基因工程常用緩沖體系及配置方法

1. TE緩沖液的配製方法

配製方法：量取下列溶液於500ml燒杯中

1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml

0.5M EDTA PH=8.0 1ml

向燒杯中加入約400mldd H2O均勻混合；將溶液定容到500ml後，高溫高壓滅菌；室溫保存.

1×TE Buffer

組成濃度：10mMTris-HCl1mM EDTA PH=8.0

配製量：500ml

(1)基因工程常用緩沖體系及配置方法擴展閱讀

TE緩沖溶液（Tris-EDTA buffer solution）

在生化研究工作中，常常要用到緩沖溶液來維持實驗體系的酸鹼度。研究工作的溶液體系pH值的變化往往直接影響到我們工作的成效。如果提取酶實驗體系的pH值變化或變化過大，會使酶活性下降甚至完全失活。所以我們要學會配製緩沖溶液。

由弱酸及其鹽組合一起使具有緩沖作用。生化實驗室常常用的緩沖系主要有磷酸、檸檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羥甲基氨基甲烷）等系統，在生化實驗或研究工作中要慎重地選擇緩沖體系，因為有時影響實驗結果的因素並不是緩沖液的pH值，而是緩沖液中的某種離子。如硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽和三羥甲基甲烷等緩沖劑都可能產生不需要的反應。

硼酸鹽：硼酸鹽與許多化合物形成復鹽、如蔗糖。

檸檬酸鹽：檸檬酸鹽離子容易與鈣結合，所以存在有鈣離子的情況下不能使用。

磷酸鹽：在有些實驗，它是酶的抑止劑或甚至是一個代謝物，重金屬易以磷酸鹽的形式從溶液中沉澱出來。而且它在pH7.5以上時緩沖能力很小。

三羥甲基氨基甲烷：它可以和重金屬一起作用，但在有些系統中也起抑止的作用。其主要缺點時溫度效應。這點往往被忽視，在室溫pH是7.8的Tris一緩沖液，在4℃時是8.4，在37℃時是7.4，因此，4℃配製的緩沖液拿到37℃測量時，其氫離子濃度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，緩沖能力差。

2. 配製緩沖溶液常用什麼方法

配製緩沖溶液常用方法有：
1、根據所需求的酸鹼性選擇合適的緩沖對，若是配製酸性緩沖液就選擇弱酸與弱酸鹽緩沖對；若是配製鹼性緩沖液就選擇弱鹼與弱鹼鹽緩沖對。
2、根據所需要控制的PH范圍以及弱酸和弱鹼的解離常數（pKa/pKb）選擇具體的共軛酸鹼對，公式為PH＝pKa±1＝（14-pKb）±1。
3、根據公式計算緩沖溶液的組分比，酸性緩沖液PH＝pKa－lgc酸/c鹽，鹼性緩沖液PH＝14-pKb+lgc鹼/c鹽。
4、根據共軛酸鹼對以及其組分比配製緩沖液，方法同普通溶液。
舉例：試配製一種緩沖液，體積為1L，PH能維持在10.25左右。
a、依題意選擇弱鹼與弱鹼鹽的共軛對；
b、由PH＝（14-pKb）±1，算出pKb在3.75與4.75之間，查弱鹼的解離常數表可知氨水（pKb=4.75）符合要求，故可選擇NH3-NH4Cl體系；
c、由PH＝14-pKb+lgc鹼/c鹽，算出c(氨水)/c(氯化銨)＝10；
d、設氨水的濃度為10mol/L，則氯化銨的濃度為1mol/L，所以在濃度為10mol/L體積為1L的氨水中加入1mol的氯化銨即可。

