常用誘變方法

1. 誘變育種有幾種方法，

誘變育種
開放分類： 生物、自然科學、生物學、變異、遺傳

在人為的條件下,利用物理,化學等因素,誘發生物產生突變,從中選擇,培育成動植物和微生物的新品種.
誘變育種是指用物理、化學因素誘導植物的遺傳特性發生變異，再從變異群體中選擇符合人們某種要求的單株，進而培育成新的品種或種質的育種方法。它是繼選擇育種和雜交育種之後發展起來的一項現代育種技術。

誘發突變的物理因素主要指某些射線，如α射線、β射線、γ射線、X射線和中子流等；化學誘變劑主要指某些亞硝酸鹽、烷化劑，鹼基類似物，抗生素等化學葯物。 物理誘變方法應用於植物始干1928年。 L.J·斯德勒首先證實了X射線對玉米和大麥有誘變效應。1930年和1924年H.尼爾遜·愛爾和D.托倫納分別用輻射誘變技術獲得了有實用價值的大麥突變體和煙草突變體。化學誘變劑在植物上的應用一般認為始於1943年，當時F·約克斯用馬來糖(脲烷)誘發了月見草、百合和風鈴草的染色體畸變。這些早期工作為確立誘變育種的地位奠定了基礎。

通過近幾十年的研究人們對誘變原理的認識也逐步加深。 我們知道，常規助雜交育種基本上是染色體的重新組合，這種技術一般並不引起染色體發生變異，更難以觸及到基因。而輻射的作用則不同，它們有的是與細胞中的原子、分子發生沖撞、造成電離或激發；有的則是以能量形式產生光電吸收或光電效應；還有的能引起細胞內的一系列理化過程。這些都會對細胞產生不同程度的傷害。對染色體的數目、結構等都會產生影響，使有的染色體斷裂了；有的丟失了一段，有的斷裂後在「自我修復」的過程中頭尾接倒了或是「張冠李戴」分別造成染色體的倒位和易位。當然射線也可作用在染色體核苷酸分子的鹼塞上，從而使基因（遺傳密碼)發生突變。至於化學誘變，有的葯劑是用其烷基置換其它分子中的 氫原子，也有的本身是核苷酸鹼基的類似物，它可以「魚目混珠」，造成DNA復制中的錯誤。無疑這些都會使植物的基因發生突變。 理、化因索的誘導作用；使得植物細胞的突變率比平時高出千百倍，有些變異是其它手段難以得到的。當然，所產生的變異絕大多數不能遺傳，所以，輻射後的早代一般不急 於選擇。

但是，可遺傳的好性狀一經獲得便可育成品種或種質資源。 據世界原子能機構1985年統計，當時世界各國通過誘變已育成500多個品種，還有大量有價值的種質資源o 我國的 誘變育種同樣成績斐然，在過去的幾十年中，經誘變育成的 品種數一直佔到同期育成品種總數的10％左右。如水稻品種 原豐早，小麥品種山農輻63，還有玉米的魯原單4號、大豆的鐵豐18、棉花的魯棉I號等都是通過誘變育成的。 當然與其它技術一樣，誘變育種也有自身的弱點：一是誘變產生的有益突變體頻率低；二是還難以有效地控制變異 的方向和性質；另外，誘發並鑒定出數量性狀的微突變比較困難。因此，誘變育種應該與其它技術相結合，同時謀求技術上的自我完善。

