實驗室常用的微生物菌種保藏方法

1. 實驗室菌種保存有哪些方法呀

1、液體石蠟覆蓋法：他是指斜面培養物和穿刺培養物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，不但可以阻止氧氣進入，同時又可以避免菌種死亡。
2、就是在動物、昆蟲、雞胚內感染並傳代，此法相當於一般微生物的傳代培養保藏法。
3、是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而後進行乾燥的保藏法。
4、可以用低溫冰箱，乾冰酒精快速凍結，氮氣等保存。
5、先使微生物在極低溫度(-70℃左右)下快速冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分(真空乾燥)。

2. 常用的菌種保存方法有哪些

菌種保藏是食用菌產業的一項基礎工作，是確保野生種質資源基因留存和現有生產用種遺傳性能相對穩定的必要手段。菌種保藏的方法多種多樣，有的雖然保藏效果好，但投資高或操作繁雜。在生產實踐中，更需要設備投入少，能保障菌種不死亡、不污染、最大限度地保持優良種性的簡便方法，如斜面低溫短期保藏和自然基質較長期保藏相結合的方法。

一般而言，對母種進行長期保存，對原種進行短期保存。須保證優良菌種的性狀和活力不發生變異，不死亡，不被污染，確保其純度。因此，保存方法應具備取材容易、操作方便、菌種不易退化、長期保存不污染雜菌等優點。常用的菌種保存方法如下：

（一）斜面低溫保藏 該法的優點是保藏方便且所佔空間較小。具體做法是：菌絲長滿斜面後，放在0～5℃保存。以後每隔一定時間（2～3個月）轉管一次。轉管保存不能長期用PDA培養基，否則種性易退化，灰樹花降解木質纖維素的能力減弱。因此隔一定時間（1年左右）須把菌種轉接到木屑培養基上復壯，之後挑選健壯無污染的菌絲再轉回PDA培養基保存。在長期保存過程中，要防棉塞受潮滋生雜菌。菌種試管口最好用蠟燙封，以防培養基內水分過快蒸發。增加瓊脂用量（2.5%～3%）可減緩水分蒸發。還要防止菌種管上的標簽脫落而造成種系混雜。

斜面低溫保藏方法簡便易行，能隨時觀察保藏菌株的活力和純度，一旦染雜，肉眼能及時發現。

（二）自然基質保藏 此法是根據灰樹花的特性，利用自然基質保藏其菌種的方法。灰樹花是木腐菌，可以採用以木屑為主料的培養基。自然基質營養全面，且大部為緩釋養分，不易產生營養過剩或飢餓；其次，培養基理化性狀好，可吸收或緩沖菌絲代謝出的有害物質，水分與通氣協調平衡，部分菌絲扎入基質內生長，不裸露於空氣中，菌絲呼吸強度低，生命力強。

1.原料與配方 粗、細木屑比例適當，採用板栗樹木屑最佳，粗木屑粒徑為2毫米左右，細木屑為一般圓盤鋸屑，粗、細的比例為1∶2，添加干木屑重量20%的麩皮和1%的糖，含水率為60%左右。這樣的基質通氣性好，營養豐富且供菌絲分解利用的時間長，長到基質內部的菌絲比包裹在基質外部暴露於空氣中的菌絲耐受性強。不同粒徑的基質比例適當，還能協調氣與水的矛盾。粗粒過多，架空菌絲多；細粒過多，透氣性差，菌絲生長慢。應用配方如下：

栗木屑78%，麩皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，裝入較粗大的試管中，裝料量為試管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2滅菌1.5小時。冷卻後，接入需保藏的菌種，在28℃下培養，待菌絲長滿木屑培養基時取出換上無菌橡皮塞，在0～5℃冰箱內保藏1～2年轉管一次。

2.容器與裝量 採用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗潔凈，裝量一般不超過玻璃瓶容量的3/5，填料不能過滿，瓶壁所殘留的顆粒須擦拭乾凈，否則保藏的菌種易引起污染。