3. 簡述基因工程四大要素的作用及基因工程操作步驟

目的基因、運載體、工具酶、受體細胞
步驟：基本操作步驟
1.獲取目的基因是實施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒
抗細菌）基因，種子的貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因干擾素基因等，都是目的基因。
要從浩瀚的「基因海洋」中獲得特定的目的基因，是十分不易的。科學家們經過不懈地探索，想出了許多辦法，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。
直接分離基因最常用的方法是「鳥槍法」，又叫「散彈射擊法」。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然後通過運載體分別轉入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（在遺傳學中叫做擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。
用鳥槍法獲得目的基因的優點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。又由於真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉錄成的信使RNA為模版，反轉錄成互補的單鏈DNA，然後在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據已知的蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然後按照鹼基互補配對的原則，推測出它的基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。
2.基因表達載體的構建（即目的基因與運載體結合）是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同來源的DNA重新組合的過程。如果以質粒作為運載體，首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。然後用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端。將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，質粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會因鹼基互補配對而結合，形成一個重組DNA分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質粒DNA分子結合，形成重組DNA分子（也叫重組質粒）的。
3.將目的基因導入受體細胞是實施基因工程的第三步。目的基因的片段與運載體在生物體外連接形成重組DNA分子後，下一步是將重組DNA分子引入受體細胞中進行擴增。
基因工程中常用的受體細胞有大腸桿菌，枯草桿菌，土壤農桿菌，酵母菌和動植物細胞等。
用人工方法使體外重組的DNA分子轉移到受體細胞，主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。例如，如果運載體是質粒，受體細胞是細菌，一般是將細菌用氯化鈣處理，以增大細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞。目的基因導入受體細胞後，就可以隨著受體細胞的繁殖而復制，由於細菌的繁殖速度非常快，在很短的時間內就能夠獲得大量的目的基因。
4.目的基因導入受體細胞後，是否可以穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。這是基因工程的第四步工作。
望採納，謝謝

4. 怎麼配製標准緩沖溶液

1、只要知道緩沖對的PH值，和要配製的緩沖液的pH值（及要求的緩沖液總濃度），就能按公式計算鹽和酸的量。總結出pH值與緩沖液對離子用量的關系並列出了表格。只要知道要配製的緩沖液的pH，經查表便可計算出所用緩沖劑的比例和用量。

2、例如配製pH5.8濃度為0.1摩爾/升的磷酸緩沖液。

3、經查表知pH5.8濃度為0.2摩爾的Na2HPO48.0毫升，而92.0毫升的0.2摩爾Na2HPO4。依此可推論出配製100ml0.1摩爾的磷酸緩沖液需要8.0毫升0.1摩爾的Na2HPO4，而0.1摩爾的Na2HPO4需要92.0毫升。

4、計算好後，按計算結果准確稱好固態化學成分，放於燒杯中，加少量蒸餾水溶解，轉移入50ml容量瓶，加蒸餾水至刻度，搖勻，就能得到所需的緩沖液。

5、各種緩沖溶液的配製，均按表格按比例混合，某些試劑，必須標定配成准確濃度才能進行，如醋酸、氫氧化鈉等。另外，所有緩沖溶劑的配製計量都能從以上的算式准確獲得。

(4)基因工程常用緩沖體系及配置方法擴展閱讀：

緩沖體系：

一、常用作緩沖溶液的酸類由弱酸及其共軛酸鹽組合成的溶液具有緩沖作用。

二、常見的緩沖體系有：

1、弱酸和它的鹽（如H2CO3---Na2CO3）

2、弱鹼和它的鹽（NH3·H2O---NH4Cl）

3、多元弱酸的酸式鹽及其對應的次級鹽（如NaH2PO4---Na2HPO4）的水溶液組成。

三、生化實驗室常用的緩沖系主要有磷酸、檸檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羥甲基氨基甲烷）等系統，生化實驗或研究工作中要慎重地選擇緩沖體系，因為有時影響實驗結果的因素並不是緩沖液的pH值，而是緩沖液中的某種離子。

1、硼酸鹽：硼酸鹽與許多化合物形成復鹽、如蔗糖。

2、檸檬酸鹽：檸檬酸鹽離子容易與鈣結合，所以存在有鈣離子的情況下不能使用。

3、磷酸鹽：在有些實驗，它是酶的抑止劑或甚至是一個代謝物，重金屬易以磷酸鹽的形式從溶液中沉澱出來。而且它在pH7.5以上時緩沖能力很小。

4、三羥甲基氨基甲烷：它可以和重金屬一起作用，但在有些系統中也起抑製作用。其主要缺點時溫度效應。在室溫pH是7.8的Tris緩沖液，4℃時是8.4，37℃時是7.4，因此，4℃配製的緩沖液在37℃進行測量時，其氫離子濃度就增加了10倍。在pH7.5以下，其緩沖能力極為不理想。

