熒光免疫組化常用方法

⑴ 免疫組化的分類

免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。
這些常用免疫組織化學方法的原理如下：
1. 免疫熒光細胞化學技術
將已知抗體標上熒光素,以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射後會發出一定波長的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.
2. 免疫酶細胞化學技術
是目前免疫組織化學研究中最常用的技術．基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然後加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞或組織內的相應抗原進行定位或定性研究．
3. 免疫膠體金技術
就是用膠體金標記一抗，二抗或其他的能特異性的結合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針對組織或細胞內的抗原進行定性，定位或定量研究．由於膠體金的電子密度高，多用於免疫電鏡的單標記或多標記的定位研究．

⑵ 什麼是免疫組化檢查

免疫組化檢查指應用免疫學抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色，確定組織或細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及相對的定量檢查。

免疫組織化學利用抗體和抗原具有高度特異性結合的原理：

先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物後獲得特異性抗體，再以此抗體探測組織或細胞中的同類抗原。由於抗原與抗體的復合物是無色的，因此必須藉助組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯現，以達到對未知抗原進行定性、定位或定量。

(2)熒光免疫組化常用方法擴展閱讀

意義：

近年來，隨著免疫組織化學技術的發展和各種特異性抗體的出現，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實用價值受到了普遍的認可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時，准確率可達50%-75%。

免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面：

1、惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷。

2、確定轉移性惡性腫瘤的原發部位。

3、對某類腫瘤進行進一步的病理分型。

4、軟組織腫瘤的治療一般需根據正確的組織學分類，因其種類多、組織形態相像，有時難以區分其組織來源，應用多種標志進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的。

5、發現微小轉移灶，有助於臨床治療方案的確定，包括手術范圍的確定。

6、為臨床提供治療方案的選擇。

⑶ 常用免疫組織化學染色方法有哪些

常用免疫組織化學染色方法， LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脫蠟至水。 2.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鍾。 3.水洗。 4.抗原修復。 5.PBS洗3次，1分鍾/次。 6.加入血清孵育10分鍾。 7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分鍾。 8.PBS洗3次，每次2分鍾。加入二抗，孵育20分鍾。 9.PBS洗3次，每次2分鍾。 10.加入SP復合物孵育20-30分鍾。 11.PBS洗3次，每次2分鍾。 12.DAB-H2O2孵育5-10分鍾。 13.PBS洗，水洗。 14.Harris蘇木素染核5-10分鍾。 15.水洗，分化 ，藍化，脫水，透明並封固。生物幫上面有的，去看看吧， http://www.bio1000.com/zt/disease/ 疾病機理,疾病研究。

⑷ 免疫組化結果有幾種分析方法

有陽性細胞區域直接測試方法。

免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。
免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。
這些常用免疫組織化學方法的原理如下：
1. 免疫熒光細胞化學技術
將已知抗體標上熒光素,以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原,在熒光顯微鏡下觀察.當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射後會發出一定波長的熒光,從而可以確定組織中的抗原定位或定量.
2. 免疫酶細胞化學技術
是目前免疫組織化學研究中最常用的技術．基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然後加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞或組織內的相應抗原進行定位或定性研究．
3. 免疫膠體金技術
就是用膠體金標記一抗，二抗或其他的能特異性的結合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針對組織或細胞內的抗原進行定性，定位或定量研究．由於膠體金的電子密度高，多用於免疫電鏡的單標記或多標記的定位研究．

⑸ 什麼叫熒光免疫組化技術

用熒游標記的二抗 做免疫組化，通過熒光顯微鏡觀察實驗結果。就是熒光免疫組化。

⑹ 免疫組化P40(+)TTF-1(-)NapsiNA(-)Ki-67(約70%)是什麼意思)

是肺鱗癌。

P40(+)【抑癌基因】肺鱗癌時陽性。

TTF-1(-)【甲狀腺轉錄因子-1】肺腺癌時陽性。

NapsiNA(-)肺腺癌時陽性。

Ki-67(約70%)【細胞增值的一種標記】70%提示惡性程度高。

免疫組化應用免疫學基本原理--抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理。通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對其進行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學技術或免疫細胞化學技術。

(6)熒光免疫組化常用方法擴展閱讀：

免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備。多克隆抗體是將純化後的抗原直接免疫動物後，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。

根據標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，後者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利於微量抗原（抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。

⑺ 做免疫組化前注意什麼

做免疫組化前需要注意的方面：

1、抗原有無丟失主要看組織切片的新鮮程度，一般切片室溫保存超過3-6個月，可能切片內的抗原丟失很嚴重，此時可以通過重新用石蠟塊切片來進一步驗證（蠟塊需要低溫保存）。