2. 誘導基因突變的常用方法

誘導基因突變的常用方法：
一、鹼基置換突變
可以通過兩個途徑即鹼基結構類似物的參入和誘變劑或射線引起的化學變化來進行。
①類似物的參入5-溴尿嘧啶(BU）是胸腺嘧啶的結構類似物。它只是在第5位碳原子上以溴原子代替了胸腺嘧啶的甲基（─GH3），並且因此更易以烯醇式出現（圖2）。基因突變
大腸桿菌在含有BU的培養基中培養後，細菌的 DNA中的一部分胸腺嘧啶被BU所取代，並且最後在培養物中可以發現有少數突變型細菌出現，取代BU的量愈大則突變型愈多。突變型細菌在不含有BU的培養基中長久培養時，不改變它的突變型性狀，可是把突變型細菌在含有BU的培養基中培養後，又可以發現少數由於發生回復突變而出現的野生型細菌。BU的誘變作用可以表示。首先在DNA復制過程中酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T鹼基對變為A:BU，在下一次DNA復制中烯醇式的BU*和鳥嘌呤G配對而出現G∶BU鹼基對，最後在又一次復制中鳥嘌呤G和胞嘧啶C配對而終於出現G:C鹼基對，完成了鹼基的置換。這里BU所起的作用是促成這一置換，起促成作用的原因是由於嘧啶的 5位上溴原子代替了甲基後便較多地出現烯醇式的嘧啶。
同一理論還可以用來說明 BU是怎樣誘發 的置換突變或者突變型的回復突變（圖4)
2-氨基嘌呤等其他鹼基結構類似物同樣具有誘變作用。
②葯物或射線引起的化學變化亞硝酸能夠作用於腺嘌呤(A）的氨基而使它變為次黃嘌呤(HX）；可以作用於胞嘧啶（c）而使它變為尿嘧啶（U）。這兩種氨基到酮基的變化帶來鹼基配對關系的改變，從而通過 DNA復制而造成A∶T→G∶C或者 G∶C→A∶T置換。
羥胺只和胞嘧啶發生專一性的反應，所以它幾乎只誘發置換G∶C→A∶T而不誘發A∶T→G∶C置換。此外，pH值低或高溫都可以促使DNA分子失去鹼基特別是嘌呤，導致鹼基置換。
紫外線的照射使 DNA分子上鄰接的鹼基形成二聚體，主要是胸腺嘧啶二聚體T-T。二聚體的形成使DNA雙鏈呈現不正常的構型（見DNA損傷修復），從而帶來致死效應或者導致基因突變，其中包括多種類型的鹼基置換。

二、移碼突變
誘發移碼突變的誘變劑種類較少，主要是吖啶類染料（圖6）。這些染料分子能夠嵌入DNA分子中，從而使DNA復制發生差錯而造成移碼突變。

三、定向誘變
利用重組DNA技術使DNA分子在指定位置上發生特定的變化，從而收到定向的誘變效果。例如將DNA分子用某一種限制性核酸內切酶處理，再用分解DNA單鏈的核酸酶S1處理，以去除兩個粘性末端的單鏈部分，然後用噬菌體T4連接酶將兩個平頭末端連接起來，這樣就可得到缺失了相應於這一限制性內切酶的識別位點的幾個核苷酸的突變型。相反地，如果在四種脫氧核苷三磷酸(dNTP）存在的情況下加入 DNA多聚酶Ⅰ，那麼進行互補合成的結果就得到多了相應幾個核苷酸的兩個平頭末端。在T4接連酶的處理下，便可以在同一位置上得到幾個核苷酸發生重復的突變型。
在指定的位置上也可以定向地誘發置換突變。誘變劑亞硫酸氫鈉能夠使胞嘧啶脫氨基而成為尿嘧啶，但是這種作用只限於 DNA單鏈上的胞嘧啶而對於雙鏈上的胞嘧啶則無效。用識別位點中包含一個胞嘧啶的限制性內切酶處理DNA分子，使粘性末端中的胞嘧啶得以暴露（例如HindⅢ的識別位點是，經限制酶HindⅢ處理後得到粘性末端，中間的這一胞嘧啶便暴露了）。經亞硫酸氫鈉處理後胞嘧啶（c）變為尿嘧啶（U)。通過DNA復制原來的鹼基對C∶G便轉變成為 T∶A。這樣一個指定位置的鹼基置換突變便被誘發。
還可以把人工合成的低聚核苷酸片段引入基因組中，以一定的方式改變某一基因等。

3. 人工誘變的常用方法是

人工誘變的常用方法
1. 物理法：射線（紫外線、X光線、Y射線，中子線），激光微束，離子束，微波，超聲波，熱力等。

2. 化學誘變法：浸漬法、塗抹法、滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。
化學誘變劑：鹼基類似物、烷化劑，移碼誘變劑，硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧 啶（5－BU）、氮芥（Nm）、N'廣甲基N'亞硝基胍（NTG）。

