檢測貝類毒素最常用的方法

① 軟骨藻酸的檢測方法

該法是根據美國公職化學家協會（AOAC）所標定的麻痹性貝中毒（PSP）的小鼠生物分析法加以變化的，是最早用於DA檢測的一種經典方法。其原理是將毒素注射入小白鼠體內，根據注射後小鼠的存活時間和中毒症狀來評價毒性，一般用半致死劑量表示。1987 年該方法首次應用於加拿大DA 中毒事件中DA 的測定，結果顯示該方法適於檢測貝類組織中高濃度的DA（高於30μg/g），DA 濃度較低時無法檢測（低於20μg/g）。
該法更加註重研究DA的毒性效應和毒理研究。這是一般其他方法無法取代的，而且採用小白鼠生物檢測法可以檢測一些未知的毒性物質，通過半數致死劑量來評價該物質的毒性效應，因此小白鼠生物檢測法在各個國家仍有很廣泛的應用。但是，該方法的檢出限較高，適用於檢測貝類組織中高濃度的DA（300-1000μg/g），不適用於DA含量低於20μg/g組織的檢測。
小白鼠生物檢測法方法檢測周期大於24h，特異性較差，干擾因素較多，樣品處理為粗略提取，樣品批次單一。小白鼠生物檢測法檢測DA是最早使用的一種方法，但是其試驗結果受外部影響因素較為復雜，試驗結果與小白鼠的品系和試驗者本身操作有很大關系，並且小白鼠生物檢測法一般要有至少1d的檢測周期，該方法的檢出限較低。此外，小白鼠生物法僅能測定毒性的大小，無法確定毒素的組成和各成分的含量。小白鼠生物檢測法最大的局限性是小鼠本身造成結果的高變異性和低敏感性，而且對鼠種的要求較高。 高效液相色譜法（HPLC）是檢測DA應用最廣的方法，已被多國列為國家標准方法，中國國家標准中規定使用反相高效液相色譜法檢測海產雙殼類貝肉、貝柱、外套膜及其製品（不包括鹽漬製品）中的DA含量，該方法檢測限為1μg。生物分析法注重的是樣品毒性的分析，其專一性和靈敏度低，而高效液相色譜法則能靈敏、快速、准確地確定各種毒素成分，被廣泛用於研究和確認實驗。HPLC檢測DA是利用其在242nm處具有最大吸收值的特徵使用紫外或二極體檢測器進行檢測，或者將DA衍生後通過熒光檢測器進行分析，或使用質譜進行檢測。高效液相色譜的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器和質譜檢測器，由於貝類提取液中干擾組分復雜，光度檢測往往不能提供化合物的充分結構信息，因此會引起假陽性的結果。高效液相色譜法檢出限低，方法成熟，但儀器昂貴、笨重，一次只能測定一個樣品，不適合快速現場檢測。對設備條件要求較高，也不能大量用於基層的日常監測工作。
軟骨藻酸HPLC曲線參考文獻。
DA-HPLC檢測DA的方法主要有兩大類，一種方法是貝類樣品被提取後，經濃縮純化後進行HPLC配紫外檢測器（HPLC-UVD）分析。由於DA在242nm的紫外光譜區有最大吸收峰，因此反相高效液相色譜（RP-HPLC）-UV可有效而快速地對樣品進行分離和檢測，其基本原理是使用酸性流動相以抑制羧基的電離作用，並選用C18鍵合硅膠柱分離DA及其衍生物。HPLC-UVD法特別適用於分析貝類組織內的DA含量，其檢測限在10-80ng/ml之間，且依提取和提純方法的不同而異，如粗提取物未經提純，其檢測限約為1μg/g，適用於毒素含量超過20μg/g的檢測。水中DA的檢測與樣品量及藻類的含量和種類等因素有關。另一種方法是針對海水和硅藻中DA進行的甲氧基芴甲酸（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）衍生化/HPLC配熒光檢測器（HPLC-FLD）法，該法在DA分子上引進了熒光基團而使FLD檢測的靈敏度提高，對海水中DA的檢測限為1.5pg/ml。Hummert等提出了柱切換系統，它能有效降低提取物中的干擾，直接分析粗提的樣品，省去了復雜的樣品預處理過程。流動相的配比影響DA的保留時間，隨著流動相中乙腈比例的減小，DA保留時間增加，DA色譜峰對稱性增強，DA與DAC′5非對映異構體分離度增大。中國報道用RP-HPLC-UVD測定貝類中DA，經甲醇:水（1：1）溶液提取，強陰離子（stronganion exchange，SAX）固相萃取柱凈化，C18反相色譜柱分離，流動相為乙腈:水（13：87），242nm波長下檢測，最低檢出限為0.2μg/g，在1.0-25.0μg/ml范圍內有良好的線性關系，平均回收率為（97.23±2.43）%。流動相採用甲醇:水（22：78，pH2），最低檢出限為10ng（1.0μg/ml），檢測范圍50-250ng（5-25μg/ml），DA的回收率可達（99.9±2.4）%。另有報道流動相為甲醇:乙腈:三氟乙酸（80：20：0.1），最低檢出限為10ng（1.0μg/ml），在1-40μg/ml范圍內線性關系良好。
高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）特別適用於貝類組織中DA含量的測定，尤其適用於毒素含量超過20μg/g的情況。Lawrence等人建立[以及Quilliam等改進的HPLC-UV法採用了反相C18柱在242nm處檢測DA，該方法已被英國、愛爾蘭等國定為標准方法。後來，又有一些研究人員對此方法進行了改進。López-Rivera等建立了一種不需要固相萃取預處理檢測DA的HPLC-UV法，通過等梯度淋洗以及控制流動相pH來分離化合物，結果表明，最佳pH為2.5，方法檢測限為25ng/mL。該方法快速、靈敏，能成功檢測大批量貝類樣品。HPLC-UV法已經被很多研究人員用來檢測貝類等動物組織中的DA含量。Costa等用HPLC-UV法檢測了葡萄牙海岸的兩種章魚E.cirrhosa和E.moschata體內DA的含量，結果表明，DA含量超過了100μg/g，其中，E.moschata體內毒素含量更高，表明DA可能通過食物鏈由這種章魚體內進入更高級消費者如人類體內，潛在危險性更大。中國對DA的檢測大多採用HPLC-UV法，張一兵等在借鑒國外方法的基礎上應用高效液相色譜-紫外可見檢測法（HPLC-UVD）進一步優化了DA的高效液相色譜-紫外檢測法，選定pH2的甲醇/水=22∶78（V/V）為流動相，LC-SAX作為濃縮純化柱，檢出限為10ng，回收率達到92%-94%。陳西平等採用該方法檢測了部分水及水生動物中DA的含量，回收率達到70%-93%，檢出限為10ng。結果表明，雖然在海水及地面淡水中未檢出DA，但部分海洋貝殼動物體內有檢出。因此，隨著海洋污染的加劇，現階段中國的DA污染問題不容忽視，應加強對其污染狀況的監測。
高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）聯用技術可以不使用衍生試劑和毒素標准品，相比其他檢測器，具有很大的優勢。然而本方法對設備條件要求較高。Lawrence等建立的高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法（HPLC/ESI-MS）法是一種高靈敏度、高選擇性的方法，被應用到了環境中各種介質的檢測中，並被後人不斷改進，但是這種方法對樣品預處理的要求較高。宋琍琍等參考了這種方法來測定DA殘留。樣品經50%甲醇提取，LC-SAX 柱凈化，然後選用電噴霧離子源進行測定分析，該方法的定量限為0.02μg/g。Pardo等採用加壓濕法萃取（PLE）來提取DA，然後用液相色譜-電噴霧電離雙質譜（HPLC-ESI-MS-MS）法來檢測DA，電離源採用電噴霧可以提高分析信號，方法經過優化後回收率在81%至95%之間，他們用此方法成功檢測了46個西班牙超市裡的貝類樣品，表明該方法能進行大批量檢測。Wang 等採用LC-MS 對水樣和浮游植物中的DA 進行了定性和定量分析，樣品預處理採用C18柱進行固相萃取，結果表明，酸性條件有利於在C18 柱上保留親水性的DA，加標水樣的回收率超過了90%，浮游植物樣品的回收率則接近98%，方法檢測限為0.03ng/mL。Iglesia等也採用LC-MS法檢測了海水中的DA及它的異構體，但樣品預處理採用的是固相萃取盤，該方法的檢測限為0.02ng/mL，回收率為92.1%-110.6%，用此方法能檢測海水中的痕量DA。Vale等利用HPLC-MS的方法，以1+1的甲醇溶液作為洗脫液，對葡萄牙魚類和貝類體內的軟骨藻酸含量進行測定，結果表明在春季樣品中DA含量最高；在分析的眾多樣品中，蛤仔和鳥蛤被軟骨藻酸污染最為嚴重，紫貽貝和牡蠣等物種受污染較輕。陳燕青等利用HPLC-MS法測定蝦夷扇貝和長牡蠣中軟骨藻酸的殘留，樣品經濃度50%甲醇提取，LC-SAX柱凈化，3ml0.1mol/L甲酸溶液洗脫，電噴霧離子源（ESI），在正離子、多反應監測方式（MRM）模式下進行定性與定量，該方法的檢出限達0.01μg/g，線性范圍為0.02-10.00μg/g。
