談談常用菌種保藏方法的利弊

❶ 常用的菌種保存方法有哪些

菌種保藏是食用菌產業的一項基礎工作，是確保野生種質資源基因留存和現有生產用種遺傳性能相對穩定的必要手段。菌種保藏的方法多種多樣，有的雖然保藏效果好，但投資高或操作繁雜。在生產實踐中，更需要設備投入少，能保障菌種不死亡、不污染、最大限度地保持優良種性的簡便方法，如斜面低溫短期保藏和自然基質較長期保藏相結合的方法。

一般而言，對母種進行長期保存，對原種進行短期保存。須保證優良菌種的性狀和活力不發生變異，不死亡，不被污染，確保其純度。因此，保存方法應具備取材容易、操作方便、菌種不易退化、長期保存不污染雜菌等優點。常用的菌種保存方法如下：

（一）斜面低溫保藏 該法的優點是保藏方便且所佔空間較小。具體做法是：菌絲長滿斜面後，放在0～5℃保存。以後每隔一定時間（2～3個月）轉管一次。轉管保存不能長期用PDA培養基，否則種性易退化，灰樹花降解木質纖維素的能力減弱。因此隔一定時間（1年左右）須把菌種轉接到木屑培養基上復壯，之後挑選健壯無污染的菌絲再轉回PDA培養基保存。在長期保存過程中，要防棉塞受潮滋生雜菌。菌種試管口最好用蠟燙封，以防培養基內水分過快蒸發。增加瓊脂用量（2.5%～3%）可減緩水分蒸發。還要防止菌種管上的標簽脫落而造成種系混雜。

斜面低溫保藏方法簡便易行，能隨時觀察保藏菌株的活力和純度，一旦染雜，肉眼能及時發現。

（二）自然基質保藏 此法是根據灰樹花的特性，利用自然基質保藏其菌種的方法。灰樹花是木腐菌，可以採用以木屑為主料的培養基。自然基質營養全面，且大部為緩釋養分，不易產生營養過剩或飢餓；其次，培養基理化性狀好，可吸收或緩沖菌絲代謝出的有害物質，水分與通氣協調平衡，部分菌絲扎入基質內生長，不裸露於空氣中，菌絲呼吸強度低，生命力強。

1.原料與配方 粗、細木屑比例適當，採用板栗樹木屑最佳，粗木屑粒徑為2毫米左右，細木屑為一般圓盤鋸屑，粗、細的比例為1∶2，添加干木屑重量20%的麩皮和1%的糖，含水率為60%左右。這樣的基質通氣性好，營養豐富且供菌絲分解利用的時間長，長到基質內部的菌絲比包裹在基質外部暴露於空氣中的菌絲耐受性強。不同粒徑的基質比例適當，還能協調氣與水的矛盾。粗粒過多，架空菌絲多；細粒過多，透氣性差，菌絲生長慢。應用配方如下：

栗木屑78%，麩皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，裝入較粗大的試管中，裝料量為試管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2滅菌1.5小時。冷卻後，接入需保藏的菌種，在28℃下培養，待菌絲長滿木屑培養基時取出換上無菌橡皮塞，在0～5℃冰箱內保藏1～2年轉管一次。

2.容器與裝量 採用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗潔凈，裝量一般不超過玻璃瓶容量的3/5，填料不能過滿，瓶壁所殘留的顆粒須擦拭乾凈，否則保藏的菌種易引起污染。

3.滅菌和冷藏 滅菌時若採用棉塞封口，基質表層易失水，接種成活率低，即使菌絲復活，生長也很緩慢，所以最好採用聚丙烯膜封口，接種後換用無菌棉塞培養，待菌絲長滿後再換成有孔滅菌膠塞冰箱保藏。

用上述方法保藏的菌種經3年貯放後，接出成活率均達90%以上，出菇驗證產量及子實體形態特徵均無明顯變化。因此，自然基質保藏法具有保存期長，菌種遺傳性能相對穩定的特點。

