常用的rna提取方法

A. 幾種提取RNA的方法

摘要:以肝臟組織和NDV感染的雞胚尿囊液為例，簡單介紹了幾種提取細胞或組織液中總RNA及mRNA的方法－SOD－蛋白酶K法、異硫氰酸胍法、loigo(dT）纖維素親和層析法。SDS－蛋白酶K法提取RNA經濟可靠，但純度稍低；異硫氰酸胍法適於提取細胞中的總RNA，純度較高；利用ligo(dT)能與mRNA poly（A^+)尾結合的特性提取組織細胞中的mRNA.

B. 提取制備RNA常用的方法有哪幾種,各有何優缺點

常見的RNA提取方法有苯酚法、陰離子去污劑法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、異硫氫酸胍法、CTAB法、熱硼酸法及改良熱硼酸法、TRIZOL試劑快速提取法。
RNA提取時，就變性劑的選擇來說，CTAB（CTAB法）比異硫氰酸胍（RIZOL試劑法）和SDS（改良熱硼酸法）更有效；就CTAB法來說，由於以CTAB為變性劑，同時加入PVP和β一巰基乙醇共同作用變性蛋白、抑制RNase的活性，使用無水乙醇或異丙醇沉澱雜蛋白和總核酸等，然後再選擇性地分離出RNA。

C. RNA的提取方法有哪些

RNAgents總RNA提取系統
1)Promega有哪些系統用於提取總RNA及poly(A)+RNA？
2)RNAgents®總RNA提取系統的工作原理怎樣？
3)RNAgents®總RNA提取系統的一般得率是多少？
4)RNAgents®總RNA提取系統的各組分的功能是什麼？
5)RNAgents®總RNA提取系統中平衡的苯酚：氯仿：異戊醇的配比是多少？
6)對初始材料的用量有什麼限制？
7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？
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1)Promega有哪些系統用於提取總RNA及poly(A)+RNA？
Promega用於提取總RNA及poly(A)+RNA的系統包括：
：用RNAgents®總RNA提取系統從組織及培養的細胞中提取總RNA。
：用SV總RNA提取系統從組織，血液及培養的細胞中提取總RNA。
：用PolyATtract®mRNA提取系統從總RNA中提取poly(A)+RNA。
：用PolyTtract®ystem1000從組織及培養的細胞中提取poly(A)+RNA。
：用PolyTtract®Series
9600TMmRNA從少量樣品中快速提取mRNA（cDNA第一條鏈的純化）。
2)RNAgents®提取總RNA提取系統的工作原理怎樣？
RNAgents®總RNA提取系統用溶劑法為基礎，從多種材料中快速，有效地提取總RNA。
簡單而言，有亞硫氫胍及巰基乙醇時，制組織勻漿，可使內源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸將核蛋白復合物變性。用酸平衡的苯酚：氯仿：異戊醇抽提後，RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相。抽提後，用異丙醇將RNA沉澱濃縮。用RNAgents®總RNA提取系統所得RNA純度好，用途廣，適用於PolyATtract®mRNA提取系統。如RNA中必須完全去除染色體DNA，需用1-2個單位的無RNA酶污染的DNA酶處理。然後用65oC加熱10分鍾，或用苯酚及氯仿抽提使DNA酶失活。
3)RNAgents®總RNA提取系統的一般得率是多少？
得率受多個因素的影響，包括組織來源及培養的細胞數。如提取的RNA量多，可通過光吸收測定（A260讀數）來定量RNA，
1OD=40ugRNA。
RNAgents®總RNA提取系統的一般得率
組織
總RNA得率
Hela細胞
1.6mgRNA/10的8次方個細胞
鼠內臟
2.3mgRNA/g組織
鼠脾
8.3mgRNA/g組織
鼠肺
1.9mgRNA/g組織
鼠腎
3.1mgRNA/g組織
鼠肝
8.1mgRNA/g組織
4)RNAgents®總RNA提取系統的各組分的功能是什麼？
(1)
變性劑:
檸檬酸鈉溶液中含亞硫氫胍，巰基乙醇，n-月桂肌氨酸
。可變性細胞內及核蛋白復合物，釋放RNA。這些試劑還可有效抑制核酸酶。
(2)
苯酚：氯仿：異戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除雜物。DNA及蛋白沉澱到有機相，RNA留在水相。酸性有機溶劑的抽提可免除用氯化鋰選擇沉澱RNA。用鋰沉澱導致小於5.8sRNA的丟失，並不利於下游操作。
(3)
乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，及沉澱RNA所需。
(4)
異丙醇：沉澱濃縮RNA。
5)RNAgents®總RNA提取系統中平衡的苯酚：氯仿：異戊醇的配比是多少？
苯酚：氯仿：異戊醇的配比是125：24：1，用42mM檸檬酸鈉溶液平衡(pH4.3-4.7)。這一配比可有效去除染色體DNA。殘留染色體DNA會干擾RT-PCR。
6)對初始材料的用量有什麼限制？
最初的設計方案是用作提取比較大量的RNA，RNAgents®總RNA提取系統可從5mg
組織，或5倍10的5次方的細胞中提取RNA。少量RNA提取的步驟可見RNAgents®總RNA提取系統技術手冊TB087。初始材料用量的上限是每次用1g組織。
7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？
快速提取RNA用作RT-PCR，可省去在變性溶液中液化和沉澱的步驟。簡化的步驟可在90分鍾內完成。
http://www.promega.com.cn/files/changjian/rnagents.htm