高效液相色譜-熒光檢測法是使用衍生劑將DA衍生成含熒光基團的物質，用熒光檢測器進行檢測，在DA分子上引入熒光基團可使方法的靈敏度提高。檢出限可達到pg/ml。Maroulisb等利用柱後衍生法測定DA，加入4-氯-7-硝基-2，1，3-苯並氧雜惡二唑（NBD-Cl）與DA上的氨基反應生成熒光基團，提高了熒光檢測檢測器（FLD）的靈敏度，熒光檢測器激發波長設為469和529nm，檢出限低至25μg/kg。James等使用NBD-F來衍生化DA，用等梯度淋洗程序分離化合物，激發波長為470nm，發射波長為530nm，方法檢測限高於1ng/mL，貝類組織中DA的回收率>95%，當用強陰離子交換SPE柱萃取DA時，檢測限達到6ngDA/g貝類組織。Chan等參考了這種方法來檢測DA，但他們改進了樣品預處理方法，即在SPE柱中加入TiO2，可以更好地吸附DA，並探討了最佳pH，結果表明，吸附的最佳pH為4，解吸時pH則為11，吸附平衡時間為2小時，最佳吸附劑裝載量為0.67mgTiO2/ngDA。Maroulis等採用NBD-Cl柱後衍生DA進行檢測，成功測得了貝類組織中DA含量為75μg/kg的樣品，該方法檢測限低至25ppb，能實現全自動化分析，對樣品預處理要求低，干擾少。由於大多數衍生試劑價格昂貴、不穩定，且其分解產物可能出現在色譜圖中，同時衍生試劑的變質也可能導致毒素的不完全衍生化，因此熒光檢測法的實際應用很少。 免疫分析法（ELISA）是基於抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法，即根據抗原-抗體反應，採用特異性貝類毒素的抗體來檢測DA。免疫分析法主要包括酶聯免疫法、放射性免疫法、熒光免疫法等，具有方便、快速的特點，但缺點是費用較高，而且各毒素之間的交叉反應低，不能全面體現出樣品的毒性。檢測DA所採用的免疫分析方法主要是酶聯免疫吸附法（ELISA）。ELISA是利用抗原-抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，通過酶作用於底物後的顯色反應判定結果，是應用最廣泛的免疫學檢測技術，由於其實驗結果可用目測，也可用酶標儀測定光密度值以反映抗原含量，所以有易定性定量的雙重優點。Engvall和Perlmann於1971年最先應用該法進行IgG定量測定，並命名為Enzyme linked immunosor-bentassay（ELISA）。由於ELISA方法靈敏，特異性強不需要特殊設備，被廣泛應用於各種抗原和抗體測定。將ELISA應用於DA的檢測中，利用原-抗體反應，採用特異性貝類毒素的抗體來檢測DA。
Yu等採用匙孔血藍蛋白（KLH）和小牛血清蛋白（BSA）為載體，進行直接酶聯免疫測定，結果表明，藍貽貝樣品的檢測限<25ng/g，回收率為81.1%，Yu等還將實驗結果用HPLC方法進行了驗證，最終發現15種被污染的貝類樣品中有10種樣品的DA含量<50ng/g。Maucher等結合ELISA技術使用血液採集卡來提取小鼠血液中的DA，這種方法可以避免DA在血液中被清除。一般說來，在4小時內，99%的DA會從血液中被清除，但使用該方法後，DA在24小時內仍然能被檢測到。該方法靈敏度高，用血液採集卡提取樣品方便，因此可用此方法來監測海洋哺乳動物體內的DA含量。Tsao等採用單克隆抗體ELISA檢測法檢測DA，並建立了基於單克隆抗體的膠體金免疫條檢測法，免疫條檢測法的檢測限為5ng/mL，在十分鍾內就可完成檢測。Tsao等的實驗結果表明，用免疫條檢測得到的結果與用ELISA方法得到的結果有很好的吻合性，可以用來快速檢測貝類樣品中的DA。另外，Shaw等建立了基於基因工程單鏈抗體（scFv）競爭ELISA檢測方法，相比傳統方法，這種方法具有很多優勢，基因工程單鏈抗體（scFv）可以在大腸桿菌中快速、大量地得到表達，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用於檢測或其它用途。用該方法檢測天然扇貝組織得到的數據與標准HPLC方法檢測的結果基本相符。大多數ELISA法採用的都是直接法，而許道艷等則以DA-OVA為包被抗原，利用抗原抗體反應，建立了間接競爭酶聯免疫吸附技術分析檢測海水樣品和海洋貝類中DA的方法。結果表明，該方法最低檢出限為10μg/L，海水樣品平均回收率為102.2%，貝類樣品平均回收率為111.5%。ELISA方法能夠進行批量檢測，但特異性較差，因而主要用於DA的初步篩選。由於DA標准品昂貴，且DA分子量太小，因此制備免疫抗原較困難，從而限制了免疫方法在DA分析中的應用。 液質聯用（LC-MS/MS）技術幾乎可以分析所有的貝毒。液質聯用依賴於高效液相色譜把貝毒成分通過離子化帶到質譜中。電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源（APCI），這兩種技術都已經應用於貝毒分析。由於食品（動物組織）的背景非常復雜，樣品間差異又相當大，採用LC-MS（MS/MS）技術測定食品中貝類毒素的關鍵是樣品的前處理。國外文獻方法多採用甲醇-水溶液提取，然後固相萃取法進行凈化與濃縮，最常用的固相萃取柱有Cl8烷基鍵合硅膠柱，CN柱和離子交換柱，最常用的是陰離子交換柱，非鍵合硅膠柱也有很好的純化和萃取效果。此外還有溶劑提取方法、液相色譜制備法和超臨界流體萃取法等。食品（水產品）中的貝類毒素殘留量甚微，一般為μg/kg水平。2005年方曉明等利用液相色譜四極桿-飛行時間質譜（LC/Q-TOFMS）聯用技術對貝類樣品的失憶性貝毒進行了研究。樣品經甲醇/水（體積比為1：1）提取，經SAX固相萃取柱凈化後，用Zorbax Eclipse XDB-18柱（250mm×2.1mm，3.5μm）色譜分離，以乙腈/水含0.05%甲酸水溶液作流動相，梯度淋洗，流速為0.20mL/min。Q-TOFMS選擇電噴霧正離子模式，以[M+H]+作為前體離子進行TOFMS掃描。結果表明：樣品加標的平均回收率為87.8%-94.6%，相對標准偏差為8.4%-11.9%，檢測低限（LOQ）為0.1μg/g。由於Q-TOFMS具有高解析度，能進行精確測定而不降低靈敏度，因此本方法作為對貝類樣品中失憶性貝毒的確證分析方法具有高靈敏度和選擇性。2003年HollandPT等用LC-MS/MS的方法測定了貝類中軟骨藻酸和其異構體的含量，以甲醇/水（體積比為1：1）作為提取劑，以乙腈/水（體積比為1：1）作為稀釋劑，經SPE固相萃取後，用C18柱色譜分離。選用了4種不同的貝類，當軟骨藻酸在樣品中的含量為1μg/g貝-2μg/g貝時，軟骨藻酸的回收率為93%（RSD大於7%）。2007年PardoO等用甲醇/乙腈（體積比為9：1）作為提取劑，經PLE萃取後，通過電噴霧電離（ESI）界面與質譜聯用（ESI-MS-MS）分析測定軟骨藻酸。使軟骨藻酸在0.05-5μg/mL范圍內具有良好的線性關系，相關系數r=0.999；當方法檢出限為0.2μg/g，回收率為81%；當方法檢出限為0.5μg/g，回收率為95%。此方法成功應用於46個貝類樣品的檢測中。2007年WangZH採用離子碎片的方式，使用多反應器，以甲醇/水（體積比為1：1）作為提取劑，以乙腈/水（體積比為1：1）作為稀釋劑，用4mL0.15%甲酸洗脫，經SPE固相萃取後，用C18柱色譜分離，當檢測濃度為30pg/mL，使得回收率從90%提高到98%，建立了一種定量和定性的方法。

