㈠ 雙層平板法測噬菌體效價的優缺點
雙層平板法的優點:
①加了底層培養基後，可使原來底面不平
的玻璃皿的缺陷得到了彌補;
②所形成全部噬菌悶培體斑都接近處於同一平面上，因此不僅每一-噬菌斑的大小接近、邊緣清晰，而且不致發生上下皮答噬菌斑的重疊現象;
③因上層培養基中瓊脂較稀，故形成的燃罩慧噬菌斑較大，更有利於計數。
㈡ 微生物學基礎，微生物的特徵檢查噬菌體有哪些方法
5 方法
5.1 噬菌體的檢查
5.1.1 樣品採集
將2～3g土樣或5mL水樣（如陰溝污水）放入滅菌三角瓶中，加入對數生長期的敏感指示菌（大腸桿菌(Escherichia coli)）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉湯蛋白腖培養液。
5.1.2 增殖培養
30℃振盪培養12～18h, 使噬菌體增殖。
5.1.3 離心分離
將上述培養液以3000rpm離心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白腖水稀釋至10-2～10-3，用於噬菌體檢查及效價測定。
5.1.4 生物測定法
5.1.4.1雙層此凳瓊脂平板法
5.1.4.1.1 倒下層瓊脂
融化下層培養基，倒平板（約10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上層瓊脂
融化上層培養基，待融化的上層培養基冷卻至50℃左右時，每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌(Escherichia coli)) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合後立即倒入上層平板鋪平。
5.1.4.1.3恆溫培養
30℃恆溫培養6～12h觀察結果。
5.1.4.1.4 觀察結果
如有噬菌體，則在雙層培養基的上層出現透亮無菌圓形空斑──????噬菌斑。
5.1.4.2 單層瓊脂平板法
省略下層培養基，將上層培養基的瓊脂量增加至2%，融化後冷卻至45℃左右，如同上法加入指示菌和檢樣，混合後迅速倒平板。30℃恆溫培養6～16h後觀察結果。
5.1.5 離心分離加熱法（快速檢查）
取大腸桿菌(Escherichia coli)正常培養液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌(Escherichia coli)培養液，4000rpm離心20min，分別取兩組發酵液的上清液(A1)，一部分於721分光光度計上測定OD650光密度值，另外各取5mL上清液於試管中，置水浴中煮沸2min（A2），檢測A2溶液OD650光密度值，記錄結果。
5.2 噬菌體效價的測定
5.2.1 倒平板
將融化後冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白腖固體培養基傾倒於11個無菌培養皿中，每皿約傾注10mL培養基，平放，待冷凝後在培養皿底部註明噬菌體稀釋度。
5.2.2 稀釋噬菌體
按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸桿菌(Escherichia coli)噬菌體，注入一支裝有4.5mL1%蛋白腖水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。
5.3 噬菌體與菌液混合
將11支滅菌空試管分別標記10-4、10-5、10-6和對照。森漏旅分別從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL於上述編號的無菌試管中，每個稀釋度平行做三個管，在另外兩支對照管中加0.1mL無菌水，並分別於各管中加入0.2mL大腸桿菌(Escherichia coli)菌懸液，振盪試管使菌液與噬菌體液混合均勻，置37℃水浴中保溫5min，讓噬菌體粒子充分吸附並侵入菌體細胞。
5.4.4 接種上層平板
將11支融化並保溫於45℃的上層肉膏蛋白腖半固體瓊脂培養基5mL分別加入到含有噬菌體和敏感菌液的混合管中，迅速搓勻，立即倒入相應編號的底層培養基平板表面，邊倒入邊搖動平板使其迅速地鋪展表面。水平靜置，凝固後置37℃培養。
5.5 觀察並計數
觀察平板中的噬菌斑，並將結果記錄於實驗報告表格內，選取每皿有30～300個噬菌斑的平板計搜睜算噬菌體效價。
計算公式： N=Y/V?X
（N：效價值，Y：平均噬菌斑數／皿，V：取樣量，X：稀釋度）
例如：當稀釋度為10-6時，取樣量為0.1 mL/皿，同一稀釋度中3個平板上的噬菌斑的平均值為186個，則該樣品的效價為：N＝186／0.1×10-6＝1.86×109。
6 結果
6.1 噬菌體檢查
6.1.1離心分離加熱法
處理方法 OD650光密度值
正常發酵液（對照） 異常發酵液（試驗）
離心上清液(A1)
離心上清液加熱煮沸後(A2)
A2/A1
6.1.2 繪出平板上的噬菌斑檢測結果，指出噬菌斑和宿主細菌。
6.2 噬菌體效價測定
6.2.1 平板上噬菌斑數目
噬菌體稀釋度 10-4 10-5 10-6 對照
噬菌斑數（個）/皿
平均每皿噬菌斑數目
6.2.2 計算噬菌體效價(即噬菌斑形成單位pfu, plague-forming unit).