5. 簡要分析基因的表達系統的組成及優化策略。

原核表達系統 表達調控方式 組成型,誘導型 表達產物定位 分泌型,不分泌型(細胞內,細胞膜,周質空間) 產物純化方式 是否融合蛋白,是否一步親和純化 產物溶解狀況 可溶,包含體,分泌型
在各種表達系統中，最早被採用進行研究的是原核表達系統，這也是目前掌握最為成熟的表達系統。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質粒)轉化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導並最終純化獲得所需的目的蛋白。其優點在於能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統無法對表達時間及表達水平進行調控，有些基因的持續表達可能會對宿主細胞產生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產物純化困難；而且原核表達系統翻譯後加工修飾體系不完善，表達產物的生物活性較低
為克服上述不足，許多學者將原核基因調控系統引入真核基因調控領域，其優點是
①根據原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設計，而靶DNA與真核基因調控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制
②能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統所不及；
③能嚴格調控基因表達，即不僅可控制基因表達的「開關」，還可人為地調控基因表達量
因此，利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞表達系統。

2RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。
RT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。。RT-PCR用於對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易於操作。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然後取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一隻管中順次進行。
逆轉錄酶（reverse transcriptase）是存在於RNA病毒體內的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：

1、 依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈

2、 Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA

3、 依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA

用於反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對於短的不具有發卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。

實驗方法如下
http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR

3 質粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質粒常被用做基因的載體。許多細菌除了染色體外，還有大量很小的環狀DNA分子，這就是質粒(plasmid)（補充：部分質粒為RNA）。質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環素抗性基因或卡那黴素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離於染色體外的DNA分子。
目前，已發現有質粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質粒的相對分子質量一般較小，約為細菌染色體的0.5%～3%。根據相對分子質量的大小，大致上可以把質粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質量是40×106以上，較小一類的相對分子質量是10×106以下(少數質粒的相對分子質量介於兩者之間)。每個細胞中的質粒數主要決定於質粒本身的復制特性。按照復制性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內只有1～2個質粒；另一類是鬆弛型質粒，當染色體復制停止後仍然能繼續復制，每一個細胞內一般有20個左右質粒。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型。分子量較小的質粒屬鬆弛型。質粒的復制有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸桿菌內的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內則屬鬆弛型。
在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。人工構建的質粒可以集多種有用的特徵於一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐葯性等。常用的人工質粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環素基因(Tcr)和抗氨苄青黴素基因(Apr)，並含有5種內切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點，就會使抗四環素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨苄青黴素，但對四環素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨苄青黴素又抗四環素，而沒有pBR322質粒的細菌將對氨苄青黴素和四環素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨苄青黴素基因和PstI切點。質粒運載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千鹼基對)。

4 基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達功能是否正常，從而達到診斷疾病的一種方法。它是繼形態學、生物化學和免疫學診斷之後的第四代診斷技術，它的誕生與發展得益於分子生物學理論和技術的迅速發展。

常用基因診斷技術：
一、Southern印跡法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束後，經過80℃烘烤的DNA，將原位地固定於膜上。
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定於膜上的單鏈基因DNA分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。

二、聚合酶鏈反應

近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。

三、擴增片段長度多態性

小衛星DNA和微衛星DNA的長度多態性可以通過PCR擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析.

四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法

當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來.

PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。

五、單鏈構象多態性診斷法

單鏈構象多態性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用於DNA中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。

6. 基因工程研究中需要哪幾類酶,這些酶各有什麼作用 具體一些

用於基因工程的工具酶
一,限制性內切酶(Endonucleosase)
(一)限制性內切酶(Endonucleosase)的發現與分類
1) 50年代初發現細菌能將外來DNA片段在某些專一位點上切斷,從而保證其不為外來噬菌體所感染,而其自身的染色體DNA由於被一種特殊的酶所修飾而得以保護,這種現象叫做限制-修飾,它們由三個基因位點所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年後,人們搞清了細菌的限制與修飾分子機理:
hsd R---限制性內切酶
hsd M---限制性甲基化酶
hsd S---控制兩個系統的表達
1968年Smith等人從流感嗜血桿菌株中分離出兩個類內切酶,Hind II和Hind III,為基因工程技術的誕生奠定了基礎.
截止到目前為止,已經分離出400餘種II類酶,搞清識別位點的有300種,商品化的約有一百種,而實驗室常用的有二十種 .
2)限制性核酸內切酶可分為三大類:
I類 能識別專一的核苷酸順序,並在識別點附近切割雙鏈,但切割序列沒有專一性.
II類 識別位點(迴文序列)嚴格專一,並在識別位點內將雙鏈切斷
III類 識別位點嚴格專一(不是迴文序列),但切點不專一,往往不在識別位點內部.
因此在基因工程中具有實用價值的是II類限制性內切酶.
(二)II類限制性內切酶的命名及特性
命名原則:取屬名的第一個字母大寫,取種名的前兩個字母小寫,構成基本名稱.該種中發現的不同的酶按照順序編號I, II, III等.如存在變種和品系,取變種或品系的一個字母.若酶存在於質粒上,則需大寫字母表示非染色體遺傳因子.
如,HindIII從Haemophilus Influenzue d株中分離的第三個酶.EcoRI表示基因位於Escherichia coli中的抗葯性R質粒上.
(三)II類限制性內切酶的底物識別順序及切割位點
絕大多數的II類限制性內切酶在底物DNA上的識別順序長度為4,5,6鹼基對,這些鹼基對的順序呈迴文結構(Palindromic),而且切點就在其內部,如EcoRI 5'-GAATTC-3' .
DNA被限制性內切酶切開之後,呈現兩種斷口:
鈍端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
圖2-1 限制性內切酶產生的末端
(四)識別位點在DNA分子中的頻率
對於特定的限制性酶在DNA分子中的識別位點數目是可以計算的,四鹼基的酶平均大約每256個核苷酸(44)有一個識別位點,而六鹼基的酶大約4096(46)個核苷酸有一個識別序列,計算是在假定核苷酸隨機排列的情況下進行的.實踐中這種方法不完全正確,如λ DNA長49kb,對於六鹼基的酶應該有12個切割位點,實際上要少一些,如Bgl II只有6個,BamHI只有5個,而SalI只有2個.
二,甲基化酶
在專一位點上甲基化,與限制性內切酶相對應.
(一)大腸桿菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,這樣可使一些識別順序中含有5'GATC3'的限制性內切酶不能切割來自大腸桿菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)則不會因為N6A的甲基化而失去活性,因為這兩種酶對底物的特異性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影響的限制性內切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
許多II類限制性內切酶,都存在著相對的甲基化酶,它們可修飾限制酶識別順序中的第三位腺嘌呤上,封閉酶切位點,從而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基轉移到EcoRI識別順序中的第三位腺嘌呤上,從而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA連接酶(T4-DNA Ligase)
來源於T4噬菌體感染的大腸桿菌,連接修復3'端羥基和5'端磷酸基因,脫水形成3'-5'磷酸二酯鍵
連接雙鏈DNA上的單鏈缺口(Nick),因此亦可連接限制內切酶所產生的粘性末端
連接RNA模板上的DNA鏈缺口
連接平頭雙鏈DNA速度很慢,在高濃度的底物和酶的作用下方可進行,這屬於分子之間的連接.
圖2-2 連接酶的作用方式
