目前常用制備弱毒疫苗方法

❶ 強毒株和弱毒株的制備方法

滅活疫苗，即人們在獲得病毒以後，對其進行一定的處理，可以使病毒完全喪失活性，從而得到被殺死的病原微生物，進而製成滅活疫苗。通俗的說滅活疫苗就是一種被殺死的病毒，將其輸入人體，既不會使人染病，又可以促使人體產生抗體，抵禦病毒入侵。
減毒活疫苗是指保留一定的剩餘毒力和免疫性製成疫苗，接種人體後，使機體產生一定的感染而獲得免疫力。
弱毒(活)疫苗 分為自然毒株和人工緻弱毒株兩類。�(1)自然毒株： 在同一種病毒 的不同毒株之間, 存在著毒力和免疫原性等諸多方面的 差異。因此，尋找和篩選自然界中 毒力低而有較好免疫原性的病毒作為弱毒疫苗株，不僅在理論上是成立的，而且在實踐中 也已證明這是一個有效的途徑。目前廣泛應用的預防雞新城疫的新城疫病毒Ⅱ系弱毒疫苗 株和V�4株，都是自然弱毒株。預防犬瘟熱和犬細小病毒性腸炎的某些弱毒 疫苗分別也是由 分離到的自然弱毒株制備的。 應用具有交叉抗原的同屬異種病毒強毒株也可 以進行疫病的免疫預防, 這種強毒株對於被接種動物來說不具有致病性, 但由於具有交叉保 護性抗原, 因此具有良好的免疫性。眾所周知，Jenner應用牛痘病毒預防人的天花，是早期 預防醫學的傑出成就之一。 應用鴿痘病毒預防雞痘，應用火雞皰疹病毒預防雞的馬立克氏病以及應用牛的輪狀病毒口服 免疫小豬預防豬輪狀病毒感染等，都是這方面的成功例證。�(2)人工緻弱株：人工培養弱 毒株的方法, 主要有以下數種。①連續通 過異種動物或異種動物細胞：這是培育弱毒(活)疫苗株的傳統方法，原來不能在異種動物體 內或異種動物細胞上增殖的病毒，在長期多代的適應之後，逐漸具備了在新宿主體(或細胞) 內增殖的性能。這是一種純粹的適應性變異呢?還是新宿主對變異病毒粒子的「選擇性接受 」?目前尚難作出定論。也可能這兩種因素都起作用。為了較快育出能夠適應新宿主的毒株 ，一個重要的原則就是必須採用大劑量的接種方法，也就是在每次傳代接種時，都用盡可能 大量的病毒接種物。這與保持毒株穩定性狀的傳代方法恰恰相反，為了減少毒株的變異，傳 代接種時應該採用最高稀釋倍數也就是最小量的病毒接種物。�一旦獲得已經適應新宿主 的 變異毒株，並且證明它具有一定的穩定性能，即可進行對原宿主的毒力和免疫力鑒定。�目 前廣泛應用的豬瘟兔化弱毒(活)疫苗就是使豬瘟病毒連續通過家兔幾百代而培育成的。將口 蹄疫病毒連續通過乳兔或乳鼠，也已獲得弱毒疫苗株。牛瘟病毒在通過家兔、雞胚等後，毒 力減弱而成為弱毒疫苗株。狂犬病病毒通過家兔育成的所謂「固定毒」，更是一個突出的例 子。�通過異種動物細胞也能達到致弱病毒毒力的作用，並且已經被實踐所證明。例如使乙 型腦炎病毒通過牛腎細胞、猴腎細胞或倉鼠腎細胞，均已分別獲得了弱毒疫苗株。牛瘟病毒 通 過Vero細胞，犬瘟熱病毒通過雞胚細胞(先在雞胚內適應幾代)，犬傳染性肝炎病毒通過豬腎 細胞等，也都分別獲得了弱毒疫苗株。�②在同種細胞上馴化： 某些病毒， 例如馬傳染性 貧 血病毒， 感染范圍極窄， 除自然宿主動物及其細胞以外， 概不感染其它動物及細胞。 但 在敏 感細胞， 例如在馬屬動物體外培養的白細胞或其它細胞培養物上長期反復傳代後， 也獲得 了 弱毒疫苗株。 就是那些感染范圍較寬的病毒， 例如脊髓灰質炎病毒和犬瘟熱病毒， 分別 長 期通過猴腎細胞和犬腎細胞等敏感細胞培養傳代後，毒力也減弱，並經蝕斑分離法等純化手 段育成了 弱毒疫苗株。�由於同種細胞不象異種動物細胞那樣具有「適應性選擇」作用，因此應該盡 早採用病毒純化技術，以便盡快選出變異株。同時注意掌握培養溫度、營養液的成分和pH、 收毒時間以及接毒量等有關因素。�同種細胞馴化的另一個方法是應用現成的感染細胞 進行繼代培養。例如伊澤等(1967年)以豬瘟強毒人工感染幼豬，隨後採取其帶毒的腎細 胞培養傳代，由之獲得了弱毒株。� ③條件致死性溫敏 突變株：主要是呼吸道病毒，在32～34℃上部呼吸道時能夠有效地復制，在37℃下部呼吸道 時生長受到限制。篩選突變株時，首先利用致突變原對野生病毒誘導，使其發生無意突變， 然 後通過它們的溫敏表型進行鑒定。如流感病毒的溫敏突變株的選育就是通過該途徑獲得的。 溫敏突變株的缺點是不太穩定，容易回復其毒力。相反, 採用相似的手段培育篩選的冷適 應突變株則具有相對穩定的特性。