3.滅菌和冷藏 滅菌時若採用棉塞封口，基質表層易失水，接種成活率低，即使菌絲復活，生長也很緩慢，所以最好採用聚丙烯膜封口，接種後換用無菌棉塞培養，待菌絲長滿後再換成有孔滅菌膠塞冰箱保藏。

用上述方法保藏的菌種經3年貯放後，接出成活率均達90%以上，出菇驗證產量及子實體形態特徵均無明顯變化。因此，自然基質保藏法具有保存期長，菌種遺傳性能相對穩定的特點。

（三）木粒PDA斜面保藏 灰樹花在自然狀態下易發生於栗樹根部，這說明其營養需求較為特殊。根據灰樹花這種習性，在PDA基礎上添加適量的栗樹木粒製成母種培養基。在多年的使用中發現，用該培養基培養的母種生長勢好，在轉接原種時，適應能力強，萌發定植快；用作菌種保藏基質時，保藏時間長，並能很好保持菌種的優良性狀。

1.木粒PDA的製作 選取栗樹邊材，加工成0.3～0.5厘米的顆粒，及時烘乾或曬干備用。稱取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解於1升清水中配製成營養液。將營養液倒入盛有木粒的小鋁鍋中，營養液以完全浸沒木粒為准。煮沸10分鍾，以加快木粒對營養液的吸收速度，起鍋靜置30分鍾讓木粒吸足營養液。撈出木粒，瀝掉表面的水，裝入試管，裝量為試管長的1/6，最多不得超過試管長的1/5，否則在擺制斜面時，不易使木粒均勻分散於斜面的表面上。

選取新鮮的馬鈴薯，去皮並切成薄片，稱取200克放入小鋁鍋中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁熱過濾取汁，並補足1升的體積。稱取瓊脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先將瓊脂剪碎，加入到馬鈴薯濾液中，繼續用文火加熱，使瓊脂溶化。待瓊脂完全溶化後，加入稱好的其他3種營養成分，攪拌使這些物質溶解均勻，趁熱裝入已裝有木粒的試管中，裝至試管長的1/3處，塞上棉塞。

在0.8～1千克/厘米2蒸氣壓下滅菌40分，待氣壓降至0時，開蓋取出，趁熱輕輕抖拍試管，使木粒分散後即可擺制斜面，並使木粒呈半裸狀分布於斜面上，待凝固後便製成了木粒PDA培養基。

2.生長及保藏效果 木粒PDA斜面上培養的灰樹花母種，菌絲生長迅速、良好，12天即可長滿試管，但菌絲的後期生長勢更為粗壯、濃密，後勁足。轉接原種時，菌種適應力強，定植快。這表明，灰樹花菌絲的生長速度、生長勢不僅取決於本身的遺傳性，而且很大程度上取決於培養基的營養。常規PDA的營養成分，主要是可溶性的速效性營養，前期營養豐富，營養利用直接，因而前期菌絲生長迅速、良好，後期營養則不足，菌絲生長不良，長勢欠佳。木粒PDA由於在增添了木粒這一緩效性營養，就木腐性的灰樹花而言，營養配伍合理，補充了菌絲生長後期所需的營養，因此後勁足。

菌絲體對基質的分解利用是通過菌絲細胞分泌的胞外酶，將基質中的大分子營養分解成小分子營養後才被吸收利用的，而這些胞外酶大多為誘導酶，其合成與分泌受基質的誘導和分解產物阻遏機制調節。就纖維素酶而論，許多易代謝碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同時伴隨著菌絲體的旺盛生長，酶的大量合成則出現在易代謝碳源基本耗盡之後，且受到基質纖維素的誘導，常規PDA基質，到葡萄糖等易代謝碳源基本耗盡的後期，由於營養的缺乏，菌絲生理機能下降，酶的合成量減少。而木粒PDA不僅含有易代謝碳源——葡萄糖，又含有木粒這一緩效性營養，前期葡萄糖促進了菌絲體旺盛生長，獲取了大量的菌絲體，表現為菌絲粗壯、濃密。到了易代謝碳源耗盡的後期，木粒一方面補充了後期所需的營養，使菌絲的生埋機能維持在一定的水平；另一方面木粒的纖維素激活菌絲細胞纖維素酶的誘導機制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰樹花較強的分解木材的能力，因此，用該培養基培養的母種在轉接原種時適應力強，萌發定植快。因部分菌絲長入木粒內部，抵抗不良環境的生存能力增強，種質不易退化。木粒PDA灰樹花菌種，在0～5℃保藏2～3年再轉管活化，成活率仍達到90%左右。此外，木粒PDA應用於木腐性灰樹花種的提純復壯，效果也較理想。

