對大腸桿菌常用的固定方法

1. 微生物實驗中為什麼細菌在染色前需要固定

微生物實驗中細菌在染色前需要固定的原因：
一：殺死細胞，是染料易於著色。
二：使細菌附著於玻片上，不易被水沖掉。
在固定時，是要慢慢晾乾，如果得確要加快速度，可以處於酒精燈火焰上部遠處稍微烘幾下，切忌烘得玻片升溫，否則有可能會破壞細菌生命形態
細菌的革蘭氏染色與顯微觀察
一、 實驗原理
革蘭氏染色原理：細菌對於革蘭氏染色的不同反應，是由於它們細胞壁的成分和結構不同造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網狀結，當用乙醇處理時，由於脫水而引發網狀結構的孔徑變小，通透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染後仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌的細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染後，細胞被染上復染劑的紅色。 顯微鏡成像原理：現代普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統來放大成像，故又常 被稱為復式顯微鏡。顯微鏡的光學系統中，物鏡的性能最為關鍵，油鏡的放大倍數最大，對微生物學研究最為重要。在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油主要是為了增加照明亮度和增加顯微鏡的解析度。以油代替空氣作為光的傳播介質，減少光線的折射或全反射，使觀察到的像更加清晰。
二、 實驗器材
1. 菌落：
大腸桿菌24h營養瓊脂斜面培養物、
金黃色葡萄球菌約24h營養瓊脂斜面培養物、 枯草芽孢桿菌12～18h營養瓊脂斜面培養物。
2. 溶液或試劑：
蒸餾水、碘液、結晶紫染色液、95%酒精、番紅染色液、香柏油。 3. 儀器：
顯微鏡、載玻片、接種環、酒精燈、鑷子、擦鏡紙。
三、 實驗步驟
革蘭氏染色：
1. 塗片
取出載玻片，點燃載玻片，燃盡載玻片上的酒精和滅菌，在中間輕輕點一小滴蒸餾水，用接種環在試管的斜面培養基上，輕輕挑取少量菌體，整個過程試管口都要處在酒精燈的上方，而且速度要快，以防污染培養基。然後在載玻片的小水滴以轉圈的動作塗片，待水滴混濁後停住，等其乾燥、固定。
2. 初染
滴加結晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)於菌落上，染色1～2min ，傾去染色液，有細水從載玻片上方向下沖洗，至洗出液為無色，將載玻片上水甩凈。
3. 媒染
滴加碘液沖去殘水，並覆蓋約1min，水洗。
4. 脫色
將載玻片上面的水甩凈，將載玻片傾斜，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脫色，直至流出的酒精剛好不出現藍色，立即用水沖凈酒精，將載玻片上水甩凈。
5. 復染
用番紅液復染約1～2min，水洗，然後再吸水紙吸干
6. 鏡檢：

在低倍鏡下尋找要觀察的細菌菌落（在不停地移動載玻片，若感覺到有紅色陰影，立刻停止，調整倍數，若不是菌落，繼續找），將鏡筒升高，然後轉換到油鏡。在樣品區域加滴香柏油，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中並幾乎與標本相接。將聚光器升至最高位置並開足光圈，用粗調節器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現物像並用細調節器使其清晰准焦為止。

2. 養大腸桿菌的具體步驟

大腸桿菌（Escherichia coli），又叫大腸埃希氏菌，Escherich在1885年發現的。

養大腸桿菌的方法和具體步驟：

1、發酵法，這種方法主要是在44.5℃下的培養基上進行大腸桿菌的培養，該培養基含有熒光底物，需要培養 24 h。

然後對熒光底物進行釋放，需要採用葡萄糖醛酸進行，讓培養基能夠在紫外光的照射下發出熒光。主要步驟包括發酵、分離培養、二次發酵、顯微鏡觀察等。

2、濾膜法主要過程：加入 10 mL 左右的無菌水於濾器中，然後摻入一些無菌水進行清潔濾器的內壁，再進行過濾，將濾膜放在 M-FC 培養基中，兩者之間不能夠有氣泡，然後進行密封，存放溫度為 44.5℃，存放時間約 24 h，直到大腸桿菌的菌群變成藍色或藍綠色。

(2)對大腸桿菌常用的固定方法擴展閱讀：

大腸桿菌是動物腸道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定條件下引起疾病 。

大腸桿菌的血清型能夠引起人體或動物胃腸道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃腸道感染以外，還會引起尿道感染、關節炎、腦膜炎以及敗血型感染等大腸桿菌是短桿菌，兩端呈鈍圓形，革蘭陰性。