（三）木粒PDA斜面保藏 灰樹花在自然狀態下易發生於栗樹根部，這說明其營養需求較為特殊。根據灰樹花這種習性，在PDA基礎上添加適量的栗樹木粒製成母種培養基。在多年的使用中發現，用該培養基培養的母種生長勢好，在轉接原種時，適應能力強，萌發定植快；用作菌種保藏基質時，保藏時間長，並能很好保持菌種的優良性狀。

1.木粒PDA的製作 選取栗樹邊材，加工成0.3～0.5厘米的顆粒，及時烘乾或曬干備用。稱取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解於1升清水中配製成營養液。將營養液倒入盛有木粒的小鋁鍋中，營養液以完全浸沒木粒為准。煮沸10分鍾，以加快木粒對營養液的吸收速度，起鍋靜置30分鍾讓木粒吸足營養液。撈出木粒，瀝掉表面的水，裝入試管，裝量為試管長的1/6，最多不得超過試管長的1/5，否則在擺制斜面時，不易使木粒均勻分散於斜面的表面上。

選取新鮮的馬鈴薯，去皮並切成薄片，稱取200克放入小鋁鍋中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁熱過濾取汁，並補足1升的體積。稱取瓊脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先將瓊脂剪碎，加入到馬鈴薯濾液中，繼續用文火加熱，使瓊脂溶化。待瓊脂完全溶化後，加入稱好的其他3種營養成分，攪拌使這些物質溶解均勻，趁熱裝入已裝有木粒的試管中，裝至試管長的1/3處，塞上棉塞。

在0.8～1千克/厘米2蒸氣壓下滅菌40分，待氣壓降至0時，開蓋取出，趁熱輕輕抖拍試管，使木粒分散後即可擺制斜面，並使木粒呈半裸狀分布於斜面上，待凝固後便製成了木粒PDA培養基。

2.生長及保藏效果 木粒PDA斜面上培養的灰樹花母種，菌絲生長迅速、良好，12天即可長滿試管，但菌絲的後期生長勢更為粗壯、濃密，後勁足。轉接原種時，菌種適應力強，定植快。這表明，灰樹花菌絲的生長速度、生長勢不僅取決於本身的遺傳性，而且很大程度上取決於培養基的營養。常規PDA的營養成分，主要是可溶性的速效性營養，前期營養豐富，營養利用直接，因而前期菌絲生長迅速、良好，後期營養則不足，菌絲生長不良，長勢欠佳。木粒PDA由於在增添了木粒這一緩效性營養，就木腐性的灰樹花而言，營養配伍合理，補充了菌絲生長後期所需的營養，因此後勁足。

菌絲體對基質的分解利用是通過菌絲細胞分泌的胞外酶，將基質中的大分子營養分解成小分子營養後才被吸收利用的，而這些胞外酶大多為誘導酶，其合成與分泌受基質的誘導和分解產物阻遏機制調節。就纖維素酶而論，許多易代謝碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同時伴隨著菌絲體的旺盛生長，酶的大量合成則出現在易代謝碳源基本耗盡之後，且受到基質纖維素的誘導，常規PDA基質，到葡萄糖等易代謝碳源基本耗盡的後期，由於營養的缺乏，菌絲生理機能下降，酶的合成量減少。而木粒PDA不僅含有易代謝碳源——葡萄糖，又含有木粒這一緩效性營養，前期葡萄糖促進了菌絲體旺盛生長，獲取了大量的菌絲體，表現為菌絲粗壯、濃密。到了易代謝碳源耗盡的後期，木粒一方面補充了後期所需的營養，使菌絲的生埋機能維持在一定的水平；另一方面木粒的纖維素激活菌絲細胞纖維素酶的誘導機制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰樹花較強的分解木材的能力，因此，用該培養基培養的母種在轉接原種時適應力強，萌發定植快。因部分菌絲長入木粒內部，抵抗不良環境的生存能力增強，種質不易退化。木粒PDA灰樹花菌種，在0～5℃保藏2～3年再轉管活化，成活率仍達到90%左右。此外，木粒PDA應用於木腐性灰樹花種的提純復壯，效果也較理想。