② 麻痹性貝類毒素是什麼

麻痹性貝類毒素是一種神經毒素，因人們誤食了含有此類毒素的貝類而產生麻痹性中毒的現象，所以稱之為麻痹性貝毒。

其毒理與河豚毒素（TTX）相似，主要是通過對鈉離子通道的影響而抑制神經的傳導。麻痹性貝毒在許多種不同的貝毒中毒事件屬最嚴重，因其強烈毒性，經常造成消費者中毒死亡事件，並且具有廣布性與高發性。

麻痹性貝類毒素的急救措施

PSP食物中毒很難診斷，一般診斷主要是依據進食史，即發病前攝入過可能含有PSP 的水產品，臨床症狀是以神經系統和神經機能支配紊亂為主要症狀，以及有很明顯的心臟血管的表現等綜合判斷，並且需要與抗膽鹼酯酶（如毒扁豆鹼）殺蟲劑中毒、河豚魚中毒等進行鑒別。

沒有特效的實驗室檢測方法來協助診斷，然而，可以收集中毒水產品的捕撈地水樣檢測有毒雙鞭甲藻及對可疑食物PSP 定量定性檢測來確定是否為麻痹性貝類中毒。

中毒早期可皮下注射鹽酸阿朴嗎啡5mg引吐，或洗胃後灌入2%碳酸氫鈉1L，口服活性碳吸附劑使毒素被吸附排出。對肌肉麻痹者可在急性期後給予士的寧2~3mg皮下或肌肉注射。一旦發現呼吸困難，必須立即實行人工呼吸、氣管插管或機械呼吸，及時供氧。