有時因環境不同，個別菌體出現近似球桿狀或長絲狀
；大腸桿菌多是單一或兩個存在，但不會排列呈長鏈形狀；大多數的大腸桿菌菌株具有莢膜或微莢膜結構，但是不能形成芽孢。

多數大腸桿菌菌株生長有菌毛，其中一些菌毛是針對宿主及其他的一些組織或細胞具有黏附作用的宿主特異性菌毛。

3. 大腸桿菌的防治方法

大腸桿菌是人和動物腸道中最主要和數量最多的一種細菌,主要寄生於大腸內。大腸桿菌的危害有哪些呢？本文是我整理的大腸桿菌的危害，歡迎閱讀。

大腸桿菌的危害

大腸桿菌是原核生物,構造相對簡單,遺傳背景清晰,培養操作容易,因此也常常被作為基因工程的對象加以利用:研究者常常將外源基因導入質粒,將質粒整合入大腸桿菌基因,這樣,大腸桿菌就能夠表達基因重組後的蛋白。此外,大腸桿菌還常常作為模型生物參與細胞學實驗。雖然絕大多數大腸桿菌與人類有著良好合作,但是仍有少部分特殊類型的大腸桿菌具有相當強的毒力,一旦感染,將造成嚴重疫情。其中最具代表性的就是代號為O157:H7的大腸桿菌,它是EHEC(腸出血性大腸桿菌)家族中的一員。

大腸桿菌的防治方法

保持地方及廚房器皿清潔,並把垃圾妥為棄置;保持雙手清潔,經常修剪指甲;進食或處理食物前,應用肥皂及清水洗凈雙手,如廁或更換尿片後亦應洗手;食水應採用自來水,並最好煮沸後才飲用;應從可靠的地方購買新鮮食物,不要光顧無牌小販;避免進食高危食物,例如未經低溫消毒法處理的牛奶,以及未熟透的漢堡扒、碎牛肉和其它肉類食品;烹調食物時,應穿清潔、可洗滌的圍裙,並戴上帽子;食物應徹底清洗;易腐壞食物應用蓋蓋好,存放於雪櫃中;生的食物及熟食,尤其是牛肉及牛的內臟,應分開處理和存放(雪櫃上層存放熟食,下層存放生的食物),避免交叉污染。

大腸桿菌的特點

周身鞭毛,能運動,無芽孢。能發酵多種糖類產酸、產氣,是人和動物腸道中的正常棲居菌,嬰兒出生後即隨哺乳進入腸道,與人終身相伴,其代謝活動能抑制腸道內分解蛋白質的微生物生長,減少蛋白質分解產物對人體的危害,還能合成維生素B和K,以及有殺菌作用的大腸桿菌素。正常棲居條件下不致病。但若進入膽囊、膀胱等處可引起炎症。在腸道中大量繁殖,幾占糞便乾重的1/3。在環境衛生不良的情況下,常隨糞便散布在周圍環境中。若在水和食品中檢出此菌,可認為是被糞便污染的指標,從而可能有腸道病原菌的存在。

大腸桿菌的致病物質

定居因子:也稱粘附素,即大腸桿菌的菌毛。致病大腸桿菌須先粘附於宿主腸壁,以免被腸蠕動和腸分泌液清除;大腸桿菌具有很多毒力因子,包括內毒素,莢膜,〣型分泌系統,黏附素和外毒素等;黏附素 能使細菌緊密黏著在泌尿道和腸道的細胞上,避免因排尿時尿液的沖刷和腸道的蠕動作用而被排除;外毒素大腸桿菌能產多種的外毒素,包括:志賀毒素〡和〢;耐熱腸毒素〡和〢;不耐熱腸毒素〡和〢。此外,溶血素A在尿路致病性大腸桿菌所致疾病中有重要作用;腸毒素:是腸產毒性大腸桿菌在生長繁殖過程中釋放的外毒素,分為耐熱和不耐熱兩種。腸產毒性大腸桿菌的有些菌株只產生一種腸毒素,即LT或ST;有些則兩種均可可產生。有些致病大腸桿菌還可產生vero毒素。

大腸桿菌超標的危害

1、大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調查研究表明，大腸菌群細菌多存在於溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便污染的地方，人、畜糞便對外界環境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環境中則以大腸菌群其他型別較多。

2、大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在(如沙門氏菌、志賀氏菌等)，因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。

3、如果食品的菌落總數嚴重超標，說明其產品的衛生狀況達不到基本的衛生要求，將會破壞食品的營養成分，加速食品的腐敗變質，使食品失去食用價值。消費者食用微生物超標嚴重的食品，很容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等症狀，危害人體健康安全。而大腸菌群超標，也同樣會引起腹瀉、腸胃感染等。

大腸桿菌怎樣傳播

1、腸出血性大腸桿菌主要通過被污染的食物傳播，目前尚未發現人與人之間的接觸導致廣泛傳播的證據。

2、大腸桿菌O157:H7主要通過食用污染的食物向人類傳播，例如生的或未煮熟的碎肉製品和生鮮奶。受糞便污染的水和其它食物以及食物制備期間的交叉污染(與牛肉和其它肉製品、受污染的板面和廚房用具)也將導致感染。導致O157:H7大腸桿菌疫情的食物包括未煮熟的漢堡包、風干腸、未施行巴氏消毒的新鮮壓榨蘋果酒、酸奶、由生鮮奶製作的乳酪。推薦閱讀：警惕食物傳播大腸桿菌

