體外抑菌試驗常用方法有哪兩類

A. 抑菌試驗的介紹

用於測定抗菌葯物體外抑制細菌生長效力的試驗稱為抑菌試驗。通過抑菌實驗，可以測定一個葯物的最低抑菌濃度，用以評價該葯物的抑菌性能，這是抗菌葯物的最基本的葯效學數據。主要方法有進行定性測定的擴散法（如抑菌斑試驗）和進行定量測定的稀釋法（如最低抑菌濃度實驗）。

B. 葯物體外抗菌試驗(k-b法)的培養其為

敏試驗的結果受到諸多因素的影響，如培養基、試紙片以及菌液的濃度等。
1、培養基
細菌敏試驗所用的培養基種類較多，多數情況下，採用WHO組織統一要求的M-H培養基，這種培養基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類物競爭的物質，因此進行的敏試驗效果較好。此外，還有適量的Ca2+、Mg2+，在培養基中起到觸媒的作用。但是，有些細菌對培養基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培養基才能進行敏試驗。例如，流感嗜血桿菌的敏試驗培養基用HTM瓊脂；淋球菌的敏試驗培養基用加5％羊血的巧克力M-H瓊脂；肺炎鏈球菌的敏實驗用M-H瓊脂加5％的脫纖維羊血培養基。培養基中還有適量的Ca2+、Mg2+，在培養基中起到溶酶的作用，其含量的變化，可影響氨基糖苷類和四環素對銅綠假單胞菌的試驗結果，含量過高，抑菌圈會變小，含量過低，抑菌圈會大得不可接受。
細菌敏試驗的培養基厚度大約為4mm，若培養基厚度大於4mm，會使細菌出現耐；若小於4mm，本應耐的易出現敏感。所以，試驗時一定不要把敏紙片放在中央部位，而應均勻地排布在平皿周圍的培養基上。製作敏試驗的培養基用水，主要是Ca2+、Mg2+等礦物質離子，也在很大程度上影響著敏試驗的結果。
2、試紙片
試紙片材質的好壞，對物穩定性和活性有很大影響。加工敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的濾紙，雜質少，對物保存無太大影響。然而，臨床中很多用的是普通紙，被水浸潤後會呈鹼性，並且含有大量無機離子，因此使用普通紙加工的試紙片物有較大的影響。敏紙片的PH值一般要求為中性，這樣才適合的活度。敏紙片的厚度要求大約1mm，這樣才有利於細菌的生長和物的擴散速度。敏紙片的直徑在6.00～6.35mm之間，紙片的厚度和直徑大小都會影響敏試驗的結果。
含紙片的片間差和質量好壞是做敏試驗的關鍵。一些敏紙片買來時就有抑菌環偏大或偏小的問題，紙片之間又存在很大的片間差。因此，紙片在用前必須檢驗其片間差和准確度，只有都達到標准要求後才能使用。同時要注意紙片的保存，因為有的紙片，如青黴素類，在保存中因為受潮濕環境的影響容易降低其物的活性。因此，紙片應放低溫下(-10℃)保存，同時要避免潮濕，以保持抗菌物的活性。盛紙片小瓶自低溫處取出應在室溫平衡至少10min後再打開，避免冷凝水影響效。
3、細菌
由於各種菌對物的敏感性不同，產生的抑菌環大小不同，如果菌種不純，試驗中所產生的抑菌環大小與該菌種在純培養狀態下產生的抑菌環大小存在較大的差異，影響判斷結果的准確性。因此需要對各種致病菌提純後，分別進行不同的敏試驗。敏試驗時，需要將提純後的菌種配製成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標準是要求菌液濃度在1．5億/ml左右。若菌液濃度過高，該菌會對所有物產生耐；反之，菌液濃度過低，該菌會對所有物均敏感。最精確的方法是使用分光光度計測定新鮮培養物菌懸液的吸光度，來確定菌液濃度。國家細菌耐性監測網的三級甲等，其微生物實驗室大多數用此法來確定敏試驗的菌液濃度。
敏試驗中要將菌液均勻地塗在培養基上，使細菌均勻分布，這樣才能使試驗結果不會出現較大的偏差。塗菌後15min才能貼敏紙片。由於塗菌後，細菌要有一段時間的適應過程，但是時間不能過長，否則會使細菌產生耐。貼敏紙片時，每取一種敏紙片必須燒一下鑷子口，避免敏紙片之間相互混淆，以提高敏的准確性。物殺滅細菌存在一定的量比，敏試驗培養基上細菌層越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根據一種物抑菌圈的有無或者大小，只能判斷出該對細菌有沒有效果，但其敏感性的高低需要通過科學嚴謹的實驗來確定。物的敏感程度需要根據敏試驗的結果，並結合以上因素做綜合分析，才能得出科學的結論，而片面地根據敏圈的大小來決定敏感與否，結果不夠准確。
綜上所述，造成敏試驗的結果可能與實際效果不符，對敏試驗要具體情況進行相應的分析，再根據物的代謝過程和原理綜合論證，敏試驗的指導意義還是很大的。而且上述因素並不是在我們臨床做敏試驗過程中都能遇到，對此，我們需要認真執行標准化的試驗方法，認真執行CLSI質控要求，做好室內質控與室間質評，以提高試驗的准確性。嚴格控制敏試驗用培養基和敏紙片，做到保證質量。