（四）石蠟隔氧封藏 具體做法是將液態石蠟分裝入三角瓶內，裝量達瓶空間的1/3，塞好棉塞，於121℃滅菌2小時，然後置40℃溫箱中，使其水分蒸發，或置於乾燥器內數日以除去水分，石蠟呈透明狀為宜。在無菌條件下，用無菌吸管裝入已長好菌絲的斜面試管，使液面高出斜面頂部1厘米左右。塞上無菌橡皮塞，豎直保存。此法可使菌種存活3年以上，但以1～2年移植一次為好。移植時不必倒出石蠟，用接種鉤取一塊菌絲即可。因轉移時帶有石蠟，菌絲生長弱，需要再轉管1～2次，方能復壯。

❷ 常見的保存菌種的方法 常見的保存菌種的方法介紹

1、斜面傳代保藏法。此法是把菌種接種到所需要的斜面培養基上，在最適溫度下培養，長出豐滿的菌體細胞或孢子後，置於4℃冰箱或冷庫保藏。此法方法簡單，存活率高，適用於各類菌株的保藏。但保藏時間不長，需定期傳代，傳代過程中易退化污染，只適用於短期保藏。

2、甘油管冷凍保藏法。甘油管保藏法是將富集培養後的菌液與已滅好的甘油充分混合，使終濃度控制在20-30%之間，分裝至甘油管中，最後置於-70℃冰箱或液氮罐保藏。此法相比斜面傳代保藏時間更長，溫度越低，保藏時間越久。

3、液體石蠟保藏法。液體石蠟保藏是在斜面培養或穿刺培養上加一層液體石蠟，液體石蠟可以防止失水乾燥，隔絕空氣，降低菌種細胞代謝速率。此法更適用於細菌和酵母菌。

4、沙土管保藏法。沙土管保藏法是把微生物附著在砂質載體上，目的是為了將微生物賴以生存的水分蒸發掉，使細胞處於休眠和代謝停滯狀態，從而達到較長保藏的目的。此法適用於黴菌和放線菌。

5、真空冷凍乾燥保藏法。該法集中了菌種保藏中低溫、缺氧、乾燥和添加保護劑等多種有利條件，使微生物的代謝處於相對靜止狀態。同時該法可用於細菌、放線菌、絲狀真菌、酵母菌及病毒的保藏。因而具有保藏菌種范圍廣、時間長（10-20年）、存活率高等特點，是目前最有效的菌株保藏方法之一。

❸ 常用的蛹蟲草菌種保藏方法有哪些

在實踐中，人們嘗試了許多保藏方法，如繼代培養保藏法、液體石蠟保藏法、蒸餾水保藏法、冷凍乾燥保藏法。這些方法各有利弊，在實踐中要根據保藏的目的、資金及設備狀況等因素，選擇最佳保藏方法。

1.斜面培養基冰箱保藏法這是最常用的菌種保藏方法。因為它簡單易行，不需特殊設備，並能隨時觀察保藏菌種的情況。因此，短時間保藏菌種，一般都採用此法。

將需要保藏的菌種接種在斜面培養基上，在適宜的溫度下培養，當菌絲健壯地長滿斜面時，即可將此試管菌種取出，放在4℃的冰箱中保藏。用於保藏菌種的棉塞，要用硫酸紙包紮，防止黴菌污染。冰箱保藏蛹蟲草菌種，一般1個月轉管一次。

冰箱保藏，雖然簡單易行，但溫度不夠低，只有4℃左右，蛹蟲草的新陳代謝活動並未停止，而試管斜面也易失水變干。因此，保藏時間較短，1個月就需轉管一次，轉管次數多了，變異的可能性也就增大，不適宜長期保藏菌種。若保藏時間超過1月，菌種的轉色與出草能力明顯下降。

