常用的目的克隆篩選的方法

A. 如何進行目的基因片段分離，克隆和分析

分離目的基因
生物晶元是高密度固定在固相支持介質上的生物信息分子的微列陣。列陣中每個分子的序列及位置都是已知的，並按預先設定好的順序點陣。基因晶元是生物晶元的一種，其上固定的是核算類物質，主要用於DNA、RNA分析。分為DNA晶元和微點陣兩種。
分離目的基因是是指從基因組中發現或找出某個目的（標）基因。目前是通過①比較不同物種之間，或同一物種不同個體之間；或同一個體在不同生長發育是期或不同環境條件下基因差異表達（基因表達平行分析）來實現的。採用基因晶元技術進行基因差異表達研究可以通過雜交直接檢測到細胞中mRNA的種類及豐度，與傳統的差異顯示相比具有樣品用量小，自動化程度高，被檢測目標DNA密度大及並行種類多等優點。②利用同源探針從cDNA或EST微列陣中篩選分離目的基因。目前有DNA 晶元、cDNA晶元兩種。其基本步驟包括：基因晶元的制備、靶樣品制備、雜交與檢測、目的基因得分離並獲得全長。
2 基因文庫技術分離目的基因
基因文庫指某一生物類型全部基因的集合。這種集合是以重組體的形式出現。某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組後轉化宿主細胞，轉化細胞在選擇培養基上生長出的單個菌落（或噬菌斑，或成活細胞）即為一個DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。其類型很多，如可分為基因組文庫與cDNA文庫、克隆文庫與表達文庫，按載體分有智力文庫、噬菌體文庫、黏粒載體文庫、人工染色體文庫等。基因文庫構建後，從文庫中篩選基因的方法主要有以下幾種：核算雜交法、免疫學檢測法、DNA同胞選擇法、PCR篩選法等。基因文庫的構建是目前基因工程的核心工作，也是分離目的進的常用方法之一。
3 功能蛋白組分離目的基因
蛋白組是指細胞內全部蛋白的存在及活動方式，即基因組表達產生的總蛋白質的統稱。功能蛋白質組指那些可能涉及到特定功能機理的蛋白質群體。主要研究方法為蛋白質雙向電泳。通過高效液相色譜、質普對蛋白質序列進行分析，在借用分子生物學的手段則可以進行目的基因的分離。如：應用PCR進行分離目的基因：通過對蛋白質的序列分析，可以通過密碼子的簡並性設計簡並引物，可利用RT-PCR 得到目的基因的全長；應用核算雜交篩選法分離目的基因：即利用簡並寡核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫；免疫雪篩選法分離目的基因：是通過蛋白的特異抗體與目的蛋白的專一結合，從表達文庫中分離目的基因的蛋白基因。
4 PCR技術在基因克隆中的應用
PCR技術已經滲透到生物學的各個領域，在分子克隆和獲得cDNA全長方面起著重要的作用。利用 PCR技術對特定條件下基因的表達進行檢測即通過mRNA差別顯示（DDRT-PCR）可鑒定和分離出所需的目的基因；通過RT-PCR克隆到目的基因的 cDNA區域進行cDNA文庫的構建，通過錨定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因調控區等。現在可用於基因分離和克隆的 PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用於cDNA末端快速克隆的RACE（第3小節），用於DNA序列克隆的Panhankle- PCR、Cassette-PCR以及減法cDNA文庫的PCR法構建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR為基因組已知DNA相臨未知序列的克隆奠定了良好的基礎。
5 mRNA差別顯示技術分離差別表達基因
mRNA差異顯示技術是對組織特異性表達基因進行分離的一種快速行之有效的方法之一。它是將mRNA反轉錄與PCR技術結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術。它利用5』錨定引物oligo（dT）12MN和3』端隨機引物對總mRNA進行PCR擴增，以期得到差異表達的條帶。並對其差異顯示的條帶進行回收、克隆。
6 插入突變分離克隆目的基因
獲得突變體進行未知基因的克隆是常用的方法之一。這里舉T-DNA標簽法和轉座子誘變分離克隆目的基因的例子。T-DNA標簽法是將T-DNA在任何感興趣的基因處產生插入性突變，獲得分析該基因功能的對照突變體。它將T-DNA左右邊界之間攜帶的外源報告基因片段作為一個選擇性的遺傳標記，因為插入的序列是已知的，因而對獲得的轉基因重組突變體就可以通過各種克隆和PCR策略加以研究。倘若將35S強啟動子在T-DNA整合到宿主基因組後，整合到內原基因的上游，則可以產生異常增加或表達的時空特異性改變而破壞基因的表達的效果。有獲得性突變和功能喪失性突變等。轉座子標簽法是將一株攜帶有功能性轉座系統的植物與遺傳上有差異的同種植物雜交，因轉座因子插入到某一特定的基因序列而破壞了該基因編碼的蛋白，進而導致可見的表性的破壞或改變，這樣就可以在產生後代中篩選出新型的突變體。