C. 何謂抑菌試驗主要包括哪些實驗方法

抑菌試驗用於測定抗菌葯物體外抑制細菌生長的效力。
實驗方法主要有進行定性測定的紙片擴散法、定量測定的稀釋法和E試驗法。

D. 何謂抑菌試驗主要包括哪些實驗方法

抑菌試驗用於測定抗菌葯物體外抑制細菌生長的效力。實驗方法主要有進行定性測定的紙片擴散法、定量測定的稀釋法和E試驗法。

E. 何謂抑菌試驗主要包括哪些實驗方法

用於測定抗菌葯物體外抑制細菌生長效力的試驗稱為抑菌試驗。通過抑菌實驗，可以測定一個葯物的最低抑菌濃度，用以評價該葯物的抑菌性能，這是抗菌葯物的最基本的葯效學數據。主要方法有進行定性測定的擴散法（如抑菌斑試驗）和進行定量測定的稀釋法（如最低抑菌濃度實驗）。

F. 抑菌試驗的常用方法

A、抗菌葯物貯存液制備
1.1.1.抗菌葯物貯存液制備 抗菌葯物貯存液濃度不應低於1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍於最高測定濃度。溶解度低的抗菌葯物可稍低於上述濃度。抗菌葯物直接購自廠商或相關機構。所需抗菌葯物溶液量或粉劑量可公式進行計算。例如：需配製100 ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其葯物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6 mg。根據公式計算所需稀釋劑用量為：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然後將182.6 mg抗生素粉劑溶解於107.0ml稀釋劑中。制備抗菌葯物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5。配製好的抗菌葯物貯存液應貯存於-60℃以下環境，保存期不超過6個月。
B、葯敏試驗用抗菌葯物濃度范圍
1.1.2.葯敏試驗用抗菌葯物濃度范圍 根據NCCLS抗菌葯物敏感性試驗操作標准，葯物濃度范圍應包含耐葯、中介和敏感分界點值，特殊情況例外。
C、培養基
1.1.3. 培養基 NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養基中生長良好。在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時，應在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按製造廠家的要求配製需要量的MH肉湯。嗜血桿菌屬菌使用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯。
D、接種物的制備
1.1.4.接種物的制備 有2種方法配製接種物，一是細菌生長方法，用接種環挑取形態相似待檢菌落3-5個，接種於4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌後的對數生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標准，約含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配製法，對某些苛養菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐葯的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養18~24h的菌落調配成0.5麥氏比濁標準的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進行1∶100稀釋後備用。注意應在15分鍾內接種完配製好的接種物，並取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養，以檢查接種物純度。
註：在臨床微生物學檢驗中，麥氏比濁法常用於細菌鑒定、葯敏實驗前配置菌液時大致判斷菌液濃度的一種方法，通常認為，如將配菌液濃度配成0.5麥氏比濁管時，相當於1.5×108細菌數/ml，由於方法本身就是一種估計的方法，所以盡管不同細菌大小差異很大，除了真菌孢子，細菌的差別不大，結果不會有影響。但是，標准比濁管的濃度，是葯敏實驗結果的影響因素之一。
E、附：0.5麥氏比濁管配製方法
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。
有效期為6個月。
F、稀釋抗菌葯物的制備及菌液接種