❷ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預防．疫苗的主要成分是該病

（1）由於該病毒的遺傳物質是RNA，故要獲得目的基因可以採用逆轉錄的方法，獲得的基因文庫稱為cDNA文庫；
（2）要想獲得大量的目的基因，可以採用PCR技術，需要的酶是耐高溫的DNA聚合酶（即TaqDNA聚合酶）；
（3）從圖中可以看出標記基因為卡那黴素抗性基因，故培養基中要添加卡那黴素從而篩選出含重組DNA的受體細胞，進行植物組織培養時的培養基和器械都要進行滅菌處理．過程⑤為脫分化，不需要光；
（4）基因工程得到的受體細胞中，外源基因一般位於一對同源染色體中的一條上，故形成的配子中不一定含有目的基因．
故答案為：（1）逆轉錄部分基因（cDNA）
（2）PCR熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）
（3）卡那黴素滅菌避光
（4）C

❸ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預防，疫苗的主要成分是該病

（1）以RNA為模板合成DNA的過程，叫做逆轉錄．用限制性核酸內切酶（限制酶）將目的基因VP1基因片段切下．
（2）重組質粒的構建是利用農桿菌的Ti質粒，VP1基因可插入到Ti質粒的T-DNA中，利用其特性整合到受體細胞染色體的DNA上．
（3）⑥-⑦為植物組織培養過程，⑥的培養基中要加入各種必需營養物質和生長素和細胞分裂素等激素．抗性基因的作用是篩選出含有目的基因的受體細胞，因此在培養基中還需要添加卡那黴素篩選出含有重組質粒的葉片小段．
（4）驗證轉基因番茄葉片提取液的免疫效力，需設置對照組進行對比，注射未轉基因的番茄葉片提取液的豚鼠作為空白對照組，注射弱毒疫苗的豚鼠作為實驗對照組．免疫效力的測定以特異性抗體的數量為參照．
故答案為：
（1）逆轉錄 限制性核酸內切酶（限制酶）
（2）T-DNA 染色體
（3）生長素和細胞分裂素 卡那黴素
（4）特異性抗體 未轉基因的番茄葉片提取液 弱毒疫苗

❹ 弱毒株系的概念

弱毒(活)疫苗 分為自然毒株和人工緻弱毒株兩類。(1)自然毒株： 在同一種病毒 的不同毒株之間, 存在著毒力和免疫原性等諸多方面的 差異。因此，尋找和篩選自然界中 毒力低而有較好免疫原性的病毒作為弱毒疫苗株，不僅在理論上是成立的，而且在實踐中 也已證明這是一個有效的途徑。目前廣泛應用的預防雞新城疫的新城疫病毒Ⅱ系弱毒疫苗 株和V4株，都是自然弱毒株。預防犬瘟熱和犬細小病毒性腸炎的某些弱毒 疫苗分別也是由 分離到的自然弱毒株制備的。 應用具有交叉抗原的同屬異種病毒強毒株也可 以進行疫病的免疫預防, 這種強毒株對於被接種動物來說不具有致病性, 但由於具有交叉保 護性抗原, 因此具有良好的免疫性。眾所周知，Jenner應用牛痘病毒預防人的天花，是早期 預防醫學的傑出成就之一。 應用鴿痘病毒預防雞痘，應用火雞皰疹病毒預防雞的馬立克氏病以及應用牛的輪狀病毒口服 免疫小豬預防豬輪狀病毒感染等，都是這方面的成功例證。(2)人工緻弱株：人工培養弱 毒株的方法, 主要有以下數種。①連續通 過異種動物或異種動物細胞：這是培育弱毒(活)疫苗株的傳統方法，原來不能在異種動物體 內或異種動物細胞上增殖的病毒，在長期多代的適應之後，逐漸具備了在新宿主體(或細胞) 內增殖的性能