（四）石蠟隔氧封藏 具體做法是將液態石蠟分裝入三角瓶內，裝量達瓶空間的1/3，塞好棉塞，於121℃滅菌2小時，然後置40℃溫箱中，使其水分蒸發，或置於乾燥器內數日以除去水分，石蠟呈透明狀為宜。在無菌條件下，用無菌吸管裝入已長好菌絲的斜面試管，使液面高出斜面頂部1厘米左右。塞上無菌橡皮塞，豎直保存。此法可使菌種存活3年以上，但以1～2年移植一次為好。移植時不必倒出石蠟，用接種鉤取一塊菌絲即可。因轉移時帶有石蠟，菌絲生長弱，需要再轉管1～2次，方能復壯。

3. 菌種保存三種主要方法 菌種保存的方法有哪些

1、斜面低溫保藏法：將菌種接種到適合的固體斜面培養基上，等到菌種充分生長過後，使用油紙將棉塞部分包紮好，然後轉移至2-8℃的冰箱中進行保存。如果是黴菌、放線菌及有芽孢的細菌，一般可以保存2-4個月左右，需要移種一次。如果是酵母菌，一般可以保存2個月左右，需要每個月移種一次。

2、液體石蠟覆蓋保藏法：將液體石蠟裝在三角燒瓶中，並使用棉塞塞好，用牛皮紙進行包紮，然後在0.1MPa，121.3℃的環境下滅菌30分鍾左右，接著將其放置在40℃的溫箱之中，將水汽蒸發掉。將需要保藏的菌種，用適合的斜面培養基進行培養，得到健壯的孢子或者是菌體。使用滅菌過的吸管將液體石蠟吸出，注入斜面上，用量為高出斜面頂端1cm左右為宜。將試管直立，放置在低溫或者是室溫之下進行保存。黴菌、放線菌、芽孢細菌可以保藏2年以上不死，酵母菌可以保藏1-2年，一般無芽孢細菌可以保藏1年，腦膜炎球菌可以保藏3個月左右（37℃環境下）。

3、濾紙保藏法：准備好濾紙條（0.5×1.2cm），安瓿管（0.6×8cm），然後每個安瓿管放置1-2張濾紙條，塞上棉塞，在0.1MPa，121℃的環境下滅菌30分鍾左右。將菌種在適合的斜面培養基上培養，得到健壯的菌體。在滅菌培養皿中滴加1-2ml的滅菌脫脂牛乳，並取數環菌苔在牛乳內混合均勻，製成濃懸液，然後使用鑷子從安瓿管中取出濾紙條，浸入菌懸液中，吸飽後，放回安瓿管中，塞上棉塞。將安瓿管放入乾燥器中（內有五氧化二磷作吸水劑），並用真空泵抽氣至干。將棉花塞入管內，用火焰熔封，然後放置在低溫環境下保存。

4. 菌種保存的方法有哪些，菌種傳代操作規程

二、菌種傳代操作規程

1、點燃酒精燈，在火焰旁的上方灼燒接種環。

2、將原有的菌種斜面培養基（菌種管）和待接種的新斜面培養基（接種管）用左手的拇指、食指和中指夾住，菌種管在前，接種管在後，然後斜持試管（45°），讓試管內斜面向上，兩個試管的口子平齊。