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯鍵
分為:外切酶 內切酶
(一) Bal 31(來自於細菌Alteromonas espejiana) 單鏈特異的核酸內切酶活性,雙鏈特異的內切酶活性.依賴於Ca2+
用途:
構建限制酶圖譜
產生末端缺失突變
DNA超螺旋線性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一條鏈,產生單鏈的DNA分子.
(三)S1核酸酶(來源於米麴黴菌)
特性:
1. 降解單鏈DNA或RNA,降解DNA的速度大於降解的速度
2. 降解發生的方式為內切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH環境,Zn2+激活
4. 酶量過大時會降解雙鏈核酸,因為雙鏈降解活性比單鏈低75000倍
(四) DNase I: 來自於牛胰腺, 既可以降解單鏈也可以降解雙鏈,沒有特異性,產生單核苷酸或短鏈
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5'-3'聚合酶活性
3'-5'外切酶活性
5'-3'外切酶活性
核酸內切酶活性
可以被枯草桿菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.
圖2-3 DNA聚合酶I
(二) Klenow酶
該酶無5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用該酶:
修復限制性內切酶造成的5'突出的粘性末端
標記DNA探針
催化cDNA第二條鏈的合成
末端終止法測序
圖2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
與Klenow酶相似,外切酶活性更高.體外誘變反應中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
測序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高溫,主要用於PCR反應.
(六) 逆轉錄酶:將mRNA轉錄成cDNA
AMV逆轉錄酶(鳥類成髓細胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA內切酶活性
核酸結合活性
M-MLV逆轉錄酶(Moloney鼠白血病病毒)
兩種逆轉錄酶的區別
肽鏈的組成
禽酶2條肽鏈,具聚合酶和很強的RNase H活性
鼠酶1條,較弱的RNase H活性
反應的最適溫度
禽酶42°C,二級結構豐富RNA,禽酶效率高
反應的最適pH值
禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修飾酶
有大量的修飾酶,主要的有以下幾種:
1) 鹼性磷酸酯酶(來自於大腸桿菌或小牛腸道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基團.
2) polynucleotide kinase: 來自於T4侵染的大腸桿菌,在5'端增加磷酸基團.
3) 末端脫氧核苷酸轉移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 來自於小牛胸腺組織,在DNA分子的3'端增加一個或多個脫氧核苷酸.
4) Topoisomerase改變共價閉合雙鏈DNA分子的結構
第二節 DNA的切割反應
一,緩沖系統的組成
II類酶的酶活條件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根據不同酶對鹽離子要求不同,可將緩沖液分為以下三種情況:
高鹽:100-150mM
中鹽:50-100mM
低鹽:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的確定,加入酶量的確定,發應體積的確定(20μl),反應時間的確定,1-1.5hr,一般為37℃,但也有例外,如Taq I在65°C時活性最高.
單位限制性內切酶定義為:在最佳緩沖系統和20μl體積中反應1小時,完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切結果分析
(一) 酶切片段的檢測
1) 通過凝膠電泳分離,根據分子量分離.根據凝膠的濃度可以分離不同分子量的片段,聚丙烯醯胺凝膠電泳可以分離1-300bp的分子.
2) DNA分子的檢測 a. 染色EB,DNA分子小於25ng,很難檢測到
b. 放射性自顯影, 可以監測少到2ng DNA分子.
(二)估計DNA分子的大小
根據DNA分子的遷移率,可以用公式計算出分子量D=a-b(logM)
D是移動的距離,M是分子量,a, b是恆量但隨著電泳條件的改變而改變.
也可以根據已知大小的片段進行比較,誤差約在5%左右.
四,多酶聯合酶解
