鑒定蛋白質純度的常用方法

Ⅰ 一般採用什麼方法檢驗蛋白質即鑒定

一般用雙縮脲試劑鑒定，雙縮脲試劑可以和蛋白質發生紫色反應。

Ⅱ 蛋白質純度的測定方法有哪些在線等答案

超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量.
含量測定方法很多：
凱氏定氮：靈敏度低，適用於0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2％，干擾少，費時8小時
雙縮脲法（Biuret法）：靈敏度低1～20mg，中速20~30分鍾
紫外吸收法：較為靈敏50～100mg，快速5～10分鍾
Folin－酚試劑法（Lowry法）：靈敏度高 ～5mg，40～60分鍾，操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化
考馬斯亮藍法(Bradford法)：靈敏度最高1～5mg，5～15分鍾，常用

分子量測定：
SDS-PAGE：還原SDS測定結果比較接IC-MS，價格適中，常用
高效凝膠過濾色譜：標准蛋白質和待測蛋白質形狀一致時，准確高，差別越大越不準確
電噴霧離子化質譜：最准確

等電點測定：在不同pH條件下測量蛋白質的電泳遷移率，然後用遷移率對pH作圖，對應於遷移率為零的pH就是蛋白質的等電點。

Ⅲ 常用來測定蛋白質含量的方法有哪些優缺點是什麼

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果准確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能回收。 

缺點：①測定蛋白質含量的准確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。

缺點：由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

Ⅳ 蛋白質純度鑒定的方法有哪些

電泳,
蛋白質電泳 現在常用就是 SDS 聚丙乙烯醯胺凝膠電泳
特點
1）靈敏度高
2）測定快速、簡便
3）干擾物質少
液相色譜
高效液相色譜是完全可以純化蛋白質並且進行蛋白質純度鑒定的
但建議還是使用蛋白質電泳 最主流 最有效的方法

Ⅳ 用什麼進行蛋白質純度的鑒定

SDS 聚丙乙烯醯胺凝膠電泳

考馬斯亮蘭法雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。Bradford法的突出優點是：（1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合後產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鍾左右。由於染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鍾即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鍾至20分鍾之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不幹擾此測定法。此法的缺點是：（1）由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用於不同蛋白質測定時有較大的偏差，在製作 標准曲線時通常選用 g—球蛋白為標准蛋白質，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3）標准曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標准曲線來測定未知蛋白質的濃度。

Ⅵ 蛋白質純度鑒定最好的兩種方法

SDS 聚丙乙烯醯胺凝膠電泳（算是相對較好的）

考馬斯亮蘭法雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。Bradford法的突出優點是：（1）靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合後產生的顏色變化很大，蛋白質－染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鍾左右。由於染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鍾即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鍾至20分鍾之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不幹擾此測定法。此法的缺點是：（1）由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用於不同蛋白質測定時有較大的偏差，在製作 標准曲線時通常選用 g—球蛋白為標准蛋白質，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3）標准曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標准曲線來測定未知蛋白質的濃度

Ⅶ 常用的蛋白質含量測定方法有哪些

①凱氏定氮法
原理：蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉化為銨鹽，在強鹼性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最後用標准酸滴定硼酸，通過標准酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在鹼性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵，故多肽、蛋白質等都有雙縮脲（biuret）反應，產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg)，且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 准確度 較高，不受蛋白質的種類影響。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑（鹼性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下，蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+， Cu+能定量地與Folin－酚試劑反應生成藍色物質，600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg)，但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算：
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260為角標）
⑤色素結合法（Bradford 法）
直接測定法：利用蛋白質與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑，會在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候，因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境，因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多，吸到蛋白質上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法：蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素，以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4』-二羧-2,2』-二喹啉）法與Lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使Cu2+轉變Cu+後，進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin試劑穩定，因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色，顏色的改變與蛋白質有定量關系，可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘)，則可追蹤該金屬。

Ⅷ 如何鑒定蛋白質

鑒定蛋白質可以用雙縮脲試劑。

雙縮脲（NH2CONHCONH2）由兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物，在強鹼性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，雙縮脲反應產生的紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。

優點：雙縮脲法測定蛋白質的測定范圍是1~10mg蛋白質，操作簡單、快捷。既適合手工操作，又適合自動化分析，重復性好、線性關系好， 雙縮脲試劑可以長期保存（ 若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製）。

缺點：靈敏度差，測定范圍窄，樣品需要量大，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，因此它常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。 干擾測定的物質包括有：在性質上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖液，因為它們產生陽性呈色反應，銅離子也容易被還原，有時出現紅色沉澱。

蛋白質的作用：

人體內的一些生理活性物質如胺類、神經遞質、多肽類激素、抗體、酶、核蛋白以及細胞膜上、血液中起「載體」作用的蛋白都離不開蛋白質，它對調節生理功能，維持新陳代謝起著極其重要的作用。人體運動系統中肌肉的成分以及肌肉在收縮、作功、完成動作過程中的代謝無不與蛋白質有關，離開了蛋白質，體育鍛煉就無從談起。

在生物學中，蛋白質被解釋為是由氨基酸借肽鍵聯接起來形成的多肽，然後由多肽連接起來形成的物質。通俗易懂些說，它就是構成人體組織器官的支架和主要物質。蛋白質缺乏：成年人：肌肉消瘦、肌體免疫力下降、貧血，嚴重者將產生水腫。

未成年人：生長發育停滯、貧血、智力發育差，視覺差。蛋白質過量：蛋白質在體內不能貯存，多了肌體無法吸收，過量攝入蛋白質，將會因代謝障礙產生蛋白質中毒甚至於死亡。

以上內容參考網路-雙縮脲試劑

以上內容參考網路-蛋白質

Ⅸ 鑒定蛋白質有哪些方法

蛋白質含量的測定：
1 凱氏定氮法
根據氮在蛋白質分子中含量恆定（平均佔16%），因此測定出樣品中氮的含量後，即可求出樣品中蛋白質含量。
2 雙縮脲法
3 福林-酚試劑法
福林-酚試劑包括兩種試劑：鹼性銅試劑，磷鉬酸及磷鎢酸的混合試劑。鹼性銅試劑與蛋白質產生雙縮脲反應。這種被作用的蛋白質中的酚基（酪氨酸），在鹼性條件下易將磷鉬酸和磷鎢酸還原成藍色的鉬藍和鎢藍，所生成藍色的深淺，與蛋白質的含量成正比。在650nm和660nm波長下測定光吸收值，即可測定蛋白質含量。
4 紫外吸收法
酪氨酸，色氨酸在280nm處左右具有最大吸收。由於在各種蛋白質中這幾種氨基酸含量差別不大，所以280nm的吸收值與濃度呈正相關。可用於蛋白質濃度的測定。