3、右手在火焰旁邊轉動兩管的棉塞，然後右手拿著接種環的柄端，垂直將接種環在火焰上灼燒，頂端的環必須燒紅，而且凡是接種時進入試管的部分，均應通過火焰灼燒。

4、使用右手的小指和手掌之間以及無名指和小指之間，將兩管的棉塞拔出，拿住，然後將試管在火焰上通過。

5、將接種環插入菌種管內，接觸無菌苔生長的培養基，待冷後，從斜面上挑取少許菌苔，然後迅速插入接種管，在斜面上輕輕劃線接種（由下而上劃直線，然後由下往上劃曲線）。

6、接種完畢後，將管口通過火焰滅菌，並將棉塞塞上。

5. 菌種的長期保存方法 菌種保藏

1、傳代培養保藏法：包括又有斜面培養、穿刺培養、皰肉培養基培養等，培養後於4-6℃冰箱內保存。其中斜面培養法是將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌充分生長後，棉塞部分用油紙包紮好，移至2-8℃的冰箱中保藏。保藏時間依微生物的種類而有不同，黴菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2-4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次。此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，優點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養基的物理、化學特性不是嚴格恆定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀，污染雜菌的機會亦較多。

2、液體石蠟覆蓋保藏法：液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養物和穿刺培養物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養基水分蒸發而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達到菌體與空氣隔絕，使菌處於生長和代謝停止狀態，同時石蠟油還防止水分蒸發，在低溫下達到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4-4℃下，液體石蠟法適用於不產孢子的菌種。此法實用而效果好。黴菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般無芽孢細菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌，在37℃溫箱內，亦可保藏3個月之久。此法的優點是製作簡單，不需特殊設備，且不需經常移種。缺點是保存時必須直立放置，所佔位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養物移種後，接種環在火焰上燒灼時，培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。

3、載體保藏法：載體保藏法是將微生物吸附在適當的載體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而後進行乾燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應用相當廣泛。

4、寄主保藏法：寄主保藏法用於尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染並傳代，此法相當於一般微生物的傳代培養保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍乾燥保藏法進行保藏。冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、乾冰酒精快速凍結（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

5、甘油管保存法：甘油管冷凍保藏法是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養好的斜面菌種用無菌水製成高濃度的菌懸液。取1ml滅菌甘油放入與菌液充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，於-70℃下凍存。-20℃保存時間較短。或採用體積比為8：2的甘油-生理鹽水，加入新鮮培養的菌體肉湯，混合均勻後至-20℃冰箱保存。該方法適用於一般細菌的保存，同時也適用於鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現象發生。甘油-生理鹽水保存液保存菌種優於甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養物適量增加保存液的營養成分，從而更好地保護了待保存的菌株。

6、冷凍乾燥保藏法：先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分（真空乾燥），其中真空冷凍乾燥法最常見。真空冷凍乾燥保藏法是兼具低溫、乾燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜於絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。真空冷凍乾燥法是在低溫下快速將細胞凍結，然後在真空條件下乾燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細胞的損害，要採用保護劑來制備細胞懸液，使菌在凍結和脫水過程中起到保護作用的溶質，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態下，抽真空減壓，使凍結的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到乾燥。乾燥後的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。

6. 常見的保存菌種的方法 常見的保存菌種的方法介紹

1、斜面傳代保藏法。此法是把菌種接種到所需要的斜面培養基上，在最適溫度下培養，長出豐滿的菌體細胞或孢子後，置於4℃冰箱或冷庫保藏。此法方法簡單，存活率高，適用於各類菌株的保藏。但保藏時間不長，需定期傳代，傳代過程中易退化污染，只適用於短期保藏。

2、甘油管冷凍保藏法。甘油管保藏法是將富集培養後的菌液與已滅好的甘油充分混合，使終濃度控制在20-30%之間，分裝至甘油管中，最後置於-70℃冰箱或液氮罐保藏。此法相比斜面傳代保藏時間更長，溫度越低，保藏時間越久。