D. rna提取步驟

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一種總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速裂解細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進行提取組織或細胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在勻質化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細胞及溶解細胞成分。加入氯仿離心後，裂解液分層成水相和有機相。RNA存在於水相中。

水相轉移後，RNA通過異丙醇沉澱回收。移去水相後，用乙醇可從中間相沉澱得到DNA，加入異丙醇沉澱可從有機相得到蛋白質。

E. RNA提取方法

1．提取
稱取鮮酵母 159或乾酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，攪拌均勻，置於沸水浴中提取lh。
2．分離
將上述提取液用自來水冷卻後，裝入大離心管內，以4000r／min離心10min，使提取液與菌體殘渣等分離。
3．沉澱RNA
將離心得到的上清液傾於50ml燒杯內，並置入放有冰塊的250ml燒杯中冷卻．待冷至10℃以下時，用6mol／L HCI 小心地調節pH值至2.0～2.5（注意嚴格控制pH）。調好後繼續於冰水中靜置10min，使沉澱充分，顆粒變大。
4．洗滌和抽濾
上述懸浮液以 4000r／min離心 10min，得到 RNA沉澱。將沉澱物放在 10ml小燒杯內，用95％的乙醇 5～10ml充分攪拌洗滌，然後在布氏漏鬥上用射水泵抽氣過濾，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。
5．乾燥
從布氏漏鬥上取下沉澱物，放在6cm表面皿上，鋪成薄層，置於80℃烘箱內乾燥。將乾燥後的RNA製品稱重，存放於乾燥器內。

F. RNA的提取方法步驟及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一種總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速裂解細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進行提取組織或細胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在勻質化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細胞及溶解細胞成分。加入氯仿離心後，裂解液分層成水相和有機相。RNA存在於水相中。

水相轉移後，RNA通過異丙醇沉澱回收。移去水相後，用乙醇可從中間相沉澱得到DNA，加入異丙醇沉澱可從有機相得到蛋白質。

(6)常用的rna提取方法擴展閱讀

與DNA不同，RNA一般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結構，但是很多RNA也需要通過鹼基配對原則形成一定的二級結構乃至三級結構來行使生物學功能。

RNA的鹼基配對規則基本和DNA相同，不過除了A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。

在細胞中，根據結構功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA（轉運RNA），rRNA（核糖體RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白質的模板，內容按照細胞核中的DNA所轉錄；tRNA是mRNA上鹼基序列（即遺傳密碼子）的識別者和氨基酸的轉運者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質合成的工作場所。

G. RNA提取方法或技術有哪些

通過使用biog結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和滅活細胞內核酸酶,然後基因組DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附於離心柱內硅基質膜,再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟,抑制物去除液和漂洗液將細胞代謝物,蛋白等雜質去除,最後低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質膜上洗脫.