1.1.5.稀釋抗菌葯物的制備及菌液接種 取無菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其餘每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入抗菌葯物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混勻，然後吸取1ml至第2管，混勻後再吸取1ml至第3管，如此連續倍比稀釋至第11管，並從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含葯物的生長對照。此時各管葯物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然後在每管內加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管葯物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
G、孵育
1.1.6.孵育 將接種好的稀釋管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古黴素腸球菌應持續孵育滿24h。
H、結果判斷與解釋
1.1.7.結果判斷與解釋 在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，同時還應檢查接種物的傳代培養情況以確定其是否污染，質控菌株的MIC值是否處於質控范圍。以肉眼觀察，葯物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺葯物的肉湯稀釋法終點判斷，與陽性生長對照管比較抑制80%細菌生長管葯物濃度為受試菌MIC。
根據NCCLS推薦的分界點值標准，判斷耐葯（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌葯物的常用劑量治療有效，禁忌症除外。R指該菌不能被抗菌葯物的常用劑量在組織液內或血液中所達到的濃度所抑制，或屬於具有特定耐葯機理（如β-內醯胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近葯物的血液或組織液濃度，療效低於敏感菌。還表示被測菌株可以通過提高劑量（如β-內醯胺類葯物）被抑制，或在葯物生理性濃集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介還作為「緩沖域」，以防止由微小的技術因素失控，所導致較大的錯誤解釋。 A、抗菌葯物和培養基制備
1.2.1.抗菌葯物和培養基制備 同常量肉湯稀釋法。
B、MIC板制備
1.2.2.MIC板制備 無菌操作，將倍比稀釋後不同濃度的抗菌葯物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加葯液，每孔10μl，第12孔不加葯作為生長對照，冰凍乾燥後密封，-20℃以下保存備用。
C、接種物制備
1.2.3.接種物制備 將用生長法或直接菌懸液法制備的濃度相當於0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經MH肉湯1∶1000稀釋後，向每孔中加100μl，密封後置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結果。當試驗嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時，孵育時間為20~24h，試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古黴素的葯敏試驗時孵育時間必須滿24h。此時，第1孔至第11孔葯物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
D、結果判斷
1.2.4.結果判斷 以在小孔內完全抑制細菌生長的最低葯物濃度為MIC。當陽性對照孔（即不含抗生素）內細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時，應記錄抑制細菌生長的最高葯物濃度。如出現多處跳孔，則不應報告結果，需重復試驗。通常對革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結果相同或低一個稀釋度（1孔或2倍）。 A、介紹
瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌葯物，加入融化並冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，製成含不同遞減濃度抗菌葯物的平板，接種受試菌，孵育後觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低葯物濃度為MIC。本法優點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定，結果可靠，易發現污染菌；缺點是制備含葯瓊脂平板費時費力。
B、培養基制備