3、液體石蠟保藏法。液體石蠟保藏是在斜面培養或穿刺培養上加一層液體石蠟，液體石蠟可以防止失水乾燥，隔絕空氣，降低菌種細胞代謝速率。此法更適用於細菌和酵母菌。

4、沙土管保藏法。沙土管保藏法是把微生物附著在砂質載體上，目的是為了將微生物賴以生存的水分蒸發掉，使細胞處於休眠和代謝停滯狀態，從而達到較長保藏的目的。此法適用於黴菌和放線菌。

5、真空冷凍乾燥保藏法。該法集中了菌種保藏中低溫、缺氧、乾燥和添加保護劑等多種有利條件，使微生物的代謝處於相對靜止狀態。同時該法可用於細菌、放線菌、絲狀真菌、酵母菌及病毒的保藏。因而具有保藏菌種范圍廣、時間長（10-20年）、存活率高等特點，是目前最有效的菌株保藏方法之一。

7. 菌種保藏的常用方法及特點

（1）斜面低溫保藏。是一種最常用、最簡便的菌種保藏方法。首先將需要保藏的菌種接到斜面培養基上，在適宜的溫度條下培養，當菌絲健壯地長滿斜面時，即將此試管菌種取出，放置於4 ℃的冰箱中保藏。特點：
①簡單易行，適用於各類菇類菌種保藏，是目前生產及科研普遍採用的一種方法；②保藏時間短，需6個月轉接一次，轉管次數多菌絲變異的可能性大；③如改用橡皮塞並用石蠟扣，可保藏1年～3年。
（2）液體石蠟保藏。液體石蠟保藏也稱為礦油保藏，即用礦油覆蓋試管斜面試管保藏的方法。礦油是指無色、透明、黏稠、性質穩定、不易被微生物分解的石蠟油和液體石蠟，將其覆蓋在斜面菌種之上，可以隔絕空氣，防治培養基水分蒸發，抑制微生物的代謝活動，推遲細胞老化，從而達到長期保藏菌種的目的。特點：
①方法簡便易行，保藏條件不嚴格，保藏時間長，可作為長期保藏菌種的方法；②菌種必須垂直放，放置不方便。
（3）濾紙保藏。濾紙保藏是一種以無菌濾紙作為食用菌孢子吸附載體長期保藏菌種的方法，又稱濾紙孢子保藏法。特點：技術要求高，設備費用大，菌種不易衰老退化，菌種保藏時間長很少變異。
（4）自然基質保藏。自然基質保藏就是以不含毒性、刺激性和抑菌性而富含營養的自然生長的基質作培養基來保藏菌種的方法。自然基質很多，食用菌常用的自然基質有發酵的糞草、木屑及枝條基質等，取材方便，製作方法簡便，保藏時間也較長。使用時，只需取一塊、一粒或一條培養物放在新鮮的培養基上，並在適溫下培養即可。特點：方法簡便易行，保藏時間長。

8. 菌種保藏的方法 菌種保藏的方法有哪些

1、沙土保藏法。取河沙加入10%稀鹽酸，加熱煮沸30分鍾，以去除其中的有機質。倒去酸水，用自來水沖洗至中性。烘乾，用40目篩子過篩，以去掉粗顆粒，備用。另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。烘乾，碾碎，通過100目篩子過篩，以去除粗顆粒。

2、濾紙保藏法。將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條，裝入0.6×8cm的安瓿管中，每管1-2張，塞以棉塞，1.05 kg/cm，121℃滅菌30分鍾。將需要保存的菌種，在適宜的斜面培養基上培養，使充分生長。取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養皿或試管內，取數環菌苔在牛乳內混勻，製成濃懸液。用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內，使其吸飽，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的乾燥器中，用真空泵抽氣至干。將棉花塞入管內，用火焰按圖Ⅶ-13熔封，保存於低溫下。需要使用菌種，復活培養時，可將安瓿管口在火焰上燒熱，滴一滴冷水在燒熱的部位，使玻璃破裂，再用鑷子敲掉口端的玻璃，待安瓿管開啟後，取出濾紙，放入液體培養基內，置溫箱中培養。細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏，前兩者可保藏2年左右，有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久。此法較液氮、冷凍乾燥法簡便，不需要特殊設備。