2.大米培養基冰箱保藏蛹蟲草在大米培養基上培養後在冰箱內能保藏較長的時間，根據試驗，保藏5個月菌種質量無明顯變化。

3.蠶蛹基質保藏法以家蠶蛹為培養基保藏蛹蟲草，在冰箱保藏4個月或在室溫下保藏1個月，均未發現明顯的變化，生產上多採用此種方法。

採用大米及家蠶蛹培養基在三角瓶保藏菌種，保藏的菌絲體相對較多，基質不易乾燥，生產上使用方便。

4.礦油保藏法礦油（主要是液體石蠟）保藏，也稱液體石蠟保藏。此法簡單易行，無需另添設備，各生產單位均可應用。礦油能隔絕氣體交流，防止培養基水分蒸發，抑制微生物代謝，推遲細胞衰老，能延長微生物的生命。

（1）培養基常用的培養基配方為20%的馬鈴薯汁500ml，5%的蠶蛹汁500ml，蛋白腖5g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）3g，硫酸鎂（MgSO4H2O）1.5g，葡萄糖20g，維生素B1微量，瓊脂15g，pH6.5，1kg/cm2滅菌30min。

（2）礦油處理選用化學純的液體石蠟（要求不含水、不霉變、比重為0.865～0.890），分裝於三角瓶中，裝至瓶體的1/3處，塞好棉塞；另配一套具有虹吸管的橡皮塞，用紙包好，與三角瓶一起於1kg/cm2滅菌30min。滅菌後，將液體石蠟放在40℃的溫箱中，使液體石蠟中的水分蒸發干凈，至石蠟液呈完全透明為止。

（3）接種培養將需保藏的菌種，接入斜面培養基上，在20℃左右下培養，待斜面長滿健壯菌絲後，取出裝入礦油。

（4）礦油灌注將上述菌種和無菌礦油放入無菌室（箱），把有虹吸管的橡皮塞裝上礦油三角瓶，無菌操作使礦油注入斜面試管內（少量菌種也可用無菌吸管灌注），使液面高出斜面頂部1cm。

（5）菌種保藏將灌注礦油的試管直立放在試管架上，於室溫或冰箱中保藏均可。室溫保藏的環境應注意通風乾燥，以免棉塞發霉，並要定期檢查。如礦油覆蓋的斜面明顯變淺，應及時補充無菌礦油，切忌培養基露出液面。

液體石蠟易燃，使用時需加註意。從覆蓋礦油斜面中移植菌種時，應盡量少帶礦油。因礦油在火焰滅菌時，會爆炸飛濺。

以後用作菌種時，可從斜面上挑取少許培養基，接種在新鮮的培養基上，經過培養，即可使用。

5.雙重橡皮栓法用普通的斜面培養基先培養菌絲，用雙重橡皮栓取代棉塞。這種雙重橡皮栓要預先用氧化丙烯滅菌，方法是按1L容器注入1ml氧化丙烯，原封放置待用。採用蒸汽容易使橡皮變軟，而用氧化丙烯等滅菌方法可以避免此弊，利用雙重橡皮栓能防止空氣進入試管，從而達到與液體石蠟同樣的效果。

6.水箱中保藏法把蛹蟲草菌種懸浮在不含有機營養成分的水管中保存，一般用的懸浮液有蒸餾水、食鹽水、用蒸餾水時，在接有蛹蟲草菌種的瓊脂培養物中加入6～7ml蒸餾水，使細胞、孢子或蛹蟲草菌絲充分懸浮，爾後轉入試管內，密封後室溫下保藏。用食鹽水時，把在瓊脂培養基斜面上長好的菌絲懸浮在1%的食鹽水中，密封後在室溫條件下保存。

