目前核酸提取常用方法

『壹』 核酸的檢測

核酸的檢測其實可以檢測出部分病毒，比如艾滋病和新型冠狀病毒之類的，不過核酸的檢測在檢測前是有注意事項的，比如能不能吃東西，能不能抽煙喝酒等等，這都可能影響檢測結果，接下來我們來具體了解一下核酸的檢測知識吧。

核酸的檢測試劑及顏色變化

核酸的檢測有試劑的檢測，那麼核酸的檢測試劑及顏色變化是什麼樣的呢？

核酸的檢測試劑及顏色變化為：紅色是陽性，綠色是陰性。最常用的病毒快速檢測方法主要有兩大類：核酸檢測，核酸（DNA 或 RNA）是病毒的遺傳物質，篩選其中獨一無二的特徵核酸序列進行檢測可准確確定病原體。

還有抗原抗體免疫檢測，病毒作為抗原可激發人體免疫反應產生抗體，可以通過抗原抗體特異性相互結合的特性進行檢測。當然，不論是哪種檢測技術，只有操作簡單，設備要求低，速度快，效率高才是王道。例如：針對新冠病毒的檢測，主要是通過基於實時熒光PCR技術原理研發的核酸檢測試劑進行快速確診，基於抗體檢測技術原理研發的核酸檢測試劑進行補充檢測。

核酸的檢測方法有哪幾種

核酸的檢測方法並不只是有一種的，具體核酸的檢測方法有哪幾種呢？

核酸檢測採用咽拭子檢測，有口咽拭子采樣和鼻咽拭子采樣兩種方式。口咽拭子采樣就是在咽喉部位用棉簽塗擦，取咽喉部上皮細胞的檢測，檢測方法一般是受檢測者張口發出「啊——」的聲音，檢測人員用棉簽採取樣本，檢測過程並沒有創傷風險，是非常安全的檢測。還有是鼻咽拭子採集，一般是將一根細棉簽深入鼻孔，從下鼻道深入抵達鼻咽後壁，然後捻轉棉簽取樣，一般檢測很有可能會有嘔吐的感覺，所以需要忍耐一下。

陽性(+)和陰性(-)是實驗結果的判別方式之一，被稱為定性檢查。核酸檢測陽性代表感染了病毒。核酸檢測的操作要求較高，若因采樣不當導致樣本病毒含量低，或運輸儲存條件不當等情況，都有可能導致核酸檢測可能出現假陰性結果。

核酸檢測前注意事項

核酸檢測前是有一些准備事項的，具體核酸檢測前注意事項有哪些呢？

核酸在檢測前，應當注意的是不要過度地吃東西，另外要少喝水，如果是在鼻子有症狀或者是有咽喉症狀的話，盡量不要去檢測核酸。首先我們要知道這個核酸的檢測，它是確定新型冠狀病毒肺炎的一個很重要的方法。

其實通過核酸檢測的結果，可以確診或者是排除患者的新冠病毒的診斷，或者是確診或者是排除。在檢測的時候，醫護人員會拿一個非常長的棉簽，我們叫咽拭子，在咽後壁進行旋轉、取樣，如果我們吃太多的食物，很可能會引起惡心反射、咳嗽反射，從而導致誤吸，一定要空腹。但是如果我們有咽喉部或者鼻部的炎症，也不適合去采樣，容易出現大出血，所以還是等情況穩定的時候去做核酸。

核酸的檢測時間怎麼算

核酸的檢測結果不會馬上出來，那麼對於核酸的檢測時間怎麼算呢？

核酸的檢測一般是從做完核酸采樣之後開始算時間。對於發熱門診患者的核酸檢測，應在6小時內報告結果，並努力將報告時間縮短至4小時。對於普通門急診患者、住院患者和護理人員的核酸檢測，原則上應在12小時內報告結果。對於願意接受檢測的人的核酸檢測，結果通常在24小時內報告。

目前，核酸的檢測採用實時定量PCR方法被廣泛應用於檢測COVID-19特異性核酸片段。測試時，醫生會用類似拭子的拭子擦拭扁桃體和咽凹附近的分泌物，或通過鼻腔清除鼻咽後部的分泌物，然後將其放入試管中，然後送到檢驗部門做相應的病毒核酸檢測。核酸檢測通過五個步驟完成：取樣、樣品保留、保存、核酸提取和計算機檢測。