以上內容參考網路-麻痹性貝毒

③ 石房蛤毒素的檢測方法

在食品衛生和安全方面，隨著海洋環境的惡化，赤潮的大量發生，世界對貝毒的檢驗更加重視。美國從1925年就建立了貝毒監測制度，1958年以後，貝產地STX允許量為80μg/100g（相當於400MU/100g）。日本、加拿大等都有類似的規定。飲水中的STX及類似物含量健康警戒線為3μg/L。
生物檢測法包括：（1）生物毒性試驗法。小鼠生物法是AOAC推廣的檢測麻痹性貝類毒素的標准方法，是國際上都能接受的唯一的方法。該方法在檢測樣本總毒性方面相當成功，但是無法准確定性樣本中單個毒素。此外，還有家蠅生物分析法、蝗蟲生物分析法。上述3種生物分析技術原理相似。（2）細胞毒性試驗法。石房蛤毒素具有Na+通道阻滯劑的特性，可拮抗箭毒、藜蘆鹼的作用，以減少或「解救」細胞形態的改變及細胞裂解死亡，且該拮抗或「解救」作用與毒素的量呈對應關系。根據該對應關系可以計算出毒素的含量。早期建立的方法是用顯微鏡計數活細胞數以檢測PSP毒素的量，但試驗時間長，操作繁瑣，所需細胞量大。在該原理之上發展起來一種STX的快速診斷裝置MIST，已成功用於酸性粗毒中PSP總毒性的測定及STX、neoSTX、GTX和dcSTX相關毒性的測定，該裝置的靈敏度高，檢測迅速且無需組織培養的設備及專業知識。（3）免疫分析技術。隨著抗STX抗體的獲得，免疫分析技術如血球凝聚反應、放射免疫分析（RIA）和酶聯免疫分析（ELISA）等逐漸發展起來，其中直接競爭ELISA法是最常用的一種方法，檢測限可達3pg/ml，間接ELISA的檢測限也可達到10pg/ml。免疫方法靈敏度高，方便迅速，但抗體的獲得是其關鍵，各毒素的交叉反應低，不能完全體現樣品的毒性來源。（4）受體分析法。即固相受體結合法（solid-phase receptor binding assay），主要是根據PSP毒素能與Na+通道蛋白質結合的特點，應用同位素標記以檢測PSP類毒素的量，具有快速、可靠、准確的特點。Llewellyn等以一種特異結合STX的類似轉鐵蛋白Saxiphilin代替Na+通道蛋白質，其對STX的鑒定具有專一性，從而與TTX的鑒定相區別。
儀器測定法包括（1）HPLC法及其聯用技術。HPLC 法靈敏度高，專一性強，檢出限量低，分析時間短，能夠提供更多的毒素信息，是毒素檢測的主要手段。但石房蛤毒素分子本身的生色基團很微弱，不易被檢測，因而檢測前要將其氧化成熒光生色團，用熒光檢測器進行檢測。氧化手段主要有柱前氧化和柱後氧化，柱後氧化在分離柱後另加的一個柱上進行，簡化了操作步驟。隨著質譜技術的發展，液質聯用技術成為物質鑒定的一個強有力手段。（2）薄層色譜法（TLC）。TLC法是檢測PSP毒素的傳統方法之一，使用已較少。但新的檢測設備的出現為其發展提供了新的空間。I在層析柱上對STX及其同系物進行棒狀薄層層析分離，以火焰熱離子檢測器（FTID）進行檢測，結果STX的檢出限為5ng，其餘同系物的檢出限也均達到ng級。另外，氣相色譜、離子交換柱層析、電泳法等均是檢測STX毒素的傳統技術，方法優劣各異。 小鼠生物測定法（mouse bioassay，MBA）是在STX得到鑒定之前就已經研究出來的檢測方法，並且其它的檢測方法都以該方法作為參照。MBA用於檢測STX已經有很長的歷史，是AOAC於1958年確認的法定檢測方法。大部分國家依然在使用該方法。該方法技術上簡單易行且不需特殊設備。鼠類的神經細胞對STX的反應與人類神經細胞的反應一樣，因此，該方法的測定結果直接關繫到人類健康的風險評估。多數國家規定海洋貝類產品中STX可接受的最大含量為80μg STXeq/100g，墨西哥控制在30μg STXeq/100g，菲律賓控制在40μg STX eq/100g。但也有人認為80μg STXeq/100g的檢測限可以保證人類的健康不受威脅。這類毒素在飲用水中的含量規定也不同。1999年研究人員等通過實驗計算出了飲用水中PSTs可接受的最大含量為3μg STXeq/L。後來，澳大利亞將這個濃度應用到了飲用水標准中，巴西將其定為強制性的法規標准，紐西蘭將這個濃度定為飲用水中可接受的最大含量。但是，MBA對該濃度的敏感度不夠，樣品不經過濃縮很難檢測出來。MBA的最低檢測限為40μg STXeq/100g，相當於0.2μg/mLSTX，或200μg/L STX。因此，盡管MBA一直被廣泛應用於檢測經生物富集作用而STX含量高的海產品中，卻不適用於飲用水中STX含量的檢測，同時無法准確定性樣本中單個毒素，而且實驗動物檢測方法在某些地區已經被禁止。針對存在的這些問題，逐漸研究出一些新的檢測貝毒的方法，如化學、生物化學、毒性測定等方法，同時也可用於檢測淡水藍藻和被污染的水源。
運用細胞生物測定法來檢測PSTs含量的方法已經建立，並且可以代替MBA進行毒性檢測，該方法專門用於檢測像STX這類可以阻斷電壓門控Na+通道的毒素。神經瘤細胞測定是在神經細胞內的Na+通道水平上檢測PSTs。STX是一種Na+通道阻斷劑，其功能是可以通過與打開鈉通道的藜蘆定的拮抗作用檢測出來。最初建立的細胞生物測定法是通過鼠神經母細胞瘤的形態學作為端點來評估測定結果，隨後Jellet和Manger對這種方法進行了改進，採用色度法顯示有更好的選擇性。因此，如果實驗室能承擔得起基於MS的檢測方法的儀器費用，那麼這種檢測方法在將來很可能會代替STX的色譜分析。 通過末點來測定細胞的活力，從而使其更便於自動控制。在這種測定方法中，神經瘤細胞培養於96孔細胞培養板中，用Na+通道激活劑藜蘆定處理，增強Na+以及Na+/K+-ATP酶抑制劑烏本甙的內流，從而阻斷Na+外流。在PSTs的存在下，通過使用MTT（3-[4，5-二苯基-2羥基]-2，5-二苯基四唑來測定細胞活力。通過使用標准量的藜蘆定和烏本甙，細胞受保護的程度可以通過與PSTs的標准量對比，以此來定量PSTs的總量，然後結果轉換成STX當量。鼠和人的成神經瘤細胞都可以用於該測定方法。