7.液氮超低溫保藏法此法是將菌種密封在含保護劑的安瓿管內，經控制速度凍結後，在－150～－196℃液態氮超低溫罐中保藏。

（1）菌種制備保藏孢子時，取孢子製成懸液，加入保護劑，裝入無菌安瓿管內。保藏菌絲體時，用液體振盪法培養菌絲球，或用平板培養菌絲體，也可用麥粒菌種。取適量放入無菌的裝有保護劑的安瓿管內。

（2）安瓿管製作安瓿管的玻璃，要能經受溫度突變而不破裂，容易用火焰封管口，恢復培養時容易打開。一般採用硼硅玻璃，管的大小根據需要而定，通常是75mm0mm或能容1.2ml液體的安瓿瓶比較合適。選好安瓿管後，每管加進0.8ml保護劑，塞上棉塞，1kg/cm2滅菌15min，作凍結瓊脂菌絲片或麥粒菌種用。如凍結孢子懸液時，則空管滅菌。

（3）保護劑用10%（體積比）甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞碸（dimethylsulfoxide）蒸餾水溶液作保護劑。

（4）凍結保藏將上述准備好的菌種無菌操作移入加有保護劑的安瓿管中，用火焰將安瓿管上部熔封，浸在水中檢查有無漏氣。然後將封口的安瓿管放在慢速凍結器內，控制凍結速度（每分鍾下降1℃），使樣品逐步均勻地凍結到－35℃。－35℃以下的凍結速度，可不用控制而迅速下降。安瓿管凍結後，立即放入液氮罐中。罐內的氣相溫度為－150℃，液體溫度－196℃。

（5）恢復培養保藏菌種時，將安瓿管從液氮罐中取出，立即放入38～40℃的水中搖盪至管內凍結物全部融解，開啟安瓿管，將管內菌種接入適宜培養基培養即可。

液氮超低溫保藏，是目前長期保藏菌種的最好的一種方法。用它進行保藏各類微生物和活細胞的試驗，都獲得了滿意的結果。對那些難以保藏的或只產生菌絲的真菌，用此法保藏也很成功。

現在，普遍對液氮保藏的效果都持樂觀態度，認為液氮保種很少或不會引起細胞中遺傳物質的變化。而且液氮保藏後菌株出現的問題卻很少報道。然而，Fritss首先在荷蘭Horst發現雜交菌株U1經液氮保藏3年後出現退化，部分培養物產量下降，出現硬開傘，經組織分離培養後，產量質量又恢復正常。據她認為，經原生質體重新融合產生的雜交菌株，其本身對不利因素（如超低溫的刺激）適應性差，故在液氮保藏中必須考慮到這一影響。而且反復的冷凍和解凍也會使菌株受到不同程度的損傷。

另一方面，液氮保藏本身也有不足之處，問題在於液氮保藏系統成本高，有些地方液氮不足，使一般保藏中心不能單獨依靠這一保藏技術。而且液氮保藏的菌種，首先必須培養在瓊脂培養基或液體培養基中，對郵寄交流造成一定麻煩。

一般認為，在未經有效可靠檢測之前，從液氮保藏中取出的菌種尤其是雜交菌株，不宜作當年產季的生產用種，必須經過出菇試驗，以確保無退化或無變異才能投入生產。

乾燥保藏的作用原理在於除去蛹蟲草菌絲細胞的游離水，以達到除去細胞代謝的液相環境，從而使代謝活動停滯並進入休眠狀態，有利於長期保存。

❹ 保存細菌等菌種最佳方法 菌種的保存方法

保存菌種的方法，應根據菌種的類型和保存目的進行選擇，一般包括以下幾種方法：

1、培養基保存法：此法不需要特殊設備，並可隨時提供使用，為常用的一種保存方法，其缺點是易發生變異。營養要求

不高的細菌，可用半固體保存法，一般2～3月轉種1次，並檢查菌株特性，如特性已改變，則需丟棄。特殊培養要求的細菌，如流感嗜血桿菌可接種巧克力瓊脂斜面，密封後冰箱貯存，每2周轉種1次。淋病奈瑟菌保存於巧克力瓊脂，每天或隔天轉種1 次，不宜4 ℃冰箱保存，因易死亡。

