如糖原等在固定過程中損失。
⑵脫水：是將組織細胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），濃度遞升到 100%。此過程還使組織塊進一步硬化。
⑶透明：是用既能溶於純酒精又能融解石蠟的有機溶劑，將組織中的酒精取代，以便石蠟浸入。通常用二甲苯（xylene）為透明劑。
⑷浸蠟：在溫箱內進行。已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，讓石蠟浸透組織，作為支持介質。
⑸包埋：將已浸蠟的組織塊放入熱融的包埋石蠟中，迅速冷凝，組織決便被蠟包埋。
⑹切片：用切片機。常用的切片機有輪轉式、平推式的。用輪轉式的易於切出連續切片。切片厚度隨製片目的而調整。教學標本厚度多是5~6μm。
⑺貼片烤乾：石蠟切片在溫水上展平後，移在玻片上，烤乾，即可供染色處理。染色後用樹膠、蓋坡片封固，可永久保存。
二冷凍切片法
冷凍切片法是借組織在低溫下，凍結變硬而達到符合切片要求。冷凍切片法需有冷凍切片機，或在普通切片上配製冷設施。恆冷切片機是高級冷凍切片設備。它有一個恆冷箱，標本致冷台和切片機都裝在箱內。恆冷箱的作用類似冰箱，可在一定范圍內調整溫度，其結構有利於保持箱內恆定低溫，減少箱門打開時環境溫度的干擾。切片機的輪轉把手裝在箱外，便於操縱切片。
冷凍切片法的優點是：在處理得當時，它可以最大限度地保持組織的新鮮狀態。並且，由於不需經脫水、透明、浸蠟等過程中有機溶劑的處理，及濕箱浸蠟熱的影響，甚至可不經固定。所以能很好地保存組織細胞的各種成分和酶的活性，因此在酶的組織化學研究中常用此切片法。
二、顯示標本結構成分的染色法
一蘇木素伊紅染色法（HE染色法）
為最常用的染色法。該法應用於各種組織的染色，是組織學技術的基本方法，對任何液體固定的組織和各種包埋的切片均可使用，只是對不同包埋的切片法處理略有不同。下面簡介石蠟包埋切片的HE染色法。
1、脫蠟：石蠟切片的組織內部充滿石蠟，不能使水溶性染液著色，因此在染色前必須首先用二甲苯將石蠟脫掉，共兩次。
2、下行入水：將已脫蠟的標本浸入無水酒精及各級酒精，使組織逐步接近水。3、蒸餾水略洗。
4、蘇木素溶液染色約5—15分鍾
5、自來水洗去多餘染料。
6、入稀釋的鹽酸酒精溶液中分色，邊分色邊鏡檢，至核呈紅紫色，細胞質無
色為合適。
7、分色後用自來水或加數滴氨水鹼化，直至細胞核變成藍色。這一步驟也可稱為「藍化」。
8、入蒸餾水洗去鹼性水分。
9、入70%酒精→80%酒精各5分鍾。
10、入伊紅染液染色30秒至數分鍾。
11、以95%酒精對伊紅分色，至胞漿，結締組織等呈桃紅色。
12、上行脫水：染色後的切片，因組織內含水而不透明，不能清晰地觀察其微細結構。因此，須將組織內的水分經各級酒精→無水酒精逐步置換，最後進入不含水份的透明劑內。
13、透明：入二甲苯透明劑，二次（各數分鍾）。
14、取出切片：將組織周圍多餘的二甲苯擦去，滴樹膠後加蓋玻片封固。
結果：細胞核藍紫色，胞漿、膠原纖維、肌纖維為桃紅色，嗜酸性顆粒為鮮紅色，彈性纖維呈明亮桃紅色。
二組織化學和細胞化學染色法
組織化學和細胞化學，是將物理和化學的技術運用到組織標本，用顯微鏡和化學分析方法來研究組織和細胞內的化學成分，並觀察該化學成分在組織、細胞內的定位、含量及其變化規律。這些化學成分借著化學反應所產生的不溶性著色物質來顯示。對於某些化學成分，例如：Fe++糖原、核酸等，可以用直接或間接的化學反應產生著色沉澱而顯示其部位和相對含量。對於酶類，顯示它的活性，須有該種酶的底物（被該種酶作用的物質），由酶對底物的分解，直接或間接地生成著色物質而被顯示。凡是在光學顯微鏡下觀察細胞原位顯示的化學物質，稱組織化學，若用電鏡觀察細胞原位化學成分的著色部位，則稱電鏡細胞化學，下面從原理方面簡要介紹幾種常用的組織化學染色技術：
1、顯示琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的硝基-BT法：
（Succinate dehydrogenase）
⑴酶的定位及生物學意義：
琥珀酸脫氫酶是線粒體標志酶，其存在於所有有氧呼吸的細胞，和線粒體內膜緊密結合。該酶不需輔酶而自身有黃素蛋白（FP,Flavoprotein）為輔基。在組化反應中常用來反映三羧酸循環的情況。其催化過程如下：
弱-單甲（紫紅色）
HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2四唑（甲）↓
（有色）強-雙甲（深紫藍色）
（琥珀酸）（黃素蛋白）
HOOC-CH=CH=COOHFPH2四唑（無色）
（延胡索酸）
⑵原理：上述的反應最後一步的原理是，硝基-BT（Nitro-blue tetrozolyum，四唑氮藍）系異環族化合物四唑鹽，當它接受氫時，本身被還原為有色沉澱產物（甲
）（Formazan）。
⑶孵育液配製：
A液（貯備液）
0.2M磷酸緩沖液（PH7.6）10ml等量混合
0.2M琥珀酸鈉（S01.succinate） 10ml備用
B液：
硝基四唑（Nitro-Br）2mg
2ml
0.2M磷酸緩沖液（PH7.6） 2ml
取：A液2ml
B液2ml孵育液
聚乙烯吡烷酮（PVP） 300mg
⑷方法：
①新鮮恆冷箱冷凍切片，厚6~8μm，平貼在蓋玻片上。
②滴染法：將有冷凍切片的蓋玻片（標本面朝上）平放於預熱好的培養皿中（底部墊一濕濾紙），滴加孵育液至全部覆蓋組織，於37℃溫箱中孵育45~60分鍾（肝，心肌組織15分鍾即可）。
③於生理鹽水中沖洗二次（輕晃，以防脫片）。
④10%福爾馬林生理鹽水固定10分鍾。
⑤15%酒精浸洗5分鍾（換二次）。
⑥甘油明膠封片。
⑸結果：酶活性強處呈藍色顆粒（雙甲沉澱），酶活性較低時形成紫紅色單甲。在光鏡下，該酶活性於肝小葉內分布呈明顯分帶現象，周邊帶強於中央帶。在心肌細胞縱切面，酶活性顆粒沿心肌細胞長軸整齊排列，相鄰心肌細胞的空白處為閏盤。