2.1.培養基制備 使用MH瓊脂，按商品說明書進行配製，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當試驗磺胺葯時，使用溶解的馬血）。
C、含葯瓊脂平板制備
2.2.含葯瓊脂平板制備 根據實驗設計，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌葯物分別加入已加熱溶解，並在45~50℃水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配製葯物瓊脂平板，根據需要來選擇葯物濃度范圍。配製好的含葯瓊脂平板應裝入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可貯存5天。
D、接種物制備與接種
2.3.接種物制備與接種 制備濃度相當於0.5麥氏標准比濁管的菌懸液，再1∶10稀釋，以多點接種器吸取制備好菌液（約1~2μl）接種於瓊脂平板表面，每點菌數約為104CFU，形成直徑為5~8mm的菌斑。接種好後置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐葯葡萄球菌、萬古黴素耐葯腸球菌孵育時間應滿24h），觀察結果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧環境中孵育。
E、結果判斷
2.4.結果判斷 將平板置於暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的最低葯物濃度為MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見輕微細菌生長，與生長對照比較抑制80%以上細菌生長的最低葯物濃度作為終點濃度。
如果出現有2個以上菌落生長於含葯濃度高於終點水平的瓊脂平板上，或低濃度葯物瓊脂平板上不長而高濃度葯物瓊脂平板上生長現象，則應檢查培養物純度或重復試驗。 紙片擴散法(K-B法)又稱瓊脂擴散法
K-B法葯敏試驗時接種物配製有兩種方法。
第一種是肉湯增菌法（對數生長法），是用接環挑取3-5個細菌菌落入肉湯增菌管中進行增菌4-6小時，然後用生理鹽水或肉湯對增菌管中的培養物進行稀釋校正使其濃度達到0.5麥氏比濁標准（因為經過增菌培養其培養物濃度一般都高於此標准）。
第二種方法是直接菌落法：從孵育18-24小時的非選擇性培養基上，挑取3-5菌落，直接用肉湯或鹽製成懸液作為接種，然後將濁度調整至0.5麥氏比濁標准。此法是檢測苛養菌（如嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌）和潛在的對甲氧西林耐葯的葡萄球菌的推薦方法。
將菌製成菌懸液用無菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多餘菌液 ,塗布整個M2H平板表面 ,反復 3 次 ,每次將平板旋轉60 度 ,保證塗布均勻 ,35 ℃培養後菌落呈半融合狀態 ,否則影響葯敏結果。
K-B 法指定用 M-H瓊脂平板 ,應用直徑90cm平皿 ,在水平的無菌台上傾倒 ,准確量取高壓滅菌後的M2H瓊脂液25ml ,使之瓊脂板厚度為 4mm。否則厚度過高 ,使含葯物紙片的葯物半球形擴散的體積加大 ,導致假耐葯;反之導致假敏感。
要求紙片直徑 6.00～6.35mm每片吸水量約012 μl ,紙片的葯物含量必須與 K 2B 法規定的
一致 ,用前必須做質量鑒定 ,質量合格方可使用。紙片的保存尤為重要 ,一般要求保存在有乾燥劑的容器內低溫保存 ,紙片取出後須放室溫10min後方可打開 ,否則空氣中的水份冷凝在紙片上易潮解 ,使葯物失效影響葯敏試驗結果。 E試驗是指濃度梯度瓊脂擴散試驗，其原理基本同擴散法，即濃度呈連續梯度的抗菌葯物從塑料試條中向瓊脂中擴散，在試條周圍抑菌濃度范圍內受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點，同時還彌補了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌葯物對受試菌的MIC。
A、培養基、菌液制備和接種
3.1.培養基、菌液制備和接種 同紙片擴散法。
B、貼E試驗條
3.2.貼E試驗條 同紙片擴散法，E試驗條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂後不得再移動。直徑150mm的平皿內可放置6根E試驗試條，90mm者一般只能放置1根。
C、孵育時間和溫度
3.3.孵育時間和溫度 同紙片擴散法。
D、結果閱讀
3.4.結果閱讀 孵育後圍繞試條可形成一個橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數刻度即是測定抗菌葯物對受試菌的MIC。閱讀時應注意的問題見供應商的產品說明書。