3、寄主保藏法。寄主保藏法用於尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內感染並傳代，此法相當於一般微生物的傳代培養保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍乾燥保藏法進行保藏。冷凍保藏法可分低溫冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、乾冰酒精快速凍結（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法，其中最常見的是甘油管冷凍保藏法。

4、甘油管保存法。甘油管冷凍保藏法是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養好的斜面菌種用無菌水製成高濃度的菌懸液。取1ml滅菌甘油放入與菌液充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，於-70℃下凍存。-20℃保存時間較短。或採用體積比為8：2的甘油-生理鹽水，加入新鮮培養的菌體肉湯，混合均勻後至-20℃冰箱保存。該方法適用於一般細菌的保存，同時也適用於鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現象發生。甘油-生理鹽水保存液保存菌種優於甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養物適量增加保存液的營養成分，從而更好地保護了待保存的菌株。

5、冷凍乾燥保藏法。先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然後在減壓下利用升華現象除去水分（真空乾燥），其中真空冷凍乾燥法最常見。真空冷凍乾燥保藏法是兼具低溫、乾燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜於絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。真空冷凍乾燥法是在低溫下快速將細胞凍結，然後在真空條件下乾燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細胞的損害，要採用保護劑來制備細胞懸液，使菌在凍結和脫水過程中起到保護作用的溶質，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態下，抽真空減壓，使凍結的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到乾燥。乾燥後的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。

9. 微生物菌種保藏的方法有哪些 完整點,是道簡答題.分值很大.