2、快速冷凍法：將純培養細菌在液體培養基上增菌後，取數個新鮮菌落加入含小牛血清或脫纖維綿羊血的培養基內製成濃菌懸液，再放人無菌玻璃珠，將此瓶放入－30℃以下低溫冰箱保存。需要時用無菌鑷子取出1 粒玻璃珠置增菌培養液中，增菌培養後即可獲得新鮮菌種。用此方法，大部分細菌可保存6 ～12 月，甚至更長時間。

3、冷凍乾燥法：是菌種保存最佳方法，可以免去細菌因頻繁傳代而造成菌種污染、變異和死亡。此法需冷凍乾燥設備，操作較費時，但適用於需要長期保存的菌種。

❺ 菌種保藏的常用方法及特點

（1）斜面低溫保藏。是一種最常用、最簡便的菌種保藏方法。首先將需要保藏的菌種接到斜面培養基上，在適宜的溫度條下培養，當菌絲健壯地長滿斜面時，即將此試管菌種取出，放置於4 ℃的冰箱中保藏。特點：
①簡單易行，適用於各類菇類菌種保藏，是目前生產及科研普遍採用的一種方法；②保藏時間短，需6個月轉接一次，轉管次數多菌絲變異的可能性大；③如改用橡皮塞並用石蠟扣，可保藏1年～3年。
（2）液體石蠟保藏。液體石蠟保藏也稱為礦油保藏，即用礦油覆蓋試管斜面試管保藏的方法。礦油是指無色、透明、黏稠、性質穩定、不易被微生物分解的石蠟油和液體石蠟，將其覆蓋在斜面菌種之上，可以隔絕空氣，防治培養基水分蒸發，抑制微生物的代謝活動，推遲細胞老化，從而達到長期保藏菌種的目的。特點：
①方法簡便易行，保藏條件不嚴格，保藏時間長，可作為長期保藏菌種的方法；②菌種必須垂直放，放置不方便。
（3）濾紙保藏。濾紙保藏是一種以無菌濾紙作為食用菌孢子吸附載體長期保藏菌種的方法，又稱濾紙孢子保藏法。特點：技術要求高，設備費用大，菌種不易衰老退化，菌種保藏時間長很少變異。
（4）自然基質保藏。自然基質保藏就是以不含毒性、刺激性和抑菌性而富含營養的自然生長的基質作培養基來保藏菌種的方法。自然基質很多，食用菌常用的自然基質有發酵的糞草、木屑及枝條基質等，取材方便，製作方法簡便，保藏時間也較長。使用時，只需取一塊、一粒或一條培養物放在新鮮的培養基上，並在適溫下培養即可。特點：方法簡便易行，保藏時間長。

❻ 菌種保藏的原理，菌種保藏方法

1、菌種保藏的原理：菌種保藏有多種方法，其原理大多大同小異，主要是人為創造條件盡量降低生物體內的代謝活動，以達到延長生命、減少變異的目的，其中低溫、乾燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素。2、菌種保藏方法：菌種保藏常用的方法有凍干保藏法、液氮保藏法、甘油管冷凍保藏法、傳代培養保藏法、寄主保藏法、載體保藏法等。

一、菌種保藏的原理

1、菌種保藏的原理是根據菌種的生理生化特性，人為創造條件盡量降低生物體內的代謝活動，以達到延長生命、減少變異的目的。在保藏過程中，必須使微生物的代謝處於最不活躍或相對靜止的狀態，才能在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能力。

2、低溫、乾燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，因此菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。其中低溫可減緩機體細胞的酶活，降低新陳代謝，達到保藏菌種的目的，同時會導致菌體誘發菌絲自溶機制。

二、菌種保藏方法

常用的方法有凍干保藏法、液氮保藏法、甘油管冷凍保藏法、傳代培養保藏法、寄主保藏法、載體保藏法等。

1、凍干保藏法

凍干保藏法是最有效的方法之一，具體為：先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分（真空乾燥），其中真空冷凍乾燥法最常見。