『貳』 認識核酸提取的知識筆記2020-05-07

一．核酸抽提原理：

核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。其是：裂解樣品中的核酸游離在體系；純化游離的核酸，使之與體系中的其它成分分離（如蛋白質、鹽及其它雜質徹底分離）。

常用的裂解液：包括去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。

去污劑的作用，是通過使蛋白質變性、破壞膜結構、解開與核酸相連接的蛋白質，從而實現核酸游離在裂解體系中。

鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞 (如 EDTA)、維持核酸結構的穩定 (如NaCl) 等。

裂解體系中還可能加入蛋白酶，利用蛋白酶將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便於後面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。

二．最常用的純化方法

（一） PC 抽提（Phenol-chloroform extraction：酚氯仿抽提）+醇沉澱：利用PC對裂解體系進行反復抽提以去除蛋白質，實現核酸與蛋白質的分離，再用醇將核酸沉澱下來，實現核酸與鹽的分離。

（二）介質純化：利用某些固項介質，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質及鹽的特點，實現核酸與蛋白質及鹽的分離。

（三）高鹽沉澱去除蛋白質是第一種純化方法的一個變體，省略了PC操作的麻煩，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限於簡單的 PCR。

三．裂解方法的評價

（一）含蛋白酶的裂解方法是抽提基因組 DNA 的首選。包括裂解游離的膜蛋白與基因組 DNA 相連接的游離蛋白質。

（二）不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，在細胞基因組 DNA 抽提方面仍然有優勢。尤其是當得率和純度要求不是最高，而經濟性及操作簡單很重要時，控制好裂解液/樣品的比例是該方法成功的關鍵。該方法結合高鹽沉澱，可以實現最簡單的操作，但純度及得率的穩定性可能會比用 PC 抽提的差一些。

（三）高濃度蛋白質變性劑 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法是抽提 RNA 的首選。

（四）含 CTAB 的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。

（五）SDS 鹼裂解法是質粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA 污染的特點。

（六）PCR 模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解後即可直接取裂解液用於 PCR，非常快速。

四．純化方法的評價

（一）PC 抽提/醇沉澱方法：穩定、可靠、經濟、方便。PC 抽提可以徹底去除蛋白質，醇沉澱可以去除鹽，對於一般的干凈的樣品 (雜質為蛋白質)，該方法完全可以獲得高質量的核酸。

（二）高鹽沉澱蛋白質/醇沉澱方法：同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC 抽提方法相比，除了純度的穩定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC 抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質所伴隨的好處是，可以用於大規模抽提，不足是純度 (蛋白質殘留) 不夠穩定。

（三）介質純化方法：是一個越來越受到重視的方法。其最大特點是非常適合大規模核酸抽提，並且因為受人為操作因素影響小，純度的穩定性很高 (雖然純度不一定比PC 純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質被預先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀 (如Glassmilk、磁性小珠等)。

五．醇的沉澱

醇的沉澱，目的是使核酸從裂解體系中沉澱下來，從而實現核酸與其它雜質（主要是鹽）的分離。實際操作中，許多雜質也會與核酸一起被醇沉澱下來，尤其是當其它雜質的濃度也比較高的時候。醇的沉澱並不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當濃度達到一定水平後，都可能同步被沉澱下來。最有參考價值的是 TRIzol 提供的一個沉澱方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。

PEG、LiCl、CTAB 都可以用於核酸沉澱。雖然它們遠沒有醇沉澱的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以沉澱 RNA 以去除DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉澱下來。PEG是沉澱病毒顆粒的方便手段。

六．洗滌

洗滌首先一定要將沉澱懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當核酸沉澱比較大時 (使核酸沉澱最終蓬鬆)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。

七．核酸質量的檢測問題

目前用於正式實驗前檢測核酸質量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。

（一）電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出電泳分離范圍)，電泳還可以用於估計核酸的濃度，但其准確度與經驗有關；另外，電泳也可能提供某些雜質污染的信息。

（二）紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，該儀器的靈敏度非常高，A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 為 1.8) : 1 為理論上的數據，實際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了。如： A260/A230 > 2 就是純的，如果 A260/A280

> 2.3 就是核酸降解，A260/A230比2大許多，一定是有雜質殘留的。

八．核酸的溶解和保存

純化後的核酸，最後多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA以水為主，DNA 則多以弱鹼性的 Tris 或者 TE 溶解。經典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認為 EDTA 可以減少DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風險；如果操作過程式控制製得當，DNase 的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解DNA。