7 思考
1有哪些方法可檢查發酵液中確有噬菌體存在？比較其優缺點。
2測定噬菌體效價的原理是什麼？要提高測定的准確性應注意哪些操作？
3噬菌體與菌液混合後保溫時間越長其吸附率越高的說法對嗎？
回復
吸收率：在噬菌體和過量菌液混合後，菌/噬菌體混合液中未感染的噬菌體顆粒經過氯仿處理後，在不同時間點檢測其數量。一般情況下幾分鍾內噬菌體即可大部分吸附到宿主菌上.
潛伏期：細菌與噬菌體混合作用5分鍾後，徹底清洗以除去未結合的噬菌體。然後用新鮮的培養基重懸至相同體積。該重懸液在370C下孵育，其間有規則地收集噬菌體測滴度。
裂解量指的是單個宿主細菌被噬菌體完全裂解後所釋放的噬菌體數量.具體檢測方法本人也不是很清楚.
㈢ 擴毒時如何保證效價
保證效價的步驟：
一步生長曲線的實驗方法如下：先把在對數期生長的敏感細菌懸浮液與適量的噬菌體混合，通常噬菌體和細菌的混合比例為1:10，避免幾個噬菌體同時侵染毀知芹一個細菌細胞。經數分鍾吸附後，混合液中加入一定量的該噬菌體的抗血清，以中和尚未吸附的噬菌體。然後再用培養液進行高倍稀釋，以免發生第二次吸附和感染。培養後定時取樣，將含噬菌體的樣品與敏感猛念細菌混合，在平板上培養，計算噬菌斑數。結果可見，在吸附後的開始一段時間內（5～10min），噬菌斑數不見增加，說明噬菌體尚未完成復制和組裝，這段時間稱為噬菌體的潛伏期。緊接著在潛伏期後的一段時間（感染後20～30min），平板中的噬菌斑數突然直線上升，表示噬菌體已從寄主細胞中裂解釋放出來，這段時間稱為裂解期。每個被感染的細菌釋放新的噬菌體的平均數稱為裂解量。當宿主全部裂解，溶液中的噬菌體的效價達到最高點時稱為平穩期。
定量描述烈性噬菌體生長規律的實驗曲線。其基本步驟是用噬菌體的稀懸液感染高濃度的宿主細胞，以保證每個細胞至多不超過纖畢一個噬菌體吸附。數分鍾後中止吸附並稀釋後置於該細菌最適生長溫度下培養。在一定時間內，每隔數分鍾取樣作效價測定。以效價為縱坐標，培養時間為橫坐標所繪成的曲線即為一步生長曲線，它可以反映每種噬菌體的三個最重要的特性參數：潛伏期、裂解期、裂解量
㈣ 什麼是噬菌體效價如何測定
噬菌體效價--------指噬菌體的濃度,即每毫升樣品含噬菌體的個數.通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑進行噬菌體的計數,以每毫升中含有的噬菌斑形成單位(plaque
forming
unit/ml或pfu/ml)表示其效價.