3. 生物法：空間條件處理誘變，病原微生物誘變，轉基因誘變。

人工誘變
在人為的條件下,利用物理、化學等因素，誘發生物產生突變，從中選擇、培育動植物和微生物的新品種。誘變育種是指用物理、化學因素誘導植物的遺傳特性發生變異，再從變異群體中選擇符合人們某種要求的單株，進而培育成新的品種或種質的育種方法。它是繼選擇育種和雜交育種之後發展起來的一項現代育種技術。

我們知道，常規助雜交育種基本上是染色體的重新組合，這種技術一般並不引起染色體發生變異，更難以觸及到基因。而輻射的作用則不同，它們有的是與細胞中的原子、分子發生沖撞、造成電離或激發；有的則是以能量形式產生光電吸收或光電效應；還有的能引起細胞內的一系列理化過程。這些都會對細胞產生不同程度的傷害。對染色體的數目、結構等都會產生影響，使有的染色體斷裂了；有的丟失了一段，有的斷裂後在「自我修復」的過程中頭尾接倒了或是「張冠李戴」分別造成染色體的倒位和易位。當然射線也可作用在染色體核苷酸分子的鹼塞上，從而使基因（遺傳密碼)發生突變。至於化學誘變，有的葯劑是用其烷基置換其它分子中的氫原子，也有的本身是核苷酸鹼基的類似物，它可以「魚目混珠」，造成DNA復制中的錯誤。無疑這些都會使植物的基因發生突變。理、化因索的誘導作用；使得植物細胞的突變率比平時高出千百倍，有些變異是其它手段難以得到的。當然，所產生的變異絕大多數不能遺傳，所以，輻射後的早代一般不急於選擇。

物理誘變
應用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。當通過輻射將能量傳遞到生物體內時，生物體內各種分子便產生電離和激發，接著產生許多化學性質十分活躍的自由原子或自由基團。它們繼續相互反應，並與其周圍物質特別是大分子核酸和蛋白質反應，引起分子結構的改變。由此又影響到細胞內的一些生化過程，如 DNA合成的中止、各種酶活性的改變等，使各部分結構進一步深刻變化，其中尤其重要的是染色體損傷。由於染色體斷裂和重接而產生的染色體結構和數目的變異即染色體突變,而DNA分子結構中鹼基的變化則造成基因突變。那些帶有染色體突變或基因突變的細胞，經過細胞世代將變異了的遺傳物質傳至性細胞或無性繁殖器官，即可產生生物體的遺傳變異。

化學誘變
化學誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學效應，如引起染色體斷裂等，常用於處理遲發突變，並對某特定的基因或核酸有選擇性作用。
化學誘變劑：主要指某些烷化劑，鹼基類似物，抗生素等化學葯物。化學誘變劑在植物上的應用一般認為始於1943年，當時F·約克斯用馬來糖(脲烷)誘發了月見草、百合和風鈴草的染色體畸變。這些早期工作為確立誘變育種的地位奠定了基礎。

化學誘變劑
(一)、烷化劑
烷化劑是栽培作物誘發突變的最重要的一類誘變劑。葯劑帶有一個或多個活潑的烷基。通過烷基置換，取代其它分子的氫原子稱為"烷化作用"所以這類物質稱烷化劑。
烷化劑分為以下幾類：
1. 烷基磺酸鹽和烷基硫酸鹽
代表葯劑：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）
2. 亞硝基烷基化合物
代表葯劑：亞硝基乙基脲（NEH）、N-亞硝基-N-乙基脲烷（NEU）
3. 次乙胺和環氧乙烷類
代表葯劑：乙烯亞胺（EI）
4. 芥子氣類
氮芥類、硫芥類
烷化劑的作用機制--烷化作用重點是核酸，導致DNA斷裂、缺失或修補。

(二)、核酸鹼基類似物
這類化合物具有與DNA鹼基類似的結構。
代表葯劑：
5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 為胸腺嘧啶（T）的類似物
2-氨基嘌呤（AP） 為腺嘌呤（A）的類似物
馬來醯肼（MH） 為尿嘧啶（U）的異構體
作用機制：作為DNA的成份而滲入到DNA分子中去，使DNA復制時發生配對錯誤，從而引起有機體變異。
(三)、其它誘變劑
亞硝酸 能使嘌呤或嘧啶脫氨，改變核酸結構和性質，造成DNA復制紊亂。HNO2還能造成DNA雙鏈間的交聯而引起遺傳效應。
疊氮化鈉(NaN3) 是一種呼吸抑制劑，能引起基因突變，可獲得較高的突變頻率，而且無殘毒。