Saxiphilin是一種結構與轉鐵蛋白相似的蛋白，研究表明，其與PSTs有很高的親和力。然而，不同的Saxiphilin對不同的類似物有不同的親和力。到為止，從熱帶蜈蚣（Ethmostigmus rubripes）體內分離的Saxiphilin在試驗中有最小的選擇性。利用這一特性，Llewellyn LE等建立了檢測PSTs的特異受體法，該方法的檢測限為6.3μg STXeq/L，或1.3μg STXeq/100g貝肉。但研究人員聲明，在沒有額外的基質干擾下，如果增大樣本容量，該方法的檢測限會降低。從熱帶蜈蚣體內提取粗Saxiphilin的程序很簡單，制備的產物很穩定，可以反復凍融，在-80℃下可以保存一年以上。編碼Saxiphilin蛋白的基因克隆，以及文庫的構建已經完成，可以通過真核表達系統表達該蛋白，並且得到的表達產物具有生物活性。更進一步的研究證明，同時採用SCBA 和Saxiphilin受體檢測法檢測介蟲和貝類體內的非PSTs鈉離子通道活性，其實用性很好，因為非PSTs如河魨毒素（TTX）不與Saxiphilin結合，而且檢測結果與HPLC和MBA的結果有很好的相關性。
該方法最初是用來監測貝類和魚類產品中的海洋毒素，並且在檢測海洋神經毒素類方面得到了很好的驗證。其他的研究人員也運用此法檢測在淡水藍藻細菌中占優勢的PSTs的衍生物，進一步對該法進行了的驗證。研究表明，神經細胞瘤生物測定法得出的結果與鼠生物法測定的結果很接近（相關系數R2=0.96），而且有敏感性更高的的優點，其檢測限為10ng STXeq/mL提取物（相當於2.0μg STXeq/100g 貝肉）。通過細胞生物測定法獲得的結果與色譜法得到的結果也有很好的相關性。然而，生物測定法有其獨特的優點，即對任何可以抑制Na+通道的毒素，無論是已知的PSTs類似物，還是未知的變異體，都有很好的敏感性。正如Humpage 等所描述，該測定方法可以檢測未定性的、不能被色譜法檢測出來的很多毒素。細胞生物測定法不能區分相似的毒素，只能提供一個所有毒素的累積效應值，因此與MBA相比，在細胞培養測定中該方法很難確定相關毒素類似物的毒性反應，除非將每個類似物進行單個的分析。然而，Llewellyn等提供的相關數據表明，當使用復雜的PSTs混合物時，細胞生物測定法與MBA相比是一個很好的毒性預測器。Llewellyn等還同時使用MBA、細胞培養測定、HPLC和放射性受體測定對含有復雜的PSTs的21種貝肉提取物進行了分析，在這四種檢測技術中，與MBA相關的細胞培養測定法的測定結果與預期的毒性最接近。但是，細胞生物測定法依然存在一些缺點。首先，由於該方法依賴藜蘆定和烏本甙的拮抗作用，必須使用適當的濃聚物以使其與PSTs反應敏感。正如Jellet等所討論的，任何毒素濃聚物濃度的改變都會降低該方法對PSTs檢測的敏感性。其次，該方法的標准檢測裝置運行慢，需要很長的細胞孵育時間（24-48 h），才能對成神經瘤細胞形成細胞毒性作用。 HPLC 被廣泛用於有機化合物的分離，同時也是第一種用於檢測PSTs的儀器分析方法。然而，該技術也存在一些缺點，首先需要毒素標准品作參照，其次缺少用來制備熒光產物的光反應酶或後置柱衍生物化法的載色體，尤其是在樣品制備過程中PSTs可能會發生化學轉化。這種轉化經常會使低毒的毒素變成毒性強的毒素，導致無法確定原始樣品中毒素的真實毒性。因此，毒素的變異促使檢測方法也不斷發展，促進更精確的抽提和分離方法的發展。最早的STX理化檢測方法是由Bates和Rapoport提出的，由於缺乏STX的載色體，這種方法只能在鹼性環境下，將STX用過氧化氫氧化成熒光化合物以達到檢測的目的。那時，人們認為這種方法的敏感度比鼠生物法的要高，並且建議用這種方法來進行貝類樣品的常規檢測。然而，這種方法操作很復雜，使用好幾種溶劑和10步以上的化學過程。他們對這種方法進行了改進，增加了精確度和可重復性，但這種方法的操作依然很復雜。
在20世紀80年代，許多研究機構使用諸如X射線衍射、薄層色譜-熒光檢測、高速液相色譜（HSLC）等方法發現了新的化合物。1975年，Shimizu等第一次描述了gTX1、GTX2、和gTX3的存在。使用葡聚糖凝膠g或生物膠P-2聚丙烯醯胺凝膠柱，通過稀乙酸洗脫，從gTX成分里分離出了STX，然後使用HSLC將gTX的峰值分解成三種不同的毒素。1987年，Oshima和他的合作者開發了一種後置柱氧化法，該方法可以詳細地分析天然甲藻、水華、貽貝、牡蠣等抽提物中所含的PSTs。與Oshima的後置柱氧化法相反，Lawrence等研製了使用前置柱氧化的液相色譜法，來產生帶熒光的PSTs衍生物。他們證明，使用過氧化氫氧化對分析非羥基化毒素的敏感性更強，而高碘酸鹽氧化作用對分析羥基化毒素的敏感性更強。在這一時期，他們改進了這種技術，例如向高碘酸鹽氧化劑中添加了銨甲酸鹽，從而改善了neoSTX、GTX1、B2和C3的分析結果，而且由於添加了這種化合物到流動相，使neoSTX和B2的色譜分析更好。