用於測定抗體最常用的方法是

❶ 艾滋病抗體的檢查方法

艾滋病病毒抗體檢測
艾滋病病毒抗體檢測：檢測血液中的艾滋病病毒抗體是目前最常用的檢測艾滋病病毒感染的實驗室方法，一般要經過兩個步驟：首先做初篩試驗，如果為陽性，再做確認試驗，確認試驗陽性才可診斷為艾滋病病毒感染。
常用的方法有：
1病原檢測病原檢測主要指用病毒分離培養、電鏡形態觀察、病毒抗原檢測和基因測定等方法從宿主標本中直接檢測病毒或病毒基因。由於前兩種方法難度大，且需要特殊設備和專業技術人員。因此僅抗原檢測和RT-PCR(反轉錄－PCR)可用於臨床診斷。
2 抗體檢測血清中HIV抗體是判斷HIV感染的間接指標。根據其主要的適用范圍，可將現有HIV抗體檢測方法分為篩檢試驗和確證試驗。
3 確證試劑篩檢實驗陽性血清的確證最常用的是Western blot（WB），由於該法相對窗口期較長，靈敏度稍差，而且成本高昂，因此只適合作為確證實驗。隨著第三代和第四代HIV診斷試劑靈敏度的提高，WB已越來越滿足不了對其作為確證實驗的要求。FDA批準的另一類篩檢確證試劑是-免疫熒光-試驗（IFA）。IFA比WB的成本低，而且操作也相對簡單，整個過程在1-1.5小時內即可結束。此法的主要缺點是需要昂貴的熒光檢測儀和有經驗的專業人員來觀察評判結果，而且實驗結果無法長期保存。現在FDA推薦在向WB不能確定的供血員發布最終結果時以IFA的陰性或陽性為准，但不作為血液合格的標准。
4篩檢試驗篩檢試驗主要用於對供血員進行篩查，因此要求操作簡便，成本低廉，而且靈敏、特異。目前世界上主要的篩檢方法仍然是ELISA，還有少數的顆粒凝集試劑和快速ELISA試劑。ELISA有很高的靈敏度和特異性，操作簡單，僅需要實驗室配備酶標儀和洗板機即可應用，特別適合於試驗室大規模篩檢使用。顆粒凝集實驗是另一種操作簡單方便，成本低廉的檢測方法，該方法結果可通過肉眼判定，靈敏度很高，特別適合發展中國家或大量篩選供血員時使用，缺點是必須使用新鮮樣品，特異性較差。80年代後期發展起來的斑點印跡檢測（Dot-blot assay）是一種快速ELISA（Rapid ELISA）方法，這種方法操作極為簡便，過程短暫，整個過程多數在5-10分鍾內甚至3分鍾內即可結束，但該法比ELISA和顆粒凝集試劑昂貴得多。金免疫測定是以膠體金為標記物，以硝酸纖維素膜為載體的固相免疫測定，分為滲濾和層析兩種形式。用於HIV抗體檢體金試紙條屬於金免疫層析，且大多數為間接法及雙抗原夾心法，兩種方法各有優缺點，但都簡單而快速，數分鍾即可得出結論，不需儀器設備，操作人員不需特殊訓練，試劑穩定，適用於單份測定等。

❷ 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

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• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

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• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

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• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

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• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

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• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

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• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

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• 4.競爭法測抗體

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• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

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• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

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• 5.競爭法測抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

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• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

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• 1.雙抗體夾心法測抗原

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• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

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• 4）加底物顯色

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• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

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• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

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• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

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• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

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• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

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• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

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• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

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• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

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• 6.捕獲包被法測抗體

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• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

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• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

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❸ 抗體效價怎樣檢查

醫院測抗體一般是用ELISA方法。靈敏度很高的。
在其他地方，還有血凝抑制試驗，瓊脂擴散試驗，抗體蛋白純化定量，抗體活性檢測等。
根據要求不同，選擇不同的方法，現在醫院最常用。使用方便的就是ELISA試劑盒。
原理是:在反應板上包上抗原，然後加入檢測樣品液(血清，組織液等，需要處理一下)，如果檢測樣品中有抗體，就可以與抗原結合，再加入酶標記的抗抗體，就可以和樣品中抗體結合，加入顯色劑，顯色後，檢測，通過吸光度的多少，確定抗體的含量。

❹ ELISA檢測方法的原理及其優缺點是什麼

ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用於檢測抗體的間接法(圖a)、用於檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用於檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
優點：操作方便，實驗可靠，缺點：暫未發現