B. 已知一個物種的基因組,怎麼克隆目的基因

這個呢一般的做法就是首先構建基因文庫或者cDNA文庫， 基因文庫和cDNA文庫建立起來後，下一步的工作是從一個龐大的基因庫中分離出所需要的重組體克隆，這是一件難度很大，費時費力的工作。一種方法是根據重組體某種特徵從庫中直接挑選出重組體，這種方法叫做「選擇」；另一種方法是把庫中所有的重組體進行一遍篩查，這種方法叫做「篩選」。

1.原位雜交法：這一種利用特異探針的直接選擇法，是一種十分靈敏而且快速的方法，用於雜交的探針可以是雙鏈DNA，也可以是單鏈DNA，或是RNA。雜交的檢測常用放射性同位素標記探針，通過自顯影來進行。顯然，有效進行雜交篩選的關鍵是獲得特異的探針。探針的獲得有如下方法：
①如果目的基因序列是已知的，或部分序列是已知的，探針可以從已有的克隆中制備，或用PCR方法擴增。
②如果目的基因是未知的，而有其他物種的同源序列，那麼可以用同源序列做探針。
③如果目的基因未知，
但知道它對應的蛋白質序列，
可根據蛋白質序列設計相應的核酸探針。

2．扣除雜交法：這是一種篩選方法，難度很大，是面對目的基因未知，同源基因未知，蛋白質序列未知的情況的。基本原理是找到該基因的高表達細胞，提取相應的mRNA，並與一般細胞提取的mRNA進行比較，分離一般細胞不存在而高表達細胞存在的mRNA，然後用該mRNA逆轉錄生成cDNA。

另外，若目的基因已知的話，簡單的PCR擴增就行了。

C. 篩選檢測基因克隆的常見方法有哪些

這是一套通用方法，簡單方便。利用目的基因篩選就要考慮各種情況，很麻煩：能否順利表達（克隆載體不表達，原核真核，修飾定位、輔因子等等）；是否便於篩選（抗生素篩選很方便，如果目的基因是酶、轉錄因子或結構蛋白，怎麼篩選？）；不能通用（每研究一種蛋白，就要換一種載體/宿主/篩選方法）...