例如,若每塊平皿加1
l稀釋106倍的樣品,可形成10個噬菌斑,則噬菌體效價為1010pfu/ml.(106*10*1000=1010;1ml=1000ml)
㈤ 測定噬菌體效價時,其他細菌的菌落是否會影響
不會。
噬菌體的效價就是一毫升培養液中所含活噬菌體的數量。效價測定的方法，一般應用雙層瓊脂平板法。由於含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，一個噬菌體產生一個噬菌體斑，因此，能進行噬菌體的計數。
操作步驟
1稀釋噬菌體
2、噬菌體與菌液混合
3、混合液加入上層培養基內
4、接了種的上層培養基倒入底層平板上。
5、觀察平板中的噬菌斑，將每一稀釋度的噬菌斑數目記錄於實驗報告表格內，並選取30—300個噬菌斑的平板計算每毫升未稀釋的原液的噬菌體數（效價）。
噬菌體效價=噬菌斑數*稀釋倍數*10
㈥ 測定噬菌體效價需要嚴格控制哪些關鍵步驟
1.系列轎毀啟稀釋,即梯度稀釋時,要換槍頭,確保稀釋准確
2.做平行試驗,每個稀釋度的倒3個平板
3.摸索噬菌斑大小的條閉如件,避免出現針尖狀的余凱噬菌斑
㈦ 什麼是噬菌體效價,簡述雙層平板法的原理與主要操作
噬菌體的分離純化及效價的測定
1
目的
1.1
了解噬菌體效價的含義及其測定原理。
1.2
學會檢查噬菌體的方法。
1.3
掌握用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價的操作技能。
2
原理
噬菌體是一類專性寄生於細菌和放線菌等微生物的病毒，
其個體形態極其微小，
用常規
微生物計數法無法測得其數量。
當烈性噬菌體侵染細菌後會迅速引起敏感細菌裂解，
釋放出
大量子代噬菌體，
然後它們再擴散和侵染周圍細胞，
最終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變
清，
或在含有敏感細菌的平板上出現肉眼可見的空斑──噬菌斑。
了解噬菌體的特性，
快速
檢查、分離，並進行效價測定，對在生產和科研工作中防止噬菌體的污染具有重要作用。
檢樣可以是發酵液、空氣、污水、土壤等（至於無法采樣而需檢查的對象，可以用無菌
水浸濕的棉花塗拭表面作為檢查樣品）
。為了易於分離可先經增殖培養，使樣品中的噬菌體
數量增加。
採用生物測定法進行噬菌體檢查，
約需
12h
左右，
因而不能及時判斷是否有噬菌體污染。
通過
快速檢查可大致確定是否有噬菌體污染
，
以採取必要的防治措施。
根據
正常發酵
（培養）
液離心後菌體沉澱，
上清液蛋白含量很少，
加熱後仍然清亮；
而侵染有噬菌體的發酵
（培養）
液經離心後其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，
加熱後發生蛋白質變性，
因而在
光線照射下出現丁達爾效應而不清亮
。
此法簡單、
快速，
對發酵液污染噬菌體的判斷亦較准
確。
但不適於溶源性細菌及溫合噬菌體的診斷，
對
侵染噬菌體較少的一級種子培養液
也往往
不適用。
噬菌體的效價即1
mL
樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數。效價的測定一般採用雙層瓊
脂平板法。
由於在含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，
一般一個噬菌體產生一個噬菌斑，
故可
根據一定體積的噬菌體培養液所出現的噬菌斑數，
計算出噬菌體的效價。
此法所形成的噬菌
斑的形態、大小較一致，且清晰度高，故計數比較准確，因而被廣泛應用。
㈧ 查氏培養基的基本原理
實驗一 常用培養基的制備、滅菌與消毒
一、實驗目的
了解培養基的配製原理；掌握配製培養基的一般方法和步驟；了解常見滅菌、清毒基本原理及方法；掌握乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌及過濾除菌的操作方法。
二、實驗原理
培養基是人工按一定比例配製的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養物質的混合物。培養基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素和水。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養基也有不同的種類和配製方法。
牛肉膏蛋白腖培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。由於這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質，所以可供微生物生長繁殖之用。
乾熱天菌、高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。
三、試劑與器材
1.器材 試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、培養基、分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH度紙、棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布、吸管、培養皿、電烘箱、注射器、微孔濾膜過濾器、鑷子等。
2.試劑 牛肉膏、蛋白腖、NaCl、瓊脂
四、實驗內容
1.稱量→溶化→調pH→過濾→分裝→加塞→包紮→滅菌→無菌檢查
2.乾熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恆溫→降溫→開箱取物
3.高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恆壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4.過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
五、關鍵步驟及注意事項
1.要嚴格按配方配製。
2.調pH不要過頭。
3.乾熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70ºC以下放物、取物。
4.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱後排除冷空氣，到時降壓回零取物。
5.過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時，壓力要適當，不可太猛太快，濾膜要注意清洗保存。
六、思考題
1.培養基配好後，為什麼必須立即滅菌?如何檢查滅菌後的培養基是無菌的?