提醒：有些化學誘變劑是有劇毒的。

4. 誘變育種一般採用什麼方法

答案A
用射線或激光照射屬於誘變育種,花葯離體培養屬於單倍體育種,秋水仙素處理萌發的種子屬於多倍體育種,人工雜交屬於雜交育種.

5. 人工誘變的化學方法

人工誘變育種的理論基礎是基因突變，常用的方法有物理方法，如用X射線、γ射線、紫外線、激光等處理；化學方法如用亞硝酸和硫酸二乙酯等處理．
故答案為：
基因突變 X射線 γ射線 紫外線 激光 亞硝酸 硫酸二乙酯

6. 多倍體育種的誘變方法

人工誘變染色體加倍的方法很多，可分為物理誘變法、化學誘變法和生物誘變法。
物理法包括：機械損傷、高低溫和射線照射等
生物學誘導途徑包括：不同倍性材料間雜交育種，胚乳培養，細胞雜交等
化學誘變。主要利用化學誘變劑與細胞發生一系列生化反應阻止有絲分裂的正常進行，使分裂後期的染色體全部進入一個子代細胞中而產生多倍體。化學葯劑包括秋水仙素、萘乙烷、異生長素、N-亞硝基-N-二甲脲、吲哚乙酸、氨磺靈、戊炔草胺、六氯化苯、三氯乙醛、氯化亞汞、富民隆等微管抑制劑。

7. 誘變育種的方法

物理、化學誘變的方法及其機理如下述。 應用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。當通過輻射將能量傳遞到生物體內時，生物體內各種分子便產生電離和激發，接著產生許多化學性質十分活躍的自由原子或自由基團 。它們繼續相互反應，並與其周圍物質特別是大分子核酸和蛋白質反應，引起分子結構的改變。由此又影響到細胞內的一些生化過程，如 DNA合成的中止、各種酶活性的改變等，使各部分結構進一步深刻變化，其中尤其重要的是染色體損傷。由於染色體斷裂和重接而產生的染色體結構和數目的變異即染色體突變，而DNA分子結構中鹼基的變化則造成基因突變。那些帶有染色體突變或基因突變的細胞，經過細胞世代將變異了的遺傳物質傳至性細胞或無性繁殖器官，即可產生生物體的遺傳變異。
誘變處理的材料宜選用綜合性狀優良而只有個別缺點的品種、品系或雜種。由於材料的遺傳背景和對誘變因素的反應不同，出現有益突變的難易各異，因此進行誘變處理的材料要適當多樣化。由於不同科、屬、種及不同品種植物的輻射敏感性不同，其對誘變因素反應的強弱和快慢也各異。如十字花科白菜的敏感性小於禾本科的水稻、大麥，而水稻、大麥的敏感性又小於豆科的大豆。另外，輻射敏感性的大小還同植物的倍數性、發育階段、生理狀態和不同的器官組織等有關。如二倍體植物大於多倍體植物，大粒種子大於小粒種子，幼齡植株大於老齡植株，萌動種子大於休眠種子，性細胞大於體細胞等。根據誘變因素的特點和作物對誘變因素敏感性的大小，在正確選用處理材料的基礎上，選擇適宜的誘變劑量是誘變育種取得成效的關鍵（表 1）。適宜誘變劑量是指能夠最有效地誘發作物產生有益突變的劑量，一般用半致死劑量（LD50）表示。不同誘變因素採用不同的劑量單位。Χ、γ射線線吸收劑量以拉德(rad）或戈瑞（GY）為單位，照射劑量以倫琴（R）為單位，中子用注量表示。同時要注意單位時間的照射劑量（劑量率、注量率）以及處理的時間和條件。
輻照方法分外照射和內照射兩種，前者指被照射的植物接受來自外部的γ射線源、Χ射線源或中子源等輻射源輻照，這種方法簡便安全，可進行大量處理。後者指將放射性物質(如32P、35S等）引入植物體內進行輻照，此法容易造成污染，需要防護條件，而且被吸收的劑量也難以精確測定。干種子因便於大量處理和便於運輸、貯藏，用於輻照最為簡便。 化學誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學效應，如引起染色體斷裂等，常用於處理遲發突變，並對某特定的基因或核酸有選擇性作用。化學誘變劑主要有：①烷化劑。這類物質含有1個或多個活躍的烷基，能轉移到電子密度較高的分子中去，置換其他分子中的氫原子而使鹼基改變。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亞胺（EI）、亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸鹼基類似物。為一類與DNA鹼基相類似的化合物。滲入DNA後，可使DNA復制發生配對上的錯誤。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。③抗生素。如重氮絲氨酸、絲裂毒素C等，具有破壞DNA和核酸的能力，從而可造成染色體斷裂。
化學誘變主要用於處理種子，其次為處理植株。種子處理時，先在水中浸泡一定時間，或以干種子直接浸在一定濃度的誘變劑溶液中處理一定時間，水洗後立即播種，或先將種子乾燥、貯藏，以後播種。植株處理時，簡單的方法是在莖稈上切一淺口，用脫脂棉把誘變劑溶液引入植物體，也可對需要處理的器官進行注射或塗抹。應用的化學誘變劑濃度要適當（表 2）。處理時間以使受處理的器官、組織完成水合作用和能被誘變劑所浸透為度。化學誘變劑大都是潛在的致癌物質，使用時必須謹慎。