❺ 免疫學的檢測方法

免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫。

❻ elisa試劑盒實驗原理

上海科艾博生物（COIBO）科技
從大的方面說ELISA屬於酶免疫技術。 免疫酶技術是將酶作為標記物，標記抗體或抗原後，與相應的抗原或抗體發生反應，通過標記酶相應底物的顏色反應作抗原抗體的定性和定量的檢測依據。
目前應用最多的免疫酶技術是酶聯免疫吸附實驗（ELISA），如果要分類的話，它屬於異相固相酶免疫技術。所謂異相是指在檢測時不需要將酶標記抗原抗體和游離抗原抗體分開，所謂固相就是指的ELISA的96孔板固相載體了。看下面均相酶免疫測定的原理圖：
ELISA的主要原理很簡單，有這么三個， 1、包被 抗原或者抗體能以物理性吸附於固相載體表面，可能原理是蛋白質和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之後能保持抗原抗體反應等免疫活性； 2、標記 抗原或者抗體可通過共價鍵與酶連接成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點； 3、顯色 酶結合物與相應包被在固相載體的抗原或者抗體結合後，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之後可出現顯色反應，根據反應的顏色深淺可計算抗原或者抗體的相對含量。ELISA 實驗設計根據檢測對象的不同，我分別給童鞋們介紹抗原的檢測方法設計和抗體的檢測方法設計。抗原的檢測設計 1、雙抗夾心法 針對至少2個抗原決定簇的多價抗原。首先介紹一下抗原決定簇，抗原決定簇就是決定抗原性的特殊化學基團，也叫抗原表位，理論上一個抗原決定簇能誘導產生一種單克隆抗體（可能有童鞋又要問單克隆抗體是神馬東東了，以後介紹啊）。由6－12氨基酸或碳水基團組成，它可以是由連續序列（線性表位）組成或由不連續的蛋白質三維結構（構象表位）組成。臨床上具有2個抗原決定簇的多價抗原有很多，比較常見有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。檢測步驟也簡單，就是包被、洗滌、加樣、洗滌、加樣、洗滌、顯色。具體說來是先將純化的相應抗體包被在固相載體上，再加入待測樣品，若其中含有待測抗原就會與固相抗體結合，洗掉雜質後，再加入酶標記的檢測抗體進行反應，洗掉多於的酶標抗體後，加入底物顯色，顯色與否以及顏色的深淺就代表了待測抗原是否存在以及相對含量了，簡單吧。
對於雙抗夾心法檢測大分子抗原要注意幾點，1.固相抗體和酶標檢測抗體一定是分別針對待測抗原的兩個不同抗原決定簇，不然兩個抗體就會為爭同一個決定簇而打架，會出現假陰性的不良結果；2.如果檢測的樣本是血清，就要注意風濕病患者體內內風濕因子RF這種奇葩異種抗體的存在，它能夠神奇地結合固相抗體和檢測抗體，造成假陽性的不良結果；3.包被的固相抗體含量一定是高於樣品中的抗原含量，不然檢測到的含量會比實際含量低；4.如果有童鞋想高端省事一些，將待測樣品與酶標檢測抗體同時加入固相載體，在酶標檢測抗體高於樣品中的待測抗原的情況下，會出現假陰性結果，這種現象書本叫鉤狀效應。 2、競爭法 針對小分子抗原。這種方法也可以用於大分子抗原，只是相對雙抗夾心法這種強悍的策略，競爭法完全沒有優勢，所以競爭法只在檢測小分子這個邊緣地帶發揮余熱了。臨床上主要用於T3、T4、孕酮等激素以及葯物等。檢測步驟與雙抗夾心法更簡單，包被、洗滌、加樣、洗滌、顯色，少了一步加樣的過程，但是設計上復雜一些，首先將純化的相應抗體包被在固相載體上，然後每組樣本需要分兩組，一組同時加入事先混勻好的酶標檢測抗原和樣本的混合物，一組只加入酶標記抗原，兩組顏色只差便是待測抗原的含量，有點暈啊。
對於競爭法也需要注意一點，酶標記抗原和待測樣本一定要事先混勻好，然後同時加入固相載體，不然會造成不公平競爭，檢測出現偏差；抗體的檢測設計 就方法來說，有間接法、雙抗原夾心法、競爭法和捕獲法四種設計。 1、 間接法，這個是檢測抗體最常用也最簡單的方法。操作步驟與雙抗夾心一樣，只是包被是純化的相應抗原而不是抗體了，加入樣品後洗滌，再加入的酶標記抗抗體，然後顯色，顏色深淺與樣品中待測抗體的濃度正相關。這個間接法的原理和步驟與雙抗夾心一樣一樣的，為了區分就把包被抗原檢測抗體叫做間接法了，以此類推，之前的雙抗夾心法也可以叫做直接法，命名其實就是這么回事，規則多了就容易讓人糊塗。間接法也有一些自己的特點，1.酶標記抗抗體可選擇性檢測抗體的亞型，可用於鑒別感染時期，如果是IgM那麼提示感染早期；2.酶標抗抗體檢測抗體特異性不高，容易產生假陽性，如果封閉不完全，可出現全板陽性，挺嚇人的。臨床上常用該方法檢測抗HCV抗體、抗HEV抗體、抗CMV抗體、抗HSV抗體、抗沙眼衣原體抗體等等。
2、 雙抗原夾心法，這個完全是山寨雙抗夾心法的。原理和步驟也與雙抗夾心一樣一樣的，與間接法相比，具有優越的靈敏度和特異性，但不是很常用，因為就目前的技術條件，想得到能用於ELISA檢測的純化抗原還是有一定的難度。臨床上常用於檢測HIV抗體初篩，TP抗體和抗HBs抗體等，這些檢測對特異性和靈敏度，准確性都要求特別高。
3、 競爭法，和檢測抗原設計的競爭法完全一致，臨床上用的不多，我仔細總結了一下兩個很具有代表性的，也各具特點。1、抗HBc抗體，檢測方法與抗原相同，包被抗原之後，分兩組，一組加入預先混勻的酶標抗體和待測樣品，一組只加入酶標抗體，兩組的顯色之差可代表待測抗體的相對含量，需注意的是待測抗體與酶標抗體是同一物質；2、抗HBe抗體檢測，方法與抗原競爭法設計稍有區別，包被的抗HBe抗體後，檢測也分兩組，一組先加入酶標HBeAg再立即加入待測樣品，一組只加酶標HBeAg，兩組顯色之差代表待測抗體的相對含量，這種設計中包被抗體和待測抗體是同一物質。值得注意的是混合組不是事先混勻再加入，而是先加入待測抗體後再加入酶標抗原。所有的這些復雜的注意事項確實很容易把人搞暈，但是童鞋們只需要記住一條，競爭很殘酷，我們就要想盡一切辦法保證競爭的公平性，這樣就不會錯。
4、 捕獲法，這種方法比較少用，由於具有識別抗體類型的優點，僅用於需要早期診斷的急性感染或者具有爆發性感染的疾病，如HAV-IgM、HBc-IgM、ToRCH等等。原理還是逃不脫經典的雙抗夾心，具體方法是先包被能識別抗體類別的抗抗體，洗滌後加樣品，再洗滌，加酶標記抗原，洗滌後顯色，這些步驟閉上眼睛都能寫出來。