❺ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預防．疫苗的主要成分是該病

（1）VPI蛋白在免疫反應中能引起機體產生特異性免疫應答，故稱之為抗原．
（2）因為口蹄疫病毒的遺傳物質為RNA，因此要獲得VP1基因可用逆轉錄的方法合成DNA；限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，將VP1基因片段切下．
（3）植物組織培養中植物激素使用：物組織培養中關鍵性激素是生長素和細胞分裂素；同時使用生長素和細胞分裂素時，兩者用量的比例影響植物細胞的發育方向；運載體中含有的標記基因是抗卡那黴素，所以加入卡那黴素可以篩選出重組質粒和普通質粒．
（4）注入疫苗後檢測特異性抗體的水平，為了使相應的結論可信，應增設兩個對照組用未轉基因的番茄葉片提取液和弱毒疫苗．
故答案為：
（1）抗原
（2）逆轉錄限制性內切酶
（3）生長素和細胞分裂素卡那黴素
（4）特異性抗體未轉基因的番茄葉片提取液弱毒疫苗

❻ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄目動物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預防．此疫苗的主要成分是

（1）VPI蛋白在免疫反應中稱之為抗原，不同生物共用一套密碼子，所以口蹄疫基因在植物體細胞中也能表達出相同產物．
（2）運載體中含有的標記基因是抗卡那黴素，所以加入卡那黴素可以篩選出重組質粒和普通質粒．
（3）pZHZ1（3.7kb，lkb=1000對鹼基）上相應的E-F區域（0.2kb）剩餘3.7-0.2=3.5Kb，經G、H切割後基因長度是1.6+3.1=1.2+3.5=4.7Kb，則VPI的長度是4.7-3.5-1.2Kb；酶G和酶H都能將重組質粒切割出兩段的原因是在VPI基因中含有酶G和酶H的酶切位點各一個，同時在質粒上含有酶G和酶H的酶切位點各一個．
（4）注入疫苗後檢測特異性抗體的水平，為了使相應的結論可信，應增設兩個對照組用未轉基因的番茄葉片提取液和弱毒疫苗．
故答案為：（1）抗原（疫苗）不同生物共用一套密碼子
（2）重組質粒或普通質粒
（3）1.2在VPI基因中含有酶G和酶H的酶切位點各一個
（4）特異性抗體未轉基因的番茄葉片提取液弱毒疫苗

❼ 疫苗的免疫接種方法有哪幾種

免疫必須做到注射部位準確，消毒嚴格，葯量准確，不能隨意改變免疫劑量，個個免疫，不漏針。採用注射途徑接種的疫苗，在瓶塞上固定一個消毒的針頭專供吸取葯液，吸液後不拔出，用酒精棉包裹，以便再次吸取。常用的免疫接種方法主要有以下幾種：

（1）皮下注射

皮下注射是目前使用最多的一種方法，大多數疫苗都是經這一途徑免疫。注射部位在豬的耳根或股內側。皮下組織吸收比較緩慢而均勻，如豬丹毒弱毒菌苗、豬丹毒氫氧化鋁甲醛菌苗、豬肺疫氫氧化鋁甲醛菌苗都可皮下注射。油類疫苗不宜皮下注射。

方法：注射部位先剪毛（無毛或少毛區也可不剪），用碘酊或酒精棉球消毒，用左手食指和中指捏起皮膚，食指壓住頂點，形成三角凹窩，右手持注射器，迅速將針頭刺入凹窩中心皮膚內2厘米深，放開皮膚，慢慢注入葯液，葯量大時應分點注射，注射完畢，拔出針頭後用棉球按住注射部位以消毒。

（2）肌肉注射

肌肉注射是將疫苗注射於肌肉內，注射部位在頸部兩側中1/3處，或臀部、股部肌肉較豐滿部位。剪毛，酒精或碘酊消毒，把針頭直刺入肌肉，注入葯物。如豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯凍干弱毒苗。肌肉注射時如果葯量偏大可分點注射，但注射時不可打「飛針」。注射時注意針頭要足夠長，以保證疫苗確實注入肌肉里。