8. 求：人工誘變的常用方法及特點!!

在人為的條件下,利用物理,化學等因素,誘發生物產生突變,從中選擇,培育成動植物和微生物的新品種.誘變育種是指用物理、化學因素誘導植物的遺傳特性發生變異，再從變異群體中選擇符合人們某種要求的單株，進而培育成新的品種或種質的育種方法。它是繼選擇育種和雜交育種之後發展起來的一項現代育種技術。

我們知道，常規助雜交育種基本上是染色體的重新組合，這種技術一般並不引起染色體發生變異，更難以觸及到基因。而輻射的作用則不同，它們有的是與細胞中的原子、分子發生沖撞、造成電離或激發；有的則是以能量形式產生光電吸收或光電效應；還有的能引起細胞內的一系列理化過程。這些都會對細胞產生不同程度的傷害。對染色體的數目、結構等都會產生影響，使有的染色體斷裂了；有的丟失了一段，有的斷裂後在「自我修復」的過程中頭尾接倒了或是「張冠李戴」分別造成染色體的倒位和易位。當然射線也可作用在染色體核苷酸分子的鹼塞上，從而使基因（遺傳密碼)發生突變。至於化學誘變，有的葯劑是用其烷基置換其它分子中的氫原子，也有的本身是核苷酸鹼基的類似物，它可以「魚目混珠」，造成DNA復制中的錯誤。無疑這些都會使植物的基因發生突變。理、化因索的誘導作用；使得植物細胞的突變率比平時高出千百倍，有些變異是其它手段難以得到的。當然，所產生的變異絕大多數不能遺傳，所以，輻射後的早代一般不急於選擇。

物理誘變
應用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。當通過輻射將能量傳遞到生物體內時，生物體內各種分子便產生電離和激發，接著產生許多化學性質十分活躍的自由原子或自由基團。它們繼續相互反應，並與其周圍物質特別是大分子核酸和蛋白質反應，引起分子結構的改變。由此又影響到細胞內的一些生化過程，如 DNA合成的中止、各種酶活性的改變等，使各部分結構進一步深刻變化，其中尤其重要的是染色體損傷。由於染色體斷裂和重接而產生的染色體結構和數目的變異即染色體突變,而DNA分子結構中鹼基的變化則造成基因突變。那些帶有染色體突變或基因突變的細胞，經過細胞世代將變異了的遺傳物質傳至性細胞或無性繁殖器官，即可產生生物體的遺傳變異。

化學誘變

化學誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學效應，如引起染色體斷裂等，常用於處理遲發突變，並對某特定的基因或核酸有選擇性作用。