最後說兩句，與抗原檢測不同，抗體檢測的設計不是根據抗體的結構特點了，這么多種設計方法，童鞋們用的時候就會選擇障礙了，掌握2個原則，1.實驗要求，如果需要特異性和准確性特別高，那肯定是雙抗原夾心法，要求馬馬虎虎，那就間接法，如果要明確抗體類型，最好的選擇就是捕獲法了；2.實驗成本，與純化抗體不一樣，有時候想要獲得純化的抗原是非常困難的，更別說兩種不同的純化抗原了，所以雙抗原夾心法臨床上用的並不多。ABS-ELISA順便說一下ABS-ELISA設計，其實是和上面說的一樣的，通過親和素-生物素系統（ABS）方法顯色反應，增加檢測靈敏度而已，但是增加操作步驟與實驗成本，而且現在單克隆抗體的技術越見成熟，抗體特異性和親和力大大提高，靈敏度已經不是問題，所以這些次等裝備已經不常用。
結果判定最後和童鞋說說ELISA結果判定，分定性和定量兩種。對於定性試驗，參比陰、陽性對照的吸光度，以P/N或者S/CO比值形式報告。1. P/N比值是指（待測樣本-空白對照）/（陰性樣本-空白對照），一般以P/N≥2.1判為陽性，或許求知慾旺盛的童鞋會問，那麼競爭法用P/N比值怎麼判，呵呵，這里先不說，賣個乖，你可以網路或者私信我啊；2. S/CO比值，S是待測樣本吸光度值，CO為CUT-OFF值，通常取值陰性對照平均值的2.1倍。S/CO比值≥1為陽性，競爭法S/CO比值≤1為陽性。定量檢測沒有什麼可說的，老老實實做標准曲線，既鍛煉實驗操作能力，又可作為實驗內部參照。
記得有這么個規定，定性檢測不能目測判斷，要憑借酶標儀檢測，定量要在每次實驗都得與待測樣本相同實驗條件下繪制標准曲線，有一難度，但是為了對實驗負責，你就從了吧。

❼ 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同應用有什麼異同

ELISA的類型
ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：
1.雙抗體夾心法測抗原
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。
3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
2.雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。
3.間接法測抗體
間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
4）加底物顯色
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。
4.競爭法測抗體
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。
5.競爭法測抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法。
6.捕獲包被法測抗體
IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。
類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。
7.ABS-ELISA法
ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。

❽ 酶聯免疫反應的過程是什麼樣的

基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

（一）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

（二）雙位點一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

（三）間接法測抗體

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。

（四）競爭法

競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

（五）捕獲法測IgM抗體

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：

（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。

（六）應用親和素和生物素的ELISA

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。

親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。