2.在配製培養基的操作過程中應注意些什麼問題?為什麼?
3.培養微生物的培養基應具備哪些條件?為什麼?
4.培養基的配製原則是什麼?
實驗二
土壤中微生物分離純化培養
一、實驗目的
掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養基和液體培養基中的生長特徵；進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術；掌握微生物培養方法。
二、實驗原理
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法，稀釋塗布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法 稀釋塗布平板法步驟：倒平板－制備土壤污水稀釋液－塗布－培養－挑菌落；平板劃線法步驟：倒平板－標記培養基名稱－劃線。
三、試劑與器材
1.器材 盛9m1無菌水的試管、盛90m1無菌水並帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃塗棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、無菌培養皿、顯微鏡、血細胞計數板等。
2.試劑 牛肉膏蛋白腖培養基，高氏1號培養基，查氏培養基
四、實驗內容
1.土壤稀釋液的制備
2.微生物分離純化：稀釋塗平板法，平皿劃線分離法，微生物培養技術
五、關鍵步驟及注意事項
1.掌握含菌培養基的配製，嚴格控制溫度。
2.平板劃線應防止染菌，同時應注意劃線深度及密度。
六、思考題
1.如何確定平板上某單個菌落是否為純培養?請寫出實驗的主要步驟。
2.如果要分離得到極端嗜鹽細菌，在什麼地方取樣品為宜?並說明理由。
實驗三
菌種保藏
一、實驗目的
1.學習並掌握菌種保藏的基本原理。
2.掌握常用的幾種不同的菌種保藏方法。
二、實驗原理
微生物個體微小、代謝旺盛、生長繁殖快，如果保存不妥容易發生變異和雜菌污染，甚至導致細胞死亡等現象。因此，保存好菌種是非常必要和重要的。常用的菌種保藏方法包括傳代培養法、載體法、懸液法、冷凍法和真空乾燥法
三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌、青黴菌、放線菌
2.試劑 液體石蠟、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、乾冰
3.器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養皿；安額管、凍干管、40目與100目篩子、油紙、濾紙條(0.5X1.2cm)、乾燥器、真泵器、真空泵、真空壓力表、噴燈、L形五通管、冰箱、低溫冰箱(—30℃)、超低溫冰箱和液氮罐等。
四、實驗內容
1.斜面保藏法
2.液體石蠟法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷凍真空乾燥保存法
五、關鍵步驟及注意事項
1.清楚各種保藏方法的優缺點，針對不同要求選擇適宜的保藏方法。
2.熔封安瓶時防止封閉不嚴。
3.液氮凍存操作應防止凍傷。
六、思考題
根據你自己的實驗。談談1--2種菌種保藏方法的利弊?