化學誘變劑主要指某些烷化劑，鹼基類似物，抗生素等化學葯物。化學誘變劑在植物上的應用一般認為始於1943年，當時F·約克斯用馬來糖(脲烷)誘發了月見草、百合和風鈴草的染色體畸變。這些早期工作為確立誘變育種的地位奠定了基礎。

化學誘變劑

（一）烷化劑

烷化劑是栽培作物誘發突變的最重要的一類誘變劑。葯劑帶有一個或多個活潑的烷基。通過烷基置換，取代其它分子的氫原子稱為"烷化作用"所以這類物質稱烷化劑。

烷化劑分為以下幾類：

1. 烷基磺酸鹽和烷基硫酸鹽

代表葯劑：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）

2. 亞硝基烷基化合物

代表葯劑：亞硝基乙基脲（NEH）、N-亞硝基-N-乙基脲烷（NEU）

3. 次乙胺和環氧乙烷類

代表葯劑：乙烯亞胺（EI）

4. 芥子氣類

氮芥類、硫芥類

烷化劑的作用機制--烷化作用重點是核酸，導致DNA斷裂、缺失或修補。

（二）核酸鹼基類似物
這類化合物具有與DNA鹼基類似的結構。
代表葯劑：
5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 為胸腺嘧啶（T）的類似物
2-氨基嘌呤（AP） 為腺嘌呤（A）的類似物
馬來醯肼（MH） 為尿嘧啶（U）的異構體
作用機制：作為DNA的成份而滲入到DNA分子中去，使DNA復制時發生配對錯誤，從而引起有機體變異。
（三）其它誘變劑
亞硝酸 能使嘌呤或嘧啶脫氨，改變核酸結構和性質，造成DNA復制紊亂。HNO2還能造成DNA雙鏈間的交聯而引起遺傳效應。
疊氮化鈉(NaN3) 是一種呼吸抑制劑，能引起基因突變，可獲得較高的突變頻率，而且無殘毒。