由於在檢測過程中，pH對檢測結果的影響很大，研究人員在檢測過程中對pH進行了控制。Gago-Martinez等使用前置柱方法時，分別將高碘酸鹽和過氧化物氧化過程的pH調節到7.2-12和8.2-12.8，最後得到的熒光氧化產物的產量不同。當pH在8.2時，通過高碘酸鹽氧化作用neoSTX的產量達到了最大，而pH在10-11.5時，STX、GTX2/3、dcSTX和gTX5的產量也都達到了最大。Lawrence等聲明採用柱前氧化pH很容易控制，因此結果的可重復性更強，因為在後置柱氧化時pH變化很小，相應對標記上熒光的產物的產量影響很小。然而，盡管柱前方法相對比較簡單，但是一些PSTs形成了相同的氧化產物，另外一些形成了不只一種熒光產物。這種方法被建議作為一種篩選方法來為監測程序服務。最初的提議是首先使用高碘酸鹽氧化方法，當檢測出大多數PSTs，並且毒素濃度超過常規檢測限80μg STXeq/100g時，接著採用過氧化氫氧化。色譜氧化法已經用於檢測貝類中的毒素，研究PSTs在不同地區鼠腦的分布，他們認為這種方法很合適，敏感度也很高，因此該方法已被歐洲國家確定為檢測PSTs的官方檢測方法之一。然而，Ben-Gigirey等進行了實驗室研究，推斷盡管該方法適合於檢測研究，但對含有更復雜毒素的樣品進行分析時，得到的結果不理想，並且也不是對所有的PSTs都有效。此外，該法只是針對STX、GTX2/3、dcSTX、dcGTX2/3等毒素類似物，可以得到滿意的檢測結果。Turner等使用該標准對Lawrence的方法進行了進一步的驗證，主要包括其選擇性、線性、檢測限、准確性、回收率、精確度、可重復性、適用性，同時也包括添加dcNeoSTX、dcGTX2/3等PSTs。Turner等對該方法進行了改進，以增加氧化產物的穩定性，改善了固相離子交換的純度，最終推斷該方法可以得到滿意的結果。
液相色譜-質譜聯用法（Liquid chromatography–mass spectrometry，LC-MS）是一種有效的檢測技術，可以用來鑒定未知的化合物，定量已知的物質，闡明新分子的化學性質和結構，實現檢測的高敏感度、可選擇性、精確定量和高通量。然而，LC-MS價格昂貴，需要有專業知識的技術人員操作和維護。盡管如此，Quilliam建議將LC-MS檢測方法作為檢測海洋毒素的普遍方法。MS檢測PSTs面臨的挑戰之一是離子配對劑對目標化合物的離子化產生干擾，因此離子配對劑要對PSTs有高效的反相色譜。因此，Jaime等研製了一種色譜方法，該方法使用基於非離子配對洗脫和後置柱電化學氧化的陰陽離子串聯交換柱。Dell』Aversano等開發了一種實用的親水性液相色譜法，該方法不僅可以分離主要的PSTs，而且還可以分離藍藻細菌中的甲醛類毒素、柱孢藻毒素等。採用該方法，在質譜儀運行選擇性反應監控程序時，檢測出了15種PSTs，並鑒定出了新的毒素類似物。Diener及其合作者使用兩性離子親水作用色譜法分別與MS和熒光檢測聯用，在單個梯度下來檢測PSTs，他們推斷這兩種方法都可以得到可靠的定量結果，能夠很好的分離更多相關的PSTs。這兩種檢測方法的檢測限只有微小的不同，熒光檢測儀有更好的敏感性，而MS檢測儀在更短的運行時receptor-binding assay，RBA）、免疫學分析技術等。隨著科學技術的發展，又出現了一些新的研究方法應用於檢測STX及其類似物，例如生物感測器法、色譜-質譜連用法、熒光定量PCR等方法。 由於ELISA方法具有敏感、快速、操作簡便的優點，已經廣泛用於檢測中，尤其是醫學和食品檢測領域。該技術所面臨的挑戰是檢測像PSTs這樣的多種相關化合物的混合物時，需要保持其識別靶物質結構多樣性的能力，同時忽略復雜的基質中其它化合物的影響，對此Usleber等概述了建立抗體檢測技術的研究進展。研究顯示，抗STX的抗體與neoSTX有很弱的交叉反應，而且這種選擇性可以應用於該家族的所有類似物。Chu 等研究發現基於抗STX抗體和抗neoSTX抗體的測定之間有很弱的相關關系，結合這兩種測定結果，檢出率雖然得到了改善，但是依然不高，只有MBA的80-85%，陽性結果較低。Kawatsu等建立了針對gTX2/3的單克隆抗體，以完善先前建立的針對STX和neoSTX的抗體。該抗體保持著與STX/neoSTX家族其它抗體的差別，但是和gTX2/3、dcGTX2/3、C1/2有著很相似的親和力。Garthwaite等對多重檢測方法進行了深入的研究，並建議使用一整套的ELISA，不僅檢測貝類樣品中的PSTs，也檢測遺忘性貝類毒素、腹瀉性貝類毒素和神經毒性貝類毒素。熒光定量PCR法Al-Tebrineh J等建立了一種SYBRgreen的特殊定量PCR 方法，來定量檢測魚腥藻屬藍藻細菌產生的STX。該方法主要是通過確定藍藻細菌中已鑒定的STX基因簇中獨特的多聚乙醯序列拷貝數來推斷樣品產毒性的能力。Al-Tebrineh J等使用這種方法檢測了從澳大利亞不同地方的湖泊、水庫、河流中採集的水樣，通過HPLC和顯微細胞計數確定了水華中STX的富集和藍藻細菌細胞密度。通過實驗證實，STX富集確實與STX基因拷貝數相關，這就表示後者可以作為一種測量魚腥藻屬和其它水華藍藻細菌的產毒潛能的方法。定量PCR 方法的靶向STX基因也可以用於水華魚腥藻屬和其它幾種藍藻細菌產STX的能力的監測和生態生理學研究。