實驗四
細菌形態觀察及單染色
一、實驗目的
1.了解簡單染色法的原理，並掌握其操作方法。
2.學習並掌握微生物塗片、染色的基本技術和無菌操作技術。
3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法。
4.初步認識細菌的形態特徵。
二、實驗原理
細菌個體微小，且較透明，必須藉助染色法使菌體著色，與背景形成鮮明的對比，以便在顯微鏡下進行觀察。根據實驗目的不同，可分為簡單染色法、鑒別染色法和特殊染色法等。簡單染色法是最基本的染色方法，是利用單一染料對細菌進行染色。此法操作簡便，適用於菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用鹼性染料進行簡單染色。
三、試劑與器材
1.材料 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌
2.試劑 呂氏鹼性美藍染液(或草酸銨結晶紫染液)、齊氏石炭酸復紅染液。
3.器材 顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環、雙層瓶(內裝香柏油和二甲苯)等。
四、實驗內容
簡單染色法：塗片→乾燥→固定→染色→水洗→乾燥→鏡檢
五、關鍵步驟及注意事項
1.塗片時，生理鹽水及取菌不宜過多，塗片應盡可能均勻，
2.水洗步驟水流不宜過大，過急，以免塗片薄膜脫落。
六、思考題
1.你認為制備細菌染色標本時，尤其應該注意哪些環幣?
2.為什麼要求製片完全乾燥後才能用油鏡觀察?
3.如果你的塗片未經熱固定，將會出現什麼問題?如果加熱溫度過高、時間太長，又會怎樣呢?
實驗五
放線菌及黴菌形態觀察
一、實驗目的
1.了解放線菌、黴菌形態觀察的原理。
2.學習並掌握觀察放線菌、黴菌形態的操作方法。
3.初步了解放線菌、黴菌的形態特徵。
二、實驗原理
放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養基表面或深入培養基內生長的叫基內菌絲(簡稱「基絲」)，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱「氣絲」)，並進一步分化產生孢子絲及孢子。有的放線菌只產生基絲而無氣絲。在顯微鏡下直接觀察時，氣絲在上層、基絲在下層，氣絲色暗，基絲較透明。孢子絲依種類的不同，有直、波曲、各種螺旋形或輪生。
黴菌可產生復合分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生孢子。黴菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態特徵是識別不同種類黴菌的重要依據。黴菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。人們設計了各種培養和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態下的形態特徵。本實驗採用插片法。
插片法：將放線菌接種在瓊脂平板上，插上滅菌蓋玻片後培養，使放線菌菌絲沿著培養基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上。觀察時，輕輕取出蓋玻片，置於載玻片上直接鏡檢。這種方法可觀察到放線菌自然生長狀態下的特徵，而且便於觀察不同生長期的形態。
三、試劑與器材
1.材料 黑麴黴、青黴和根霉，細黃
㈨ 生物 求解 請問效價該怎麼計算
噬菌體效價=噬菌斑數×稀釋倍數×10。
噬菌體的效價就是一毫升培養液中所含活噬菌體的數量。在使用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價時，由於在含有特異宿主細菌的瓊脂平板上，一個噬菌體產生一個噬菌斑，因此，能進行噬菌體的計數。但因噬菌斑計數方法其實際效率難以接近100%(一般偏低，因為有少數活噬菌體可能未引起感染)，所以為了准確地表達病毒懸液的濃度(效價或滴度)一般不用病毒粒子的絕對數量而是用噬菌斑形成單位(Plaque-forming units,簡寫成pfu)表示。
㈩ 噬菌體檢測上限
噬菌體效價的測定5.2.1 倒平板將融化後冷卻到45℃左右的下層肉膏蛋白腖固體培養明緩仿基傾倒於11個無菌培養皿中，激纖每皿約傾注10mL培養基，平放，待冷凝後在培養皿底部註明噬菌體稀釋度。5.2.2 稀釋噬菌體按10倍稀釋法，吸取0.5mL大腸桿菌噬菌體，注入一支裝有4.5mL 1%蛋白腖水的試管中，即稀釋到10-1，依次稀釋到10-6稀釋度。5.3 噬哪孫菌體與菌液混合將11支滅菌空試管分別標記10-4，10-5，10-6和對照。分別從10-4，10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取0.1mL於上述編號的無菌試管中，每個稀釋度平行做3個管，在另外2支對照管中加0.1