2、石蠟切片在製作過程中可能因醛基對抗原決定族的封閉，這需要通過抗原修復來充分暴露，從而增加抗原抗體結合反應，提高陽性率，一般用6min*4次中火微波抗原修復，用枸櫞酸鈉緩沖液。

3、注意檢查抗體有無選擇錯誤和抗體孵育條件是否不適。

4、抗選擇單克隆抗體易出現陰性結果，因為靈敏度低但特異性好；一抗的speciesreactivity中無檢測組織的種屬，這是比較常見的錯誤；一抗選擇rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出現陰性結果。

5、抗體孵育時間過短，容易導致陰性結果。一般一抗我建議4℃孵育過夜和37℃復溫45min；二抗我一般37℃30min。我不喜歡參照二抗染色試劑盒說明書。

6、抗體濃度過低。這是陰性結果的最可能原因。必須提高稀釋度，我一般初次做一種新抗體，喜歡先用說明書建議的低濃度和高濃度做一次，然後決定是向高還是低方向摸索。

一般先決定二抗的濃度（工作液就好辦了，直接滴加），重點摸索一抗的最適濃度。注意：免疫反應中存在前帶和後帶效應，這提示不是濃度越高，陽性率就越高，反之亦然。

7、血清封閉時間也可相應縮短。一般10-30min，但這個時間可以調整，封閉主要是降低切片的總體背景著色。

8、細胞通透也不可忽視。許多戰友認為石蠟切片一般不需細胞通透，因為切片時可能已經把細胞切開了，但對於胞核蛋白，建議還是通透一下，促進抗體等試劑充分進入參與反應。

(7)熒光免疫組化常用方法擴展閱讀：

一、免疫組化的分類：

1、免疫熒光細胞化學技術：將已知抗體標上熒光素,以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射後會發出一定波長的熒光，從而可以確定組織中的抗原定位或定量。

2、免疫酶細胞化學技術：是目前免疫組織化學研究中最常用的技術，基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然後加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞或組織內的相應抗原進行定位或定性研究。

3、免疫膠體金技術：就是用膠體金標記一抗，二抗或其他的能特異性的結合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針對組織或細胞內的抗原進行定性，定位或定量研究。由於膠體金的電子密度高，多用於免疫電鏡的單標記或多標記的定位研究。

二、免疫組化的原理：

抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物後獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。

由於抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須藉助於組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。

⑻ 求免疫組化冰凍切片熒光染色具體流程

wifgw
石蠟切片免疫組化染色步驟

石蠟切片免疫組化染色步驟
1、載玻片的處理： 抗原修復過程中，由於高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鍾，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾乾即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，並盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。
1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鍾，然後用雙蒸水快速清洗三次，室溫乾燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、乾燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鍾，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜乾燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃製品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鍾，主要用於細胞內抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鍾，主要用於細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。
g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鍾。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10 3、抗原熱修復： 可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配製，取該粉劑一包溶於1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，3％H2O2處理10分鍾，蒸餾水洗2分鍾×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間並持續10~15分鍾（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鍾（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置於金屬架上，放入鍋內，使切片位於液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鍾後），計時1~2分鍾，然後將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫後，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗後，PBS洗2分鍾×3，下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，並將此容器置於盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鍾，然後端離電爐，室溫冷卻20~30分鍾，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。 4、免疫組化染色步驟： （以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鍾，(如需採用抗原修復，可在此步後進行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鍾。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
顯色劑顯色（DAB或AEC）。
自來水充分沖洗，復染，封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
m，室溫放置30分鍾後，入4℃丙酮固定10分鍾，PBS洗，5分鍾×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鍾×2。冰凍切片4~8

免疫組化非特異性染色的消除方法
一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：
（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。
（4）從組織中難於提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附於正常組織上而呈現非特異性染色。
（6）熒光素不純，標本固定不當等。 二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因採取適當的方法，常用的方法有以下幾種：
（一）動物臟器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次後，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收後之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前後之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織乾粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織乾粉或勻漿沉澱物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min
10min離心沉澱，用其沉澱物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收後放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的製法】
（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組織的脂肪。
（2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然後再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉澱15 min後，再除去上清液。
（4）最後用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉澱，將沉澱物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤乾（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過後，分裝，密封，低溫乾燥保存。
2006-12-22 13:24 wifgw
二）透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（懸於大於標記物體積約50～100倍的PBS內），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然後再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量後，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留於上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、後三部分收集，測F/P比值，合格者合並，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉澱反應），繼續洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素後，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時即出現NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時，即進行收集，之後出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉澱）。最後是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉澱），待洗脫液無SO4++及NH4+後可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
（四）DEAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以乾重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜
。常用梯度洗脫法如下：
（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱後，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然後依下列各種離子強度洗脫液，
分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合並，濃縮保存備用。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
（2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續增加NaCl的濃度至
2.0mol/L洗脫完。
經過DEAE-纖維素層析後的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
（五）熒光抗體稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
（六）純化抗原法
用各種方法提純單一成分的抗原是產生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關專著。
（七）純化抗體法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應，為此需要吸收，常採用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現混濁，逐現大塊膠塊，放置30min後，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液反復洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉澱，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/L pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規應用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存於4℃，用前再稀釋至0.01%用以
和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。