2、顯示葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的鉛法：
（Glucosel-phosphate phosphohydrolase）
①酶的定位及其生物學意義：
該酶主要位於內質網，是內質網的標志酶。G-6-Pase參與糖代謝，能水解葡萄糖-6-磷酸而釋放出葡萄糖和磷酸。
⑵原理：G-6-Pase將底物（葡萄糖-6-磷酸鉀鹽）水解產生磷酸離子，後者被孵育液中的硝酸鉛所捕獲，最終反應物為顆粒狀的硫化鉛沉澱，其反應式如下：
酶Pb(NO3)2
葡萄糖-6-磷酸鉀+H2O葡萄糖+磷酸

(NH4)2S
Pb2(PO4)2PbS↓
(無色)（棕色）
（試劑配製及方法詳見組織學技術專著）
⑶結果：酶活性部位呈棕色硫化鉛顆粒沉澱。在光鏡下G-6-Pase活性顆粒較均勻地分布於胞質中。
3、顯示鹼性磷酸酶（APL）的鈣鈷法（Alkaline phosphohydrolase）
⑴酶的定位及其生物學意義：
ALP在鹼性環境下能催化各種醇和酚的磷酸酯水解，參與磷酸根的跨膜轉運過程，並有磷酸轉移的作用，故在細胞膜上運輸較活躍，如毛細血管內皮細胞，腎近曲小管刷狀緣，腸上皮紋狀緣等處，該酶的活性較高。
⑵原理：ALP將磷酸鹽底物（如β-甘油磷酸鈉等）分解產生磷酸根離子，後者為孵育液中的氯化鈣捕獲生成磷酸鈣沉澱，但該沉澱為非金屬鹽，需加入硝酸鈷，使其生成磷酸鈷沉澱，因無色，再需通過硫化銨處理，形成棕黑色硫化鈷沉澱而被顯示。在PH9.2—9.4環境中表現最大活性。反應式如下：
ALPCa++
β-甘油磷酸鈉磷酸離子Ca2(PO4)2

Co(NO3)2(NH4)2S
CO2（PO4）2CoS↓
（無色）（棕黑色）
⑶結果：酶活性部位為棕黑色CoS沉澱。
4、顯示核酸的甲綠一派喏寧（Methyl green-pyronln）染色：
⑴原理：甲綠和派喏寧都是鹼性染料，對兩種核酸（DNA和RNA）能分別染色，其機制可能在於兩種核酸分子都是多聚體，但聚合程度有所不同。甲綠具有兩個帶電荷的氨基，而派喏寧只有一個。因此在混合的染液中，二者競爭的結果是甲綠易與聚合程度較高的DNA結合呈現藍綠色，而派喏寧則與聚合程度較低的RNA結合呈現紅色。
（試劑制備及方法詳見組織學技術專著）
⑶結果：核內DNA呈藍綠色，核仁及胞質內RNA呈桃紅色。
5、顯示糖原的過碘酸雪夫氏（PAS）反應：
⑴原理：糖原是一種動物多糖，無色，富含於肝細胞和肌細胞胞質中。PAS反應（Periodic acid schiff Reaction）能在糖原所在部位生成紫紅色物質，從而將之顯示。RAS反應分為兩步：首先是強氧化劑過碘酸（Periodic acid,分子式為HIO4），將糖原中的葡萄糖分子的C-C鍵打開，將CHOH-CHOH氧化，生成二醛基，然後Schiff試劑中的無色亞硫酸品紅分子與糖的醛基結合，生成新的紫紅色復合物。
HIO4schiff試劑
多糖醛基紫紅色反應產物
（氧化）
（試劑配製及方法詳見組織學技術專著）
⑵結果：糖原呈紫紅色顆粒狀。