2、液氮保藏法

液氮保藏法，又稱為超低溫保藏法，主要利用微生物在低於-130°C的低溫下新陳代謝趨於停止的原理，在液氮中（-196°C的超低溫下）有效地進行菌種保藏的方法。該方法一般可保藏15年以上，是公認的菌種長期保藏技術之一。

3、甘油管冷凍保藏法

甘油管冷凍保藏法，利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。該方法適用於一般細菌的保存，同時也適用於鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現象發生。

4、傳代培養保藏法

傳代培養保藏法，又稱定期移植保藏法，包括斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等，是指將菌種接種於適宜的培養基中，最適條件下培養，待菌種生長完全後，通常置於4℃-6℃進行保存並間隔一定時間進行移植培養的菌種保藏方法。

5、寄主保藏法

寄主保藏法相當於一般微生物的傳代培養保藏法，必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染並傳代，尚不能用於在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等。

6、載體保藏法

載體保藏法，將微生物吸附在適當的載體如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而後進行乾燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。

❼ 菌種保藏的目的，菌種保藏的方法有哪些

1、目的：盡可能的保持菌種的原有性狀以及活力的穩定，保證菌種不死亡、不發生變異、不被外物污染，保持菌株的優良性狀不發生退化以及優良菌株的存活。2、原理：通過降低微生物體內的代謝，抑制生長繁殖，從而延長菌種的生命，減少變異，常用的方法為低溫保藏、缺氧保藏、乾燥保藏。

一、菌種保藏的目的

1、目的

在使用和傳代的過程中，菌種容易出現污染，發生變異，死亡等情況，從而導致菌種衰退，優良菌種丟失。而菌種保藏的目的就是為了盡可能的保持菌種的原有性狀以及活力的穩定，保證菌種不死亡、不發生變異、不會被外物污染，保持菌株的優良性狀不發生退化以及優良菌株的存活。

2、原理

菌種保藏的原理是通過降低微生物體內的代謝，抑制生長繁殖，從而延長菌種的生命，減少變異。常用的方法主要為低溫保藏，缺氧保藏，乾燥保藏。除此之外，避光，添加保護劑，缺乏營養等也可以提高保藏的效果。

二、菌種保藏的方法有哪些

1、斜面低溫保藏法

將菌種接種到適合的固體斜面培養基上，等到菌種充分生長過後，使用油紙將棉塞部分包紮好，然後轉移至2-8℃的冰箱中進行保存。

2、液體石蠟保藏法

（1）使用三角燒瓶將液體石蠟裝好，塞上棉塞，並用牛皮紙進行包紮，0.1MPa，121.3℃滅菌30分鍾左右，然後轉移至40℃的溫箱中，將水汽蒸發掉。

（2）將菌種在斜面培養基中培養，得到健壯的菌體，然後使用滅菌吸管將石蠟注入斜面上，用量為高出斜面頂端1cm為宜。

（3）將試管直立，放置在低溫或者室溫的環境下進行保存。

3、濾紙保藏法

（1）准備好濾紙條（0.5×1.2cm），裝入安瓿管中（0.6×8cm），每個管中放入1-2張，然後塞上棉塞，在0.1MPa，121.3℃的環境下滅菌30分鍾。

（2）將菌種在斜面培養基中培養，得到健壯的菌體，然後取出1-2ml的滅菌脫脂牛乳，滴加在滅菌培養皿內，接著取數環菌苔在牛乳內混合均勻，製成濃懸液。

（3）使用鑷子將濾紙條夾出，浸入菌懸液內，吸飽後，放回安瓿管中，塞上棉塞。

（4）將安瓿管放入裝有五氧化二磷的乾燥器，並用真空泵抽氣至干，然後將棉花塞入管內，用火焰熔封，放置在低溫下保存。

（5）當需要使用菌種的時候，將安瓿管口在火焰上燒熱，在燒熱的部位滴上一滴冷水，使玻璃破裂，再用鑷子將瓶口端的玻璃敲掉，等到打開安瓿管後，將濾紙取出，放入液體培養基內，置溫箱中培養。