⑼ 七色多重熒光免疫組化染色試劑盒（抗兔二抗）

| 概述 | |
| 描述 |

組織微環境中有復雜的細胞組成，這些細胞的表型、狀態、豐度、分布都有著重要的生物學意義和臨床價值。藉助抗體染色可以將其在組織原位上呈現出來。免疫組化染色是一種研究組織形態和原位蛋白表達的常見技術，常規IHC檢測只能展示單一指標，難以呈現復雜的組織微環境中的細胞組成、狀態和關系，而這些信息對疾病的診斷和治療至關重要！
酪氨信號放大技術原理：類似常規免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術同樣採用HRP標記的二抗，HRP催化加入體系的熒光素底物，生產活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨酸共價結合，使樣品上穩定的共價結合熒光素。之後用熱修復法洗去非共價結合的抗體，在換下一種一抗來第二輪孵育，換另一種熒光素底物，如此往復就可實現多重標記。

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| 檢驗原理 |

多重熒光免疫組化染色是基於抗原、抗體特異性結合的原理，選用辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗抗體，對試劑盒中的熒光染料進行活化，將信號共價結合到抗原上。藉助於不同的熒光染料標記，通過多輪染色循環實現組織或細胞的原位多靶點染色。

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| 產品組成 |

TSA單色熒光染料520、TSA單色熒光染料540、TSA單色熒光染料570、TSA單色熒光染料620、TSA單色熒光染料650、TSA單色熒光染料700、信號放大反應液、抗兔HRP標記二抗、抗熒光淬滅封片劑、DAPI.

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| 應用 |

主要用於人源或小鼠組織、石蠟切片、TMA晶元的免疫組化染色。

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| 使用方法 |

1. 熒光染料的稀釋：若染料為乾粉，使用100ulDMSO溶解，製成100X染料母液；若染料為液態表示出廠即為DMSO溶解的100X母液；使用信號放大反應液按1:100稀釋制備染料工作液（現用現配）；DAPI使用無菌水按1:100稀釋制備工作液。 2. 二抗的使用：試劑盒為抗兔二抗，適用小鼠組織，實驗前請核實一抗種屬是否匹配。人源樣本請參考（# abs50015 ）。

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| 性能 | |
| 儲存/保存方法 |

熒光染料需避光保存，2～8℃儲存，收到貨起有效期為12個月。

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| 注意事項 |

1. 本試劑盒只用於免疫組化，不做其他用途。
2. 本試劑盒僅限於專業人員使用。
3. 應採用適當的防護措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。
4. 超過有效期的試劑活性可能降低，因此不得使用超過有效期的試劑。
5. 若將本試劑盒的染色組分與其他公司的產品混合使用，在染色過程中可能出現異常情況。
6. 脫蠟不徹底，容易影響染色效果。
7. 為了防止可能出現的假陰性、假陽性結果，實驗過程中需有陽性對照及陰性對照同時進行。
8. 使用本試劑盒中所產生的各種廢棄物都應按照《醫療廢物管理條例》進行處理。

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| 參考文獻 | |
| 參考文獻 |

1.Dabbs David J. 診斷免疫組織化學(M). 北京：北京大學醫學出版社，2008.9.
2.【美】Ed Harlow, David Lane. 抗體技術指南(M). 北京：科學出版社，2002:79-80,105.
3.Stack, E. C., et al., Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods, 2014 70 (1): 46-58.
4.錢幫國. 焦磊. 多標記免疫熒光染色及多普成像技術在組織學研究中的應用. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2017 (4): 373-382.

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⑽ 免疫熒光的方法有什麼注意環節

• 1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。

• 2、組織切片固定：切好片風干後立即用冰丙酮等固定液進行固定5-10min，尤其要較長時間保存的白片，一定要及時固定和適當保存。

• 3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。

• 4、一抗孵育條件：在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4℃、室溫、37℃，其中4℃效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般37℃1-2h，而4℃過宿和從冰箱拿出後37℃復溫45min。具體條件還要摸索。

• 5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37℃立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。最後，熒光素標記的二抗隨著保存時間的延長，可能後有大量的游離熒光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。

• 6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用DAPI復染。

• 7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。

• 8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育後的清洗均為5次*5min。注意：單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。PBS的pH和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議pH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（pH7-8）有利於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子強度則有利於分解）

• 9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射3~5min後，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鍾後；標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。