D. 利用基因工程技術進行葯物的研製與開發時，目的基因的鑒定方法有哪些其原理是什麼

目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導入細胞的效率都不是百分之百的，因而最後生長繁殖出來的細胞並不同都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細胞只接受一個重組DNA分子。最後培養出來的細胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant）。將目的重組體篩選出來就等於獲得了目的序列的克隆，所以篩選(dcreening)是基因克隆的重要步驟。在構建載體，選擇宿主細胞、設計分子克隆方案時都必須仔細考慮篩選的問題。以下就常用技術的基本原理加以介紹。
一、根據重組載體的標志作篩選
最常見的載體攜帶的標志是抗葯性標志，如抗氨芐青黴素（anpr）、抗四環素(terr)、抗卡那黴素(kanr)等。當培養基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗葯性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗葯性基因中間使這抗葯性基因失活，這個抗葯性標志就會消失。例如質粒pBR322含有anpr、和terr兩個抗葯基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉化大腸桿菌，讓細菌放在含氨芐青黴素或四環素培養基中，凡未接受質粒DNA的細胞都不能生長；凡在含氨芐青黴素和四環素中都能生長的細菌是含有質粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青黴素中能生長、而在四環素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質粒。 載體含有lacZ』的藍白篩選法，近年更被廣泛應用。例如將目的序列插入前面述及的質粒pUC19的多克隆位點，轉化大腸桿菌，放入含氨芐青黴素、IPTG、X-gal的培養基中培養，凡能生長並呈白色的菌落，其細菌中就很可能含有插入目的序列的重組質粒，這樣就很容易獲得目的序列的克隆。 根據重組載體的標志來篩選，可以篩選去大量的非目的重組體，但還只是粗篩，例如細菌可能發生變異而引起抗葯性的改變，卻並不代表目的序列的插入，所以需要做進一步細致的篩選。
二、核酸雜交法
利用標記的核酸做探針與轉化細胞的DNA進行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉化後生長的菌落復印到硝酸纖維膜上，用鹼裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標記，結合了放射性核酸探針的菌落集團可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質標記，通常是經顏色呈現指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。
三、PCR法
PCR技術的出現給克隆的篩選增加了一個新手段。如果已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設計合成一對引物，以轉化細胞所得的DNA為模板進行擴增，若能得到預期長度的PCR產物，則該轉化細胞就可能含有目的的序列。
四、免疫學方
利用特定抗體與目的基因表達產物特異性結合的作用進行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達產物的反應指示含有目的基因的轉化細胞，因而要求實驗設計要使目的基因進入受體細胞後能夠表達出其編碼產物。抗體可用特定的酶常用過氧化物酶、鹼性磷酸酶等標記，結合酶標抗體處，酶可催化特定的底物分解而呈現顏色，從而指示出含有目的的基因的細胞集落位置。免疫學方法特異性強、靈敏度高，適用於從大量轉化細胞集合體中篩選很少幾個含目的基因的細胞克隆。
五、DNA限制性內切酶圖譜分析
這是在上述篩選後的進一步分析。目的序列插入載體會使載體DNA限制性酶圖譜（restriction map）發生變化，例如一個長600bp的目的序列利用它兩端的EooR I和SalI切後的粘末端連接插入pUC19的多克隆點，則重組質粒就增大為3.3kb，用Eoor I和SalI雙酶切後會出現600bp和-2.7kb兩個DNA片段，提取轉化細菌的質粒DNA作酶切後做電泳觀察其酶切圖譜，就能分析得結果；如插入的目的序列中有其它限制性內切酶位點，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。這就可以進一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列測定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列測定來最後鑒定。已知序列的核酸克隆要經序列測定確證所獲得的克隆準確無誤；未知序列的核酸克隆要測定序列才能確知其結構、推測其功能，用進一步的研究。因此核酸序列測定是分子克隆中必不可少的鑒定步驟。核酸序列測定的原理和方法在實驗教材中有詳細的敘述。

E. 基因克隆有哪些步驟，如何篩選陽性克隆

簡單的說一下：
1.
擴增目的基因，比如通過PCR的方法。
2.
PCR擴增的序列可以通過酶切或者TOPO
TA的方法插入到載體質粒。
3.
轉染大腸桿菌
4.
篩選陽性克隆一般常採用藍白克隆方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是一個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的克隆就是白色的。
5.
挑取陽性克隆，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。