G. 何謂抑菌試驗主要包括哪些實驗方法

抑菌試驗即用於測定抗菌葯物體外抑制細菌生長的效力的試驗。
實驗方法主要有進行定性測定的紙片擴散法、定量測定的稀釋法和E試驗法。

H. 何謂抑菌試驗主要包括哪些實驗方法

一、控制變數法

控制變數法是初中物理實驗中常用的探索問題和分析解決問題的科學方法之一。所謂控制變數法是指為了研究物理量同影響它的多個因素中的一個因素的關系，可將除了這個因素以外的其它因素人為地控制起來，使其保持不變，再比較、研究該物理量與該因素之間的關系，得出結論，然後再綜合起來得出規律的方法。

這種方法在整個初中物理實驗中的應用比較普遍。例如在人教版實驗教科書《物理》（八年級上冊）第一章第一節關於探究聲是怎樣傳播的實驗中，就開始滲透控制變數的思想。因為固體、液體和氣體都是傳聲的介質，我們逐一研究它們分別可以傳聲時，就必須控制其它兩個因素。如果在進行該實驗時就給學生恰當地點撥，提出：「把兩張課桌緊緊地挨在一起，一個同學輕敲桌面，另一個同學把耳朵貼在另一張桌子上，聽到的敲擊聲為什麼就能認為是桌子傳來而不是空氣傳來的？」引導學生去分析比較，就能使學生體驗到控制變數的思想。在接著的探究影響音調、響度等因素的實驗中，把控制變數的思想對學生給予簡要的介紹，就會使學生逐步領悟到控制變數法的實質要領，為以後的探究實驗作好方法上的准備。

在初中物理中，探究影響導體電阻大小的因素、電流跟電壓電阻的關系、影響電熱功率大小的因素、影響電磁鐵磁性強弱的因素、影響滑動摩擦力大小的因素、決定壓力作用效果的因素等等實驗，運用了控制變數法。

二、等效替代法

等效替代法是指在研究某一個物理現象和規律中，因實驗本身的特殊限制或因實驗器材等限制，不可以或很難直接揭示物理本質，而採取與之相似或有共同特徵的等效現象來替代的方法。這種方法若運用恰當，不僅能順利得出結論，而且容易被學生接受和理解。

三、轉換法

有的物理量不便於直接測量，有的物理現象不便於直接觀察，通過轉換為容易測量到與之相等或與之相關聯的物理現象，從而獲得結論的方法。譬如，在研究電熱的功率與電阻關系的實驗中，電流通過阻值不等的兩根電阻絲產生的熱量無法直接觀測和比較，而我們通過轉換為讓煤油吸熱，觀察煤油溫度變化情況，從而推導出那個電阻放熱多。教學時不妨設計一問：為什麼研究電熱的功率與電阻大小的關系時，還用到似乎與實驗無關的煤油呢？引發學生的思考和討論，在小結出該實驗中煤油的作用的基礎上，進而再問：該實驗能否不用煤油而改用其它方式來觀察電阻通電後的發熱情況？這樣促使學生思維得以發散，轉換的思維方法得到訓練，設計實驗的能力也隨著提高了。

四、類比法

類比法是一種推理方法。為了把要表達的物理問題說清楚明白，往往用具體的、有形的、人們所熟知的事物來類比要說明的那些抽象的、無形的、陌生的事物，通過藉助於一個比較熟悉的對象的某些特徵，去理解和掌握另一個有相似性的對象的某些特徵。如：在研究電壓的作用時，藉助於看得見而學生比較熟悉的「水壓形成水流」的實驗作類比，來揭示電壓是形成電流的原因。又比如在研究通電螺線管的磁場的實驗中，為准確記憶通電螺線管的北極與電流方向的關系，以緊握的右拳頭類比為螺線管，四指為線圈並指向電流的方向，則大拇指所指的一端為北極。這樣形象直觀很容易被學生理解記憶牢固。
五、圖象法

圖象是一個數學概念，用來表示一個量隨另一個量的變化關系，很直觀。由於物理學中經常要研究一個物理量隨另一個物理量的變化情況，因此圖象在物理中有著廣泛的應用。在實驗中，運用圖象來處理實驗數據，探究內在的物理規律，具有獨特之處。如：在探究固體熔化時溫度的變化規律和水的沸騰情況的實驗中，就是運用圖象法來處理數據的。它形象直觀地表示了物質溫度的變化情況，學生在親歷實驗自主得出數據的基礎上，通過描點、連線繪出圖象就能准確地把握住晶體和非晶體的熔化特點、液體的沸騰特點了。

六、理想化方法

理想化方法是指在物理教學中通過想像建立模型和進行實驗的一種科學方法。可分為理想化模型和理想化實驗。

理想化模型就是指把復雜的問題簡單化，把研究對象的一些次要因素捨去，抓住主要因素，對實際問題進行理想化處理去再現原形的本質的東西，構成理想化的物理模型。這是一種重要的物理研究方法。例如探究杠桿平衡條件的實驗，杠桿就是一種理想化的模型。杠桿在使用時，由於受到力的作用，都會引起或多或少的形變，然而在研究中把此時的形變忽略不計，這里我們就把杠桿經過理想化的處理，認為它無形變，視為一個硬棒，從而使學生在研究時不被細枝末節的因素影響，順利地得出杠桿平衡原理。