H. 如何選擇正確的RNA提取方法

1. 使用正確的細胞或組織儲存條件
在樣品用液氮瞬間凍結之後，應該儲存在-80°C，千萬不能解凍。即使是置於含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會導致RNA的降解和損失。瞬間凍結的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然後置於裂解液中進行勻漿。
RNAfixer使樣品儲存更為便利。儲存在RNAfixer中的細胞或組織可在室溫下穩定保存長達1個星期，在4°C可穩定保存長達1個月，或永久保存在-20°C。
2. 消除環境RNase的污染
為了得到完整的、高品質RNA，在整個RNA制備過程中，當RNA離開強蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護時，避免引入新的RNase污染就非常關鍵。由於RNase幾乎是無所不在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣東西都是無RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制膠設備，都必須用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑 來處理過，去除各種溶液或者反應緩沖液中可能存在的RNase污染，可以用RNAsafe。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應經常更換。
3.迅速滅活內源的RNA酶，以防止RNA降解。
以下3個方法均可有效使內源RNA酶失活：
1）、用含離液（如胍鹽）的細胞裂解液收獲樣品，並立即勻漿。
2）、用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結，以確保瞬間令RNA酶失活。
3）、立即將樣品置於RNAfixer無液氮RNA樣品儲存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑，能立即穩定並保護完整、未凍結的組織和細胞樣品中的RNA。關鍵要點是組織樣品切片一定要夠薄（<0.5 cm），這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。
4. 選擇合適破壁方法
細胞或組織的徹底勻漿對RNA提取來說，是一個很關鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類型來選擇。大部分培養的細胞可以置於細胞裂解液中，通過簡單的渦旋震盪來勻漿；而動物組織、植物組織、酵母和細菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說細菌（特別是革蘭氏陽性菌）的細胞壁，就需要溶菌酶消化來實現徹底的細胞裂解和RNA的最大回收，酵母提取時加入破壁酶幫助破壁，再用TRIpure或RNApure進行提取。
5. RNA提取少走彎路——不同材料如何選擇最適RNA提取試劑
現有眾多的RNA分離方法也許令人難以取捨。目前最簡單也是最安全的方法是柱式分離，如RNApure 因為操作簡單，時間短，純度高而受到大家的喜愛，RNApure不需要DNA酶消化DNA，節省了時間，避免RNA的降解，從而提高了產量；相對非柱式分離（如TRIzol），去除蛋白及其他雜質干凈，提高了純度，對於細胞、組織、一般植物均非常適合。植物RNA的提取比較難抉擇，植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質、次生代謝物含量的影響，一般用TRIzol提取純度不高，而且很多植物用TRIzol提取不出來。
這時候可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等）和通用植物RNA提取試劑盒（適合絕大多數植物提取，包括：各種中草葯、植物種子、蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹、杉樹、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍、牽牛花等）；非常值得一提的是血液（包括血清、血漿、腦脊液、各種拭子或其他液體含量高的樣本）RNA的提取用TRIzol和紅細胞裂解的方法效果都不好，因為紅細胞裂解液不含有RNA酶的抑製成分，這個過程RNA很容易降解，推薦使用TRIpure LS (RP1101)或者血液總RNA提取試劑盒（RP4001），該方法適用於表達譜晶元實驗中RNA的提取。
6. 低濃度RNA的沉澱
純化得到的RNA可能需要通過沉澱來濃縮，以滿足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉澱（加0.1體積的5M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鍾以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以採用共沉澱（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當RNA用於RT-PCR分析時，線性的丙烯醯胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉澱劑，因為它們都不含DNA污染，糖原含量高會抑制PCR反應，應注意控制濃度，核酸助沉劑對PCR無影響，成為病毒核酸提取的首選。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結果。沉澱後，注意避免RNA沉澱過分乾燥，因為這可能導致很難重新溶解。
7. 提取好的RNA如何儲存
如果只是短期儲存，重懸的RNA應放置於-20°C；如果是長期儲存的話，就應該放置於-80°C。儲存RNA時，可以加入少量的RNA酶抑制劑（RP5601），避免RNA的降解，RNA可以直接做下游實驗。如果要長期保存RNA，可以加入RNAlong。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會避免反復凍融損傷RNA，並預防偶然的RNase污染。

I. 常用的RNA分離方法有哪些

常見的RNA提取方法有苯酚法、陰離子去污劑法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、異硫氫酸胍法、CTAB法、熱硼酸法及改良熱硼酸法、TRIZOL試劑快速提取法。 RNA提取時，就變性劑的選擇來說，CTAB（CTAB法）比異硫氰酸胍（RIZOL試劑法）和SDS