（3）滴鼻接種

滴鼻接種是屬於黏膜免疫的一種，黏膜是病原體侵入的最大門戶，有95%的感染發生在黏膜或由黏膜侵入機體，黏膜免疫接種可刺激產生局部免疫，能對有害抗原或病原體產生高效體液免疫反應和細胞免疫反應。目前使用比較廣泛的是豬偽狂犬病基因缺失疫苗的滴鼻接種。

（4）皮膚刺種

豬痘弱毒疫苗常用此法接種，選定無血管處，用刺種針或鋼筆尖蘸取疫苗刺入。

（5）口服

即是將疫苗混於飼料或飲水裡，或抹於母豬的乳頭上經口服下，而達到接種目的。必須注意，用於拌疫苗的飼料要新鮮，不宜用酸敗或發酵飼料拌。大小動物要分開喂，使其能均勻吃到含疫苗飼料。如豬肺疫弱毒菌苗用此方法免疫接種，飲水免疫先停水4小時左右，再飲水免疫接種，稀釋疫苗的水要純凈，尤其不能用含有消毒葯物的水稀釋疫苗。

（6）氣管內注射和肺內注射

這兩種方法多用在豬氣喘病的預防接種。但目前氣喘病疫苗已經生產出可用於肌肉注射的疫苗了。

（7）穴位注射

在注射疫苗時多採用後海穴注射，能誘導較好免疫反應。目前，在養豬生產中應用這種方法免疫的疫苗有傳染性胃腸炎疫苗、豬瘟疫苗和口蹄疫疫苗。其中豬瘟兔化弱毒疫苗，後海穴比常規肌肉免疫注射更具有堅強的保護力。採用穴位注射要有確切的注射位點，進針有方向，下針有深度，劑量准確。

（8）超前免疫

超前免疫是指在仔豬未吃初乳時注射疫苗，注苗後1～2小時才給吃初乳，目的是避開母源抗體的干擾和使疫苗毒盡早佔領病毒復制的靶位，盡可能早刺激產生基礎免疫，這種方法常用在豬瘟的免疫。

❽ 免疫接種方法有哪些在應用中如何確定

免疫接種方法根據其接種途徑可分為：滴鼻、滴眼、氣霧、飲水、刺種、皮下或肌肉注射等。採用哪種免疫接種方法，既要考慮疫（菌）苗的特性和免疫效果，又要考慮操作方便和經濟效益。

（1）滴眼滴鼻免疫。這種接種方法勞動強度大，時間長，對操作人員的責任心要求強。雖然禽群應激反應較大，但免疫效果確實，尤其適合預防呼吸道疾病的活疫苗。適用於雞新城疫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ系疫苗，雞傳染性支氣管炎疫苗和雞傳染性喉氣管炎弱毒疫苗的接種。滴眼滴鼻的工具可用滴管或滴眼瓶。事先用1毫升水試一下，看能滴多少滴，按每羽1～2滴，根據疫苗包裝用生理鹽水稀釋，不宜用冷開水，以免其中的雜質殺死部分病毒，影響效果。此方法多用於雛雞，將稀釋好的疫苗點眼或滴入鼻孔內，滴眼的效果稍好於滴鼻。兩滴疫苗最好分別滴進眼和鼻孔內。其操作的關鍵是接種後稍等片刻，待疫苗液確已吸入眼或鼻內再放開雞只。

（2）飲水免疫。它能減輕勞動強度和雞群應激，適合建立消化道及呼吸道的局部免疫。但其影響因素較多，尤其對環境溫度、疫苗劑量、水質、飲水量、飲水器衛生等注意不夠時免疫效果將受到較大影響。可靠性差，主要是免疫水平不整齊。由於本方法要求使用活疫苗，所以在我國目前的條件下，不適宜過多地採用飲水免疫。飲水免疫是將疫苗溶於飲水中，讓雞群在1～2小時以內飲完。可用於新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、禽腦脊髓炎等弱毒疫苗都可以採取飲水免疫。為了使飲水免疫達到一定的效果，必須注意如下幾點：①採用飲水免疫的疫苗必須是高效價的，用量加倍或再稍多一點。②為了使含有疫苗的飲水能在1～2小時以內飲完，先要停水2～5小時，依氣溫而定，溫度高停水時間短，反之則長。每隻雞的飲水量大約是：5～7日齡4～5毫升，10～14日齡8毫升，20日齡12毫升，28日齡17毫升，40～50日齡28毫升，開產前70毫升。飲疫苗後也要停止飲水1小時。③為了減少疫苗損失，最好能在稀釋疫苗的水中加入0.3%的脫脂奶粉或鮮牛奶。鮮牛奶應煮沸，靜置冷卻，濾除表層奶脂，再加入飲水中。④飲水免疫時，飲水器要充足，以保證所有的雞能在短時間內飲到足夠的免疫量。飲水器要清潔衛生，不要用金屬飲水器。⑤採用飲水免疫時，二次免疫間隔時間不宜過長。