3、越來越多的疫情與食用水果和蔬菜(芽苗菜、菠菜、萵苣、酸捲心菜絲、生菜)有關，由於種植或處理期間的某一階段接觸到家畜或野生動物的糞便而可能造成污染。也從水體(池塘、溪水)、井和水槽中分離出腸出血性大腸桿菌，並發現該菌在糞便和水槽沉澱物中能夠存活數月。來自被污染的飲用水和遊憩用水的水源性傳播均有報告。

4. 有誰知道大腸桿菌的詳細培養方法

培養大腸桿菌用LB培養基。
LB培養基是一種培養基的名稱,生化分子實驗中一般用該培養基來預培養菌種,使菌種成倍擴增,達到使用要求.培養的菌種一般是經過改造的無法在外界環境單獨存活和擴增的工程菌.通過培養工程菌,我們可以表達大量的外源蛋白,也可以拿到帶有外源基因的質粒,工程菌的有效擴增是生化分子實驗的基礎.
LB培養基的配方如下:
胰蛋白腖(Tryptone) 10g/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
氯化鈉(NaCl) 5g/L
另外根據經驗值用NaOH調節該培養基的pH,使其達到7.4(該pH適合目前使用最廣的原核表達菌種E.coli的生長)
E.Coli就是大腸桿菌
最好用去離子水配製，不過要求不是很嚴格的話純凈水也可以。

5. 大腸桿菌檢測方法國標是用什麼方法檢測的

大腸桿菌檢測方法分為三種：

1、細菌分離鑒定法

分離培養與鑒定：糞便標本直接接種腸道桿菌選擇性培養基。血液先經肉湯增菌，然後轉種血瓊脂平板。其他標本同時接種血瓊脂平板和腸道桿菌選擇性培養基。

37℃孵育18～24小時後，觀察菌落塗片染色鏡檢。腸致病性大腸桿菌須先作血清學定型試驗。必要的時候檢定腸黴毒素。

2、衛生細菌學檢查法

大腸桿菌會不斷隨糞便排出體外，污染周圍環境水源、食品等。取樣檢查時，樣品中大腸桿菌越多，則表示樣品被糞便污染的越嚴重，表明樣品中存在腸道致病菌的可能性也就越大。

大腸菌數指數：指每立升中大腸菌群數，採用乳糖發酵法檢測。中國衛生標準是每1000ml飲水中不得超過3個大腸菌群，瓶裝汽水和果汁中每100ml大腸菌群不能超過5個。

3、全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測法

全自動微生物定量分析（TEMPO）儀大腸桿菌群計數檢測有TEMPOTC和TEMPOCC兩種方法。

TEMPOTC的開發是為獲得NF ISO4832標准相當性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO儀器上根據BAM方法專門用於24h計數食品中大腸桿菌群方法。

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大腸桿菌在生物技術中的應用

這些菌株由於失去了細胞壁等重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。即便由於操作不慎導致活菌從實驗室流出，也不易導致生化危機。

生物工程用的菌株基因組都被優化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用於分子克隆實驗。

真核基因在大腸桿菌中表達，必須有合適的表達載體(Vector),常用載體：pBV220,pET系統。

目的基因在大腸桿菌中表達的情況：

大腸桿菌更適合原核基因的表達，外源基因表達產量與單位體積產量是正相相關的，外源基因拷貝數和表達 產物產量之間存在動態平衡，單個細胞的產量又與外源基因拷貝數，基因表達效率，表達產物的穩定性和細胞代謝負荷等因素有關。

6. 大腸桿菌保存

以實驗室要求來說，斜面培養基上的菌，還有菌液，都不是保存菌株的方法，那都是培養、擴增菌株用的，在4度放著，幾天就不行了。

要保存菌株，應該採取甘油管的方式：取出一點發酵得到的菌液，按3:1加入甘油，攪勻，液氮速凍，然後放入-70度超低溫冰箱，可保2年活力，需要使用時，冰上解凍，沾一點加到新培養基里活化培養。

如果你是想保存一大瓶菌液，比如說今天培養了一瓶或者一管，想放到冰箱等想用的時候再用……那我告訴你快算了吧，菌液只能現培養現用，細菌也是活的，怎麼都放不住的，只能存個種，需要的時候再培養。

回答你的補充：原則上是現養現用，如果你實在懶，那可以把菌液放在4度冰箱，能用個1,2天。

7. 大腸桿菌與黑麴黴分別採用什麼保藏方法為好,為什麼

大腸桿菌適宜冷凍保藏，有條件的話按比例加入甘油做保護劑在－70℃低溫冰箱保存，也可以在－30～－20℃普通冰箱