實驗室常用保存方法: -20℃保存的 DNA， -70℃保存的RNA。

『叄』 核酸幾種方法

1.定磷法。簡單快捷，靈敏度高，但易受蛋白質和核苷酸影響。
2.定糖法。靈敏度高，但特異性差，戊糖也會產生反應，容易產生干擾。
3.紫外線吸收法。適用於濃度大的核酸溶液，而人體感染新冠病毒後，咽部所含的病毒量極少，無法通過此種方法被檢測。
4.熒光法。目前廣泛被使用的是熒光定量RT-PCR檢測法，通過對標本進行逆轉錄擴增、使病毒片段達到一定數量，可以被檢測到，但是由於受采樣標本、運輸等多種因素影響，也有假陰性的可能。

『肆』 核酸提取中除去蛋白質的方法主要有哪幾種

可以用氯仿抽提之後離心，離心後分三層，下層有機層中有一些脂溶性的雜質，中間層白色絮狀沉澱是蛋白，上清液中即含有核酸。也有很多試劑盒，是可以把核酸掛在柱子上，把蛋白質等雜質離心掉，這個方法即快捷又方便。

凝膠過濾，這是很容易去除小分子雜質物質的方法。

如果蛋白樣本和核酸的分子大小差別比較大，可以考慮用超濾的方法。

超濾是以壓力為推動力的膜分離技術之一，以大分子與小分子分離為目的 。

加入核酸酶消化三個小時。

比如加一定量的DNAase 和RNAse酶消化。

(4)目前核酸提取常用方法擴展閱讀：

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧核苷酸存在條件下復制或轉錄時，如果在四管反應系統中分別按比例引入四種雙脫氧核苷酸，只要雙脫氧核苷酸摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧核苷酸的片段可繼續延長。

如此每管反應體系中便合成以共同引物為5』端，以雙脫氧核苷酸為3』端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止後，分四個泳道進行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個核苷酸），根據片段3』端的雙脫氧核苷酸，便可依次閱讀合成片段的核苷酸排列順序。

『伍』 核酸提取或純化技術主要有哪幾類

核酸提取或純化技術主要有三類：

1、傳統方法（操作復雜，耗時長）

2、離心柱法（試劑盒）

3、磁珠法（可單獨采購磁珠或買成品試劑盒）

其中，磁珠法可實現自動化操作，是目前比較主流的方法。

核酸提取應用在疾病控制中心、臨床疾病診斷、輸血安全、法醫學鑒定、環境微生物檢測、食品安全檢測、畜牧業和分子生物學研究等多種領域。

(5)目前核酸提取常用方法擴展閱讀：

核酸提取的注意事項：

1、儀器的安裝環境：正常的大氣壓(海拔高度應該低於3000m)、溫度20-35℃、典型使用溫度25℃、相對濕度10%-80%、暢通流入的空氣為35℃或以下。

2、避免將儀器放置在靠近熱源的地方，如電暖爐；同時為防止電子元件的短路，應避免水或者其他液體濺入其中。

3、進風口和排風口均位於儀器背面，同時避免灰塵或纖維在進風口聚集，保持風道的暢通。

4、核酸提取儀離其他豎直面至少10cm。

5、儀器接地：為了避免觸電事故，儀器的輸入電源線必須接地。

6、遠離帶電電路：操作人員不得擅自拆解儀器，更換元件或進行機內調節必須有持證的專業維修人員完成，不要在接通電源的情況下更換元件。

『陸』 核酸的提取方法有幾種

DNA的提取方法有7種：酚抽提法、甲醯胺解聚法、玻璃棒纏繞法、異丙醇沉澱法、表面活性劑快速制備法、加熱法快速制備、鹼變性快速制備。核酸是一類生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的組成物質。核酸是脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的總稱。
脫氧核糖核酸（英文DeoxyriboNucleicAcid，縮寫為DNA）是生物細胞內含有的四種生物大分子之一核酸的一種。DNA攜帶有合成RNA和蛋白質所必需的遺傳信息，是生物體發育和正常運作必不可少的生物大分子。DNA由脫氧核苷酸組成的大分子聚合物。脫氧核苷酸由鹼基、脫氧核糖和磷酸構成。其中鹼基有4種：腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。