（3）氣霧免疫。可以節省勞動力。若操作得當則效果甚好。很適合對呼吸道有親嗜性的弱毒疫苗。如新城疫Ⅳ系苗、雞傳染性支氣管炎疫苗。但本方法容易激發呼吸道感染，引起慢性呼吸道病的暴發。所以免疫前必須對氣霧機的性能進行測試，嚴格控制霧滴大小。一般雛雞用霧滴的直徑為30～50微米，成年雞為5～10微米。噴霧前後幾天應在飼料或飲水中添加適量抗菌葯。

（4）注射與刺種。這兩種方法均能使抗原完整迅速地到達淋巴結等免疫器官，所以適用於大多數疫苗的免疫，如果能保證劑量准確，則效果很好。其不足之處是費工費時，對雞群應激較大，操作時禁止使用未消毒的器具，尤其吸取疫苗的針頭與注射針頭要絕對分開。疫苗應隨用隨稀釋。有些場在接種上千甚至幾萬只雞前，一次將幾十瓶或上百瓶疫苗稀釋完，置於常溫下不斷使用，這樣越後用的疫苗效價越低，尤其是在稀釋液質量不好或環境溫度偏高的情況下，效果更差。另外，要經常核對注射器的實際注射量，以及刺種器內是否蘸滿疫苗也非常重要。

刺種適用於雞新城疫Ⅰ系疫苗、雞痘疫苗的接種。可用刺種針、蘸水筆或用大號縫衣針將針鼻磨去一半，蘸取稀釋好的疫苗，刺種在雞翅無血管處的皮下。每1000羽的疫苗可用25毫升生理鹽水稀釋，充分搖勻後進行刺種。

注射時用注射器將疫（菌）苗注射到肌肉或皮下。肌肉注射的部位可在肌肉豐滿處，如胸部肌肉或腿部肌肉。對小雞採用肌肉注射時，要特別注意，以免刺入太深，刺到肝臟或心臟，造成死亡。皮下注射的部位選擇雞的頸中部皮下，由上向下注射。它適用於各種油乳劑滅活苗的免疫。

❾ 弱毒疫苗的製作工藝

該苗製作的關鍵是弱毒株的獲得。 目前常用的致弱方法有：①從自然界中篩選弱毒株；②通過異種動物或細胞傳代致弱；③採用物理和化學方法致弱；④利用基因工程技術對病原進行重組。 1．病原可在免疫動物體內繁殖，用量小。
2．免疫原性好，免疫期長，成本低，使用方便。 1．目前弱毒疫苗的安全性較好，生產技術比較成熟。
2．但是某些弱毒株的毒力易返強，對一些極易感動物存在一定的危險性。
3．其免疫效果易受多種因素的影響，且運輸和保存有一定的條件限制

❿ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預防．疫苗的主要成分是該病

（1）口蹄疫病毒的遺傳物質為RNA，可以以RNA為模板逆轉錄獲得VPI基因．
（2）用限制酶A、B切割出的末端完全不同，這樣可以防止目的基因、運載體自身環化，也能防止目的基因和運載體反向連接，即可以保證目的基因和質粒的定向連接．
（3）已知質粒pZHZ1的長度為3.7kb，其中EF區域長度為0.2kb，所以切去EF段後的質粒長度為3.7-0.2=3.5kb．現用限制酶G切割重組質粒pZHZ2樣品，結果被酶G切割成1.6kb和3.1kb兩個片段，可知重組質粒pZHZ2的總長度為1.6+3.1=4.7kb，所以VPI基因長度為4.7-3.5=1.2kb．重組質粒中G的切割位點距E的切割位點0.8kb，單獨用限制酶G切割後產生1.6kb和3.1kb兩個片段，說明在重組質粒中除了圖中標示出來的G酶識別位點外，還有一個G酶識別位點；H酶的酶切位點距F0.5kb，用H單獨酶切後產生1.2kb和3.5kb兩個片段，說明在重組質粒中含有一個H的酶切位點，根據題中信息提示「目的基因內部的酶G、酶H切割位點標注在圖上」，可確定在EF之間分別含有G和H的一個識別位點．可斷定G的識別位點，在距離E點右側0.8kb處，H的識別位點在距F左側0.7kb處，如下圖所示：

（4）生長素和細胞分裂素卡那黴素
（5）口蹄疫病毒抗體