F. 定位克隆的篩選方法

也即Northern雜交分析法。用候選區域基因組DNA作為探針與總RNA雜交，切下陽性條帶，反轉錄為cDNA並克隆，即可獲得位於此基因組片段中的轉錄子。
上述方法都各有其優缺點，必須根據原材料及要達到的目的，選擇適當的一種或多種方法組合來達到研究目的。此外，其它方法還很多，如微切割和微克隆法、減法cDNA雜交法、重組篩選法等。 依賴特徵序列的方法是依據轉錄子內部及其兩側的序列特徵直接從基因組DNA中分離cDNA片段，主要有CpG島搜尋法、外顯子捕獲法(exontrapping)、交叉物種序列同源性比較法(cross-speciessequencehomology)、AluPCR法與直接序列分析法等。CpG島也稱為HTF島，是一些富含GC的小區域。大部分轉錄子的附近(通常是在5′上游區域)都含有非甲基化的CpG島。利用一些識別CpG島的稀有酶，如SacⅡ、BssHⅡ、EagⅠ等，切割基因組DNA，獲得位於CpG島附近的序列作為探針從總RNA或cDNA文庫中得到轉錄子。外顯子捕獲法是基於對外顯子兩側的功能性5′和3′剪接位點的識別，從基因組DNA中分離外顯子片段。交叉物種序列同源性比較的依據是編碼區序列在不同物種間的保守性要遠高於非編碼區，把候選區域的DNA分為多個亞克隆，分別與不同的物種總DNA雜交，與不同物種DNA都有陽性信號的DNA克隆可能就是編碼區基因。這種方法依賴的是物種間DNA水平上的序列同源性。Alu序列是散布於人基因組中的短的重復序列，通過設計人特異的Alu序列作為引物，可直接快速用PCR方法從YAC、BAC、PAC克隆或人鼠雜合細胞中得到人源的特異序列。直接序列分析法則在基因組序列信息中用GRAIL和GeneScan等軟體分析推測編碼基因的方法。

G. 基因克隆的方法有哪些

簡單的說一下：
擴增目的基因，比如通過PCR的方法。
PCR擴增的序列可以通過酶切或者TOPO TA的方法插入到載體質粒。
轉染大腸桿菌
篩選陽性克隆一般常採用藍白克隆方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是一個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的克隆就是白色的。
挑取陽性克隆，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。

H. 怎樣克隆一個目的基因

目的基因的克隆是利用一個單一的基因副本的行為。有pcr方法，凝膠電泳方法，色譜法，瓊脂糖凝膠電泳法，質粒法等。具體方法可分別檢索文獻。

常用的植物目的基因克隆技術
1、通過已知基因產物的分析和鑒定
這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產物，並對蛋白質氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質的基因序列，然後通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當其他植物的同類基因已分離到並且核苷酸序列保守性較高時，也可直接用這些已知的基因片段作探針對未克隆到該基因的植物基因文庫進行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過遺傳表型分析
（1）基因標鑒法。該法是利用轉座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產生一些突變體，然後用相應轉座子或T-DNA對突變體文庫進行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功能的轉位因子系統的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交後代中篩選由於轉位因子插入到某一特定基因序列中導致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構建基因文庫，然後將轉位因子用同位素標記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉位因子的目的基因。該法主要限於二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應用該法已分離出與玉米種子發育有關的Viviparious-1基因及與金魚草花發育有關的一些基因等。
（2）激發子的寄主受體基因克隆技術。該技術是利用病菌無毒基因（avrgene）編氳募し⒆佑爰鬧骺共』�蟣嗦氳氖芴逯�浯嬖誆磺綴偷幕プ鞴叵擔�圓≡�し⒆擁鞍孜�咚鞣擲牒塗寺〕鮃恍┘付≈士共』�潁�綬�延胛薅凈�騛vr9對應的抗病基因cf9，與avrPto對應的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對應的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎的定位克隆技術
以圖譜為基礎的定位克隆技術在分離未知產物的基因方面有廣闊的應用前景。該法的基本前提是基因定位，然後以緊密連鎖的分子標記如RFLP等為起點，通過染色體步移逐步向目標基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標基因定位在高密度的分子標記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標記的遺傳圖譜距轉換成物理距離；（3）構建YAC文庫，找到含連鎖標記的YAC克隆，並通過克隆的排序獲得目標基因的DNA片段；（4）通過轉化和功能互補試驗證實基因所在的DNA片段。如用該技術已分離出番茄抗根結線蟲mi基因和擬南芥菜抗細菌性莖腐病的RPM1基因等。

I. 如何從基因文庫中篩選目標克隆

你的cDNA文庫不是保存在宿主里嗎？以前的方法是做大量的平板，然後用原位雜交的方法去篩選陽性的克隆，多篩幾次就好了，但做平板其實很累的。
現在的方法可以用RACE釣取全長的cDNA。關於RACE，你可以咨詢試劑公司，有現成的試劑盒和方法可用。