④ 關於蛤蚌毒素的一些資料

一種麻痹性貝毒素， 貝類毒素的一類統稱。（蛤蚌毒素資料只有一些結構圖，貝類毒素的參考資料如下：）

貝類毒素
生物學名稱：
貝類中毒是由一些浮游藻類合成的多種毒素而引起的，這些藻類（在大多數病例中為腰鞭毛蟲，可引起赤潮）是貝類的食物。這些毒素在貝類中蓄積，有時被代謝。其中有20種毒素可引起麻痹性貝類中毒（PSP），它們都是蛤蚌毒素的衍生物。而腹瀉性貝類中毒（DSP）則大概是由一組高分子量的聚醚引起，這些聚醚包括岡田酸，甲藻毒素，pettenotoxins，和yessotoxin。而一類叫做短菌毒素的聚醚可引起神經毒性貝類中毒（NSP）。失憶性貝類中毒（ASP）是由特殊的氨基酸、軟骨藻酸引起，它們是貝類污染物。
疾病名稱：
貝類中毒的類型：麻痹性貝類中毒（PSP）、腹瀉性貝類中毒（DSP）、神經毒性貝類中毒（NSP）、失憶性貝類中毒（ASP）。
疾病特徵：
食用了被污染的貝類可以產生各種症狀，這取決於毒素的種類、它們在貝類中的濃度、和食用被污染貝類的量。在麻痹性貝類中毒的病例中，臨床表現多為神經性的，包括麻刺感，燒灼感，麻木，嗜睡，語無倫次，和呼吸麻痹。而DSP，NSP和ASP的症狀更加不典型。DSP一般表現為較輕微的胃腸道紊亂，如惡心、嘔吐、腹瀉、和腹痛並伴有寒戰、頭痛和發熱。NSP既有胃腸道症狀又有神經症狀，包括麻刺感和口唇、舌頭、喉部麻木，肌肉痛，眩暈，冷熱感覺顛倒，腹瀉，和嘔吐。ASP表現為胃腸道紊亂（嘔吐，腹瀉，腹痛）和神經系統症狀（辨物不清，記憶喪失，方向知覺的喪失，癲癇發作，昏迷）。
引起疾病的相關食物：
所有的貝類（濾食性軟體動物）都有潛在的毒性 。但是，PSP一般與貽貝(海虹)、蛤蜊、扇貝、和干貝有關；NSP與從佛羅里達海岸和墨西哥灣捕撈的貝類有關；DSP與貽貝(海虹)、牡蠣、和干貝有關，而ASP與貽貝(海虹)有關。
發病率：
因為對貝類中毒的發生及其嚴重性沒有比較好的統計學資料，所以沒有辦法得到這類疾病的真正發病率。貝類中毒的病例常常被誤診為其它疾病，而且一般很少被報告。在貝類中毒的四種類型中，從公共衛生的角度來看，最嚴重的是PSP。過去，PSP毒素的強烈毒性已導致了非常高的死亡率。
並發症：
PSP：中毒症狀進展相當快，在攝入貝類0.5到2小時內即可發生，這主要取決於攝入毒素的量。在嚴重的病例中，呼吸麻痹很常見，如果沒有提供呼吸支持就可能發生死亡。如果在中毒後12小時內應用呼吸支持，病人常常可以完全恢復，而沒有持久的副作用。對於特殊病例，由於這種毒素有弱的降低血壓作用，即使有呼吸支持，仍然可能因為心血管衰竭而發生死亡。
NSP：這類中毒在攝入貝類後幾分鍾到幾個小時內發生；持續時間相當短，從幾個小時到數天。恢復完全幾乎沒有後遺症；尚無死亡的報告。
DSP：這類中毒的發生取決於攝入毒素的劑量，在攝入貝類後少則30分鍾到兩三個小時內即可發生，疾病症狀持續2到3天。恢復完全無後遺症；這種疾病一般沒有生命危險。
ASP：這類中毒以在24小時內出現胃腸道症狀為特徵；神經症狀發生在48小時以內。在老年人中，中毒症狀特別嚴重，可有阿爾齊默病的症狀。迄今為止，所有死亡均發生在老年病人中。

⑤ 貝類毒素有哪些

貝類通過濾食有毒微藻（主要是藻黃素），經過生物累積和放大轉化為有機毒素，即貝毒。貝類毒素主要分為腹瀉性貝毒、麻痹性貝毒、神經性貝毒和記憶缺損性貝毒四類。腹瀉性貝毒（DSP）是由海洋藻類產生，大量存在於軟體貝類中的一種毒素，被攝食後，主要症狀是腹瀉；麻痹性貝毒（PSP）主要產自海洋中的單細胞甲藻，目前已經分離出20種毒素，毒理作用是神經肌肉麻痹劑，阻斷細胞鈉離子通道，造成神經系統傳輸障礙而產生麻痹作用；神經性貝毒（NSP）主要是因貝類攝食短裸甲藻後在體內蓄積，被人類食用後產生以神經麻痹為主要特徵的中毒；記憶缺損性貝毒（ASP）引起中毒的成分是軟骨藻酸（DA），它是一種強烈的神經毒性非蛋白氨基酸，能導致短期記憶功能長久損害。