提醒：有些化學誘變劑是有劇毒的。

9. 簡述誘變育種的操作方法和步驟！

一、實驗目的和內容目的：以紫外線誘變獲得用於醬油生產的高產蛋白酶菌株為例，學習微生物誘變育種的基本操作方法。內容：1．對米麴黴(Aspergillsoryzae)出發菌株進行處理，制備孢子懸液。2．用紫外線進行誘變處理。3．用平板透明圈法進行兩次初篩。4．用搖瓶法進行復篩及酶活性測定。二、實驗材料和用具米麴黴斜面菌種；豆餅斜面培養基、酪素培養基、蒸餾水、0.5%酪蛋白；三角瓶(300mL、500mL)、試管、培養皿(9cm)、恆溫搖床、恆溫培養箱、紫外照射箱、磁力攪拌器、脫脂棉、無菌漏斗、玻璃珠、移液管、塗布器、酒精燈。三、操作步驟(一)出發菌株的選擇及菌懸液制備1．出發菌株的選擇可直接選用生產醬油的米麴黴菌株，或選用高產蛋白酶的米麴黴菌株。2.菌懸液制備取出發菌株轉接至豆餅斜面培養基中，30℃培養3～5d活化。然後孢子洗至裝有1mL0.lmol/LpH6.0的無菌磷酸緩沖液的三角瓶中(內裝玻璃珠，裝量以大致鋪滿瓶底為宜)，30℃振盪30min，用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過濾，製成把子懸液，調其濃度為106～108個/mL，冷凍保藏備用。(二)誘變處理用物理方法或化學方法，所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定，有時還可採用復合處理，可獲得更好的結果。本實驗學慣用紫外線照射的誘變方法。1．紫外線處理打開紫外燈(30W)預熱20min。取5mL菌懸液放在無菌的培養皿(9cm)中，同時製作5份。逐一操作，將培養皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上，照射lmin後打開培養皿蓋，開始照射，與照射處理開始的同時打開磁力攪拌器進行攪拌，即時計算時間，照射時間分別為15s、30s、lmin、2min、5min。照射後，誘變菌液在黑暗冷凍中保存1～2h然後在紅燈下稀釋塗菌進行初篩。2．稀釋菌懸液按10倍稀釋至10-6，從10-5和10-6中各取出0.lmL加入到酪素培養基平板中(每個稀釋度均做3個重復)，然後塗菌並靜置，待菌液滲入培養基後倒置，於30℃恆溫培養2～3d。(三)優良菌株的篩選1.初篩首先觀察在菌落周圍出現的透明圈大小，並測量其菌落直徑與透明圈直徑之比，選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落40～50個，作為復篩菌株。2．平板復篩分別倒酪素培養基平板，在每個平皿的背面用紅筆劃線分區，從圓心劃線至周邊分成8等份，1～7份中點種初篩菌株，第8份點種原始菌株，作為對照。培養48h後即可見生長，若出現明顯的透明圈，即可按初篩方法檢測，獲得數株二次優良菌株，進大搖瓶復篩階段。3．搖瓶復篩將初篩出的菌株，接入米麴黴復篩培養基中進行培養，其方法是，稱取麥秩85g，豆餅粉(或麵粉)15g，加水95～110mL(稱為潤水)，水含量以手捏後指縫有水而不下滴為宜，於500mL三角瓶中裝入15～20g(料厚為1～1.5cm)，121℃濕熱滅菌30min，然後分別接入以上初篩獲得的優良菌株，30℃培養，24h後搖瓶一次並均勻鋪開，再培養24～48h，共培養3～5d後檢測蛋白酶活性。4．蛋白酶的測定方法(1)取樣：培養後隨機稱取以上搖瓶培養物1g，加蒸餾水100mL，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液測定酶活性。另取lg培養物於105℃烘乾測定含水量。(2)酶活性測定：30℃pH7.5條件下水解酪蛋白(底物為0.5%酪蛋白)，每分鍾產酪氨酸1μg為一個酶活力單位。計算公式為：(A樣品OD680nm值-A對照OD680nm值)×K×V/t×NK：標准曲線中光吸收為「1」時的酪氨酸微克數；V：酶促反應的總體積；t：酶促反應時間(min)；N：酶的稀釋倍數。5．谷氨酸的檢測此項檢測也是醬油優良菌株的重要指標之一。檢測培養基：豆餅粉：麩夫=6：4，潤水75%，121℃濕熱滅菌30min。谷氨酸測定：於以上培養基中加入7%鹽水(W/V)，40～45℃水浴，水解9d後過濾，以濾液檢測谷氨酸含量(測壓法)。四、注意事項1.紫外線照射時注意保護眼睛和皮膚。2.誘變過程及誘變後的稀釋操作均在紅燈下進行，並在黑暗中培養。五、實驗報告1.試列表說明高產蛋白酶菌株的篩選過程和結果。2.你認為以上的篩選方法有什麼優缺點，如何改進？六、問題和思考1．試述紫外線誘變的作用機理及其在具體操作中應注意的問題。2．為什麼在誘變前要把菌懸液打散和培養一段時間？註：篩選菌株數的計算若按突變率為0.01計算，則一次篩選可取250—300個菌落，第一次篩選後可多選幾株高產株，而二級篩選為重點階段，其最適量可參考以下計算方法：如初篩菌株數為200株，二次篩選欲選株數為2株，則二級應選(200×2)1/2，為20株，這樣的數量選擇，使有可能從較少的數量中獲得相對較多的優良菌株。

10. 誘變育種的基本步驟有哪些關鍵是什麼何故

誘變育種步驟主要包括誘變和篩選，其中誘變過程包括：出發菌株的選擇、單孢子或單細胞懸浮液的制備、誘變劑及誘變劑量的選擇、誘變處理等。

誘變育種（mutation breeding）在人為的條件下，利用物理、化學等因素，誘發生物體產生突變，從中選擇，培育成動植物和微生物的新品種。

(10)常用誘變方法擴展閱讀：

誘變育種方法：

1、物理誘變

應用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。當通過輻射將能量傳遞到生物體內時，生物體內各種分子便產生電離和激發，接著產生許多化學性質十分活躍的自由原子或自由基團[1]。

2、化學誘變

化學誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學效應，如引起染色體斷裂等，常用於處理遲發突變，並對某特定的基因或核酸有選擇性作用。化學誘變主要用於處理種子，其次為處理植株。