4、沙土保藏法

（1）取出河沙，加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30分鍾（除去有機質）。

（2）將酸水倒掉，並用自來水將河沙洗至中性，然後進行烘乾，過篩（40目篩子），將粗顆粒去掉。

（3）取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，浸泡洗滌數次，直至為中性。

（4）烘乾，碾碎，過篩（100目篩子），去除粗顆粒。

（5）將沙和土按照2：1的比例混合，裝入試管中，塞好棉塞，滅菌30分鍾左右。

（6）將菌種在斜面培養基中培養，得到健壯的菌體，然後向斜面培養物中注入3-5ml無菌水，洗下細胞或孢子製成菌懸液。

（7）用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2-0.5ml，然後真空抽去管中的水分。如果是放線菌和黴菌可以直接挑取孢子拌入沙土管之中。

（8）將沙土管用火焰熔封，然後放置在低溫（4-6℃）乾燥處保藏，或者是將沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置乾燥器內保存。保存過程中，需要每隔半年檢查一次菌種的存活性和純度。

5、甘油管保存法

（1）將80%的甘油進行高壓蒸汽滅菌。

（2）將菌種放置在斜面培養基上培養，然後使用無菌水製成高濃度的菌懸液。

（3）使用1ml的甘油與菌液混合均勻，讓甘油的濃度為10-30%左右，然後將其放置在零下70℃的環境下進行凍存。

（4）也可以使用甘油-生理鹽水（體積比8：2），和菌體肉湯混合均勻，然後放置在零下20℃的環境下進行保存。

6、冷凍乾燥保藏法

（1）在低溫下將細胞快速凍結，然後在真空條件下進行乾燥，同時為了保證細胞在冷凍和水分升華的過程中不受損害，應當使用保護劑來制備細胞細胞懸液（菌在凍結和脫水過程中起到保護作用的溶質），通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。

（2）乾燥後的菌種在真空下封裝，和空氣隔絕，從而實現長期保藏。

（3）該方法兼具低溫、乾燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除開絲狀真菌的菌絲體外，其它各類微生物大多都適用。

❽ 微生物的保藏技術各自特點

1、傳代保存法：有些微生物當遇到冷凍或乾燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助於傳代培養保存法。傳代培養就是要定期地進行菌種轉接、培養後再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產菌種的保存。傳代保存時，培養基的濃度不宜過高，營養成分不宜過於豐富，尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內盡量降低。培養溫度通常以稍低於最適生長溫度為好。若為產酸菌種，則應在培養基中添加少量碳酸鈣。傳代培養保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：①菌種管棉塞經常容易發霉;②菌株的遺傳性狀容易發生變異;③反復傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物
質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉種，工作量大;⑤雜菌的污染機會較多。

2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用於黴菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。此法可防止乾燥，並通過限制氧的供給而達到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡便的優點，同時也適用於不宜冷凍乾燥的微生物(如產孢能力低的絲狀菌)的保存。

、載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進行乾燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如
①土壤保存法：主要用於能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。②砂土保存法。③硅膠保存法。④磁珠保存法。⑤麩皮保存法。⑥紙片(濾紙)保存法

4、懸液保存法：即使微生物混懸於適當溶液中進行保存的方法。常用的有①蒸餾水保存法：本法應注意避免水分的蒸發。②糖液保存法

5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主後加以保存的方法。

6、冷凍保存法：適用於抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結的情況下而不受損傷，而對其它大多數微生物而言，無論在細胞外凍結還是在細胞內凍結，都會對菌體造成損傷，

7、冷凍乾燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分。事實上，從菌體中除去大部分水分後，細胞的生理活動就會停止，因此可以達到長期維持生命狀態的目的。該方法適用於絕大多數微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。

8、甘油管保藏法