⑥ 腹瀉性貝毒的檢測方法

因為DSP是一種潛在的毒物，在貝類中含量很少，因此測定方法需要十分靈敏可靠.在大多數可疑貝樣中OA是DSP的主要成分，所以檢測方法也主要集中在OA上.主要的檢測方法有：腹瀉性貝毒的分析方法主要包括小白鼠生物試驗法、免疫分析（Immunoassays）、高效液相色譜（High-performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜－質譜聯用（Liquidchromatography-massspectrometry，LC/MS）等。 N.Bouaicha首先用毛細管膠束電動電泳，紫外檢測器檢測貽貝中的OA與DTX-2，但由於緩沖液等問題，效果不是十分理想。

⑦ 貝類中毒的處理方法是什麼

有些貝類，由於攝食有毒的藻類而具有毒性，常見的有蛤貝、扇貝、牡蠣等。人食用此種貝類引起中毒時，主要表現為麻痹，故又稱為麻痹性貝類中毒。有毒貝類所含的毒素稱為石房蛤毒素，人經口食入的致死純品量為O.54~O.9毫克。

症狀表現：

貝類中毒潛伏期為數分鍾至2O分鍾，開始為運動感覺障礙，唇、舌和指尖麻木，繼而腿、臂和頸部麻木刺痛，手足有蟻行感，心悸，痙攣，腓腸肌疼痛，消化道症狀有腹痛、便秘、惡心、嘔吐，並可有發燒、喉頭水腫、呼吸困難，嚴重者常在2~12小時死亡。

救治措施：

一旦發現中毒，應立即催吐，使塊狀貝類食物吐出；用5%碳酸氫鈉溶液洗胃，並留置2O%葯用碳懸液5O毫升於胃中吸附毒素，亦可導瀉。

目前對麻痹性貝類中毒尚無有效的解毒劑，對症處置有一定的作用。如病情危重，應盡快請有經驗的醫生搶救。

⑧ 貝類毒素的檢驗方法

1 小鼠生物檢測法
小鼠檢測法是應用最多的貝類毒素檢測方法，可用於所有貝類毒素的檢測。該方法的優點是技術容易掌握，不需要使用專門儀器。小鼠生物檢驗法是將貝類毒素的提取物進行適當的稀釋後，對小白鼠進行腹腔注射，並計算平均致死時間。根據Sommer表，查出相應的MU(給小白鼠腹腔注射毒素的系列稀釋液，然後計算每隻20g小白鼠的劑量作為1個死亡時間，以15min內殺死1隻鼠單位<Mouse unit，MU>來表示毒性的大小，換算成MU/100g貝肉)。
小鼠生物測定法已被AOAC(美國公職分析家協會)作為國際海產品貿易中貝類麻痹性毒素的測定方法。但該方法的缺點是由於小鼠的大小以及小鼠個體情況的不同，因此造成靈敏度不高，偏差較大。而且存在實驗小鼠用量大以及哺乳動物費用增加的缺陷。同時操作繁瑣，以及用該法測定高毒性貝類樣品時的變異性較高的缺陷[13]。因此需要一種新的測定方法來彌補小鼠檢測法的不足。
2 高效液相色譜法
採用高效液相色譜(HPLC)等化學檢測法測定貝類毒素發展很快。HPLC法主要應用於PSP， DSP和ASP的檢驗上[6]。與其它方法相比，HPLC法有著明顯的優越性：(1)靈敏度高，專一性強，檢出限低；(2)在酸性條件下不穩定的基團如氨甲醯基N)磺基在分析的過程中不會解離；(3)縮短了分析時間，通過自動注射技術，能處理更多的樣品，便於進行毒素監控；(4)能提供關於毒素的更多信息，能測出每1個組分的具體含量及毒性的大小，從而有助於比較或了解毒素種類的差異。
HPLC法是唯一能定性、定量檢測出各種毒素組分的技術，HPLC法發展非常迅速並極有可能代替小鼠檢測法成為主要的檢測方法。該法也存在一些如測定時需要昂貴的儀器、專業知識和費時等缺點。
3 免疫學測定方法
免疫學測定方法以抗原一抗體特異性反應為基礎，其中包括凝集反應、沉澱反應、補體反應等。可用於PSP，DSP和NSP的檢測，其原理是將兔子等實驗動物暴露在毒素中，以功能性抗原刺激兔子產生抗體，然後從兔子的血清中提取抗體。抗體可用放射性或熒光物質標記。提取的貝類毒素或勻漿後的貝類組織(如貽貝)暴露於標記物中，然後檢測抗血清一抗原混合物中放射性或熒光強度以測定樣品中的毒素的含量。
4 細胞檢驗法
細胞檢測法是建立在貝類毒素對生物細胞影響的基礎上。許多實驗已證明麻痹性貝類毒素的致病機理是通過對細胞鈉通道的阻斷，造成神經系統傳輸障礙而產生麻痹作用。
其實驗原理如下：當加入烏本苷這種物質時，可增加鈉的流入，此時小鼠的成神經細胞瘤擴張並最後溶解暴露在藜蘆丁中。但在麻痹性貝類毒素存在時，這兩種物質的作用可得到抑制，麻痹性貝類毒素通過對細胞鈉通道的阻斷，可使細胞形態保持完整。與麻痹性類毒素不同，腹瀉性貝類毒素的細胞檢驗法是建立在肝細胞形態的變化基礎上的。
5 其它檢測方法
其它檢測方法包括分光光度法，電泳法(最常用的是毛細管電泳，主要用於分離測定PSP毒素中的非衍生毒素)，薄層色譜法和氣相色譜法(用來檢驗軟海綿酸)等化學檢驗法，此外，還包括家蠅生物檢驗法，蝗蟲生物檢驗法，神經細胞生物檢驗法(又稱組織培養分析法，可用於PSP，ASP和DSP的分析的新方法)等生物檢驗法。