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1、低溫定期移植保藏法.將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養基上,適溫培養,當菌絲健壯地長滿斜面時取出,放在3-5℃低溫乾燥處或4℃冰箱、冰櫃中保藏,每隔4-6個月時間移植轉管一次,具體應根據菌種特性決定.保藏時要注意環境溫度不能太高,以防黴菌通過棉塞進入管內.因此,若用棉塞,可用干凈的硫酸紙或牛皮紙包紮棉塞,即可減少污染的機會,也可防止培養基乾燥.除草菇菌種外,其他食用菌菌種都能採用此法保藏.
2、液體石蠟保藏法.取化學純液體石蠟(要求不含水分、不霉變)裝於三角瓶中加棉塞並包紙,在1公斤/平方厘米壓力下滅菌1小時,再放入40℃恆溫箱中數天,以蒸發其中水分,至石蠟油完全透明為止.將處理好的石蠟油移接在空白斜面上,28-30℃下培養2-3天,證明無雜菌生長方可使用.然後用無菌操作的方法把液體石蠟注入待保藏的斜面試管中.注入量以高出培養基斜面1-1.5厘米,塞上橡皮塞,用固體石蠟封口,直立於低溫乾燥處保藏.保藏時間在一年以上,在低溫下,保藏時間還可延長.
3、沙土管保藏法.取河沙用水浸泡洗滌數次,過60目篩除去粗粒,再用10%鹽酸浸泡2-4小時,除去其中有機物質,再用水沖洗至流水的ph達到中性,烘乾備用.同時取貧脊土或菜園土用水浸泡,使呈中性,沉澱後棄去上清液,烘乾碾細,用100目篩子過篩,將處理好的沙與土以(2-4):1混勻,用磁鐵吸出其中的鐵質,然後分裝小試管或安瓿內,每管裝量0.5-2克,塞棉塞,用紙包紮滅菌(1.5公斤/平方厘米,1小時),再乾熱滅菌(160℃,2-3小時)1-2次,進行無菌檢驗,合格後使用.將已形成孢子的斜面菌種,在無菌條件下注入無菌水3-5毫升,刮菌苔,製成菌懸液,再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中,以浸透砂土為止.將接種後的沙土管放入盛有乾燥劑的真空乾燥器內,接上真空泵抽氣數小時,至沙土乾燥為止.真空乾燥操作需在孢子接入後48小時內完成,以免孢子發芽.制備好的沙土管用石蠟封口,在低溫下可保藏2-10年.
4、濾紙片保藏法.取白色(收集深色孢子)或黑色(收集白色孢子)濾紙,剪成4×0.8厘米的小紙條,平鋪在培養皿中用紙包裹進行滅菌(1公斤/平方厘米,30分鍾).採用鉤懸法收集孢子,讓孢子落在濾紙條上.將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中,再將保藏試管放入乾燥器中1-2天,除去濾紙水分,使濾紙水分含量達2%左右,然後低溫保藏.
5、自然基質保藏法
⑴麥粒保藏法：取無癟粒、無雜質的小麥淘洗干凈,浸泡12-15小時,加水煮沸15分鍾,繼續熱浸15分鍾,使麥粒脹而不破,瀝干水分攤開晾曬,使麥粒的含水量在25%左右.將碳酸鈣、石膏拌入熟麥粒中(麥粒、碳酸鈣、石膏比例為10公斤:133克:33克),拌和均勻後裝入試管中,每管約2-3克,然後清洗試管,塞棉塞,滅菌1.5(1.5公斤/平方厘米,2小時),經無菌檢查合格後備用,試管基質冷卻後接種,適溫培養,待菌絲長滿基質後用石蠟塗封棉塞,放低溫保藏.2年左右轉接一次.
⑵麩曲保藏法.取新鮮麩皮,過60目篩除去粗粒.將麩皮和自來水按1:1拌勻,裝入小試管,每管約裝1/3高度,加棉塞用紙包紮,高壓滅菌(1.5公斤/平方厘米,30分鍾),經無菌檢查合格後備用,將生長在斜面培養基上的健壯菌種,移種至無菌麩曲管中,移種時注意盡管搗勻小試管中的麩皮,呈疏鬆狀態,在適溫下培養至菌絲長滿麩皮為止,將麩曲小管置乾燥器中,在低溫或適溫下保藏.
6、生理鹽水保藏法.取純氯化鈉0.7-0.9克,放入100%毫升蒸餾水中,攪拌均勻分裝試管,每管5-10毫升,進行滅菌(1公斤/平方厘米,30分鍾),經無菌檢查合格後備用,將待保藏的菌種接入馬鈴薯葡萄糖液體培養基中適溫振盪培養5-7天.無菌操作吸取少許培養菌種注入經檢驗合格的生理鹽水試管中,塞上無菌橡皮塞,用石蠟塗封,在室溫或低溫保藏.
7、冷凍真空乾燥法.將已培養、生長豐富的菌體或孢子懸浮於滅菌的血清、卵白、脫脂奶製成菌懸液,將懸液以無菌操作分裝於滅菌的玻璃安瓿瓶中,每管約0.3-0.5毫升,然後用耐壓橡皮管與冷凍乾燥裝置連接,安瓿瓶放在冷凍槽中於-30℃至-40℃迅速冷凍,並在冷凍狀態下抽空乾燥,並在真空狀態下熔封安瓿,在-20℃保存,一般可保存十年以上,但成本較高.
8、液氮超低溫保藏法.首先將要保藏的菌種製成菌懸液備用；其次,准備安瓿瓶,每瓶加入0.8毫升冷凍保護劑10%(體積比)甘油蒸餾水溶液,塞棉塞滅菌(1公斤/平方厘米,5分鍾).無菌檢查後,接入要保藏的菌種,火焰熔封瓶口,檢查是否漏氣,將封好口的安瓿瓶放在凍結器內,以每分鍾下降1℃的速度緩慢降溫,使保藏品逐步均勻地凍結,直至-35℃,以後凍結速度就不需控制,安瓿凍結後立即放入液氮罐內,在-150至-196℃保藏,該法只有少數科研院所使用.