對於對濃度要求相同的酶,原則上可以同時酶解;
對於對濃度要求不同的酶,可以:
1. 低鹽濃度的酶先切,後補加NaCL
2. 一種酶切後,換緩沖液,加5mM NaAc 0.1體積,2體積乙醇,冰浴5min,4℃離心10min,乾燥
五,定位酶切位點
建立酶切圖譜需要一系列的酶.
首先確定每一種酶切後產生的分子量和片段的數目;
然後進行雙酶切;
比較酶切和雙酶切的結果,繪制酶切圖譜;
含糊的位點可以通過部分酶切解決,可以短時間的酶切或者在4°C條件下進行.
六, 限制性內切酶的star活性
在PH不合適,或甘油濃度過高≥10%時,限制性內切酶的切割位點會出現非專一性,因此應確保酶的體積為總體積的十分之一以下.
第三節 DNA片段的連接
重組DNA分子構建的最後一步是連接,通過連接酶完成.相對而言,鈍端的連接效率較低,因此一般提高DNA濃度的方法增加接觸的機會.而粘性末端的連接效率較高,因為兩個粘性末端可以通過氫鍵鹼基互補配對.這種暫時的,鹼基配對結構可以提高連接的效率.在分子克隆的連接方式主要有以下幾種:
一,連接方式
(一)相同粘性末端的連接
來源:
相同的酶
同尾酶
問題:
極性有兩種可能
同尾酶連接後,不能用任何一種酶酶切.稱為"焊死".
(二)平頭末端的連接
粘性末端--分子內部連接,平頭末端--分子間的連接.
提高連接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平頭末端底物的濃度
加入10%PEG(8000),促進分子間的有效作用
加入單價陽離子, 150-200mM NaCl
提高反應溫度
平頭連接同樣存在兩種極性
(三)不同粘性末端的連接
突出5'末端
Klenow補平,或S1核酸酶切平,然後平頭連接
突出3'末端
T4-DNApol切平,然後平頭連接
突出末端不同
Klenow補平,或S1核酸酶切平
連接後,可能恢復限制性位點,甚至還可能產生新的位點.XbaI與HindIII( XbaI恢復), XbaI與EcoRI(均保留),BamHI與Bgl II(產生ClaI位點)
(四)人工粘性末端的連接
5'突出的末端
外源片段先用Klenow補平;然後用TdT補加polyC;載體片段也用Klenow補平,加polyG,退火不經連接即可轉化.目的是:不使酶切位點遭受破壞.
3'突出的末端
外源片段先用TdT加polyG;載體片段加polyC;然後退火;再用Klenow補齊;連接
平頭末端
可直接用TdT補加末端,但以加polyA/T為佳.這樣稍微加熱,AT區就會出現單鏈區域,然後用S1核酸酶水解即可回收片段
(五)粘端與平端的連接
linker : 人工合成的,含有限制性內切酶識別序列的,短的雙鏈DNA片段.
– 連接的效率較高
– 酶切時可能破壞DNA分子的完整.
adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.
圖 2-5 linker的連接方式
(六)粘性末端的更換
在DNA片段上某一酶切口處換成另一種酶切口
– BamHI酶切片段用Klenow補平,或用S1酶切平;連接一段linker或Adaptor,使之產生EcoRI粘性末端.這樣BamHI切口就換成了EcoRI切口 .
– 由AluI更換EcoRI:AluI切開,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切開,Klenow補平,連接,原來含有AluI的片段變成含有EcoRI
二,重組率
重組率:連接反應結束後,含有外源DNA片段的重組分子數與加入的載體分子數之比.較為理想的重組率為25-75%
提高重組率的方法:
連接反應條件 外源片段:載體=2:1-10:1(分子數),增加碰撞機會,減少自身環化.
載體除磷 (磷酸酯酶5'除磷).
TdT在3'端增加人工粘性末端,防止載體自我環化 .

7. 各種pH的緩沖溶液怎麼配製

配製方法：

只要知道緩沖對的PH值，和要配製的緩沖液的pH值（及要求的緩沖液總濃度），就能按公式計算[鹽]和[酸]的量。

這個演算法涉及對數換算，較麻煩，前人為減少後人的計算麻煩，已為我們總結出pH值與緩沖液對離子用量的關系並列出了表格。只要我們知道要配製的緩沖液的pH，經查表便可計算出所用緩沖劑的比例和用量。例如配製500nm pH5.8濃度為0.1M磷酸緩沖液。

經查表知pH5.8濃度為0.2M Na2HPO48.0毫升（1M=1 mol/L），而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推論出配製100ml 0.1M的磷酸緩沖液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。

計算好後，按計算結果准確稱好固態化學成分，放於燒杯中，加少量蒸餾水溶解，轉移入50ml容量瓶，加蒸餾水至刻度，搖勻，就能得到所需的緩沖液。

各種緩沖溶液的配製，均按表格按比例混合，某些試劑，必須標定配成准確濃度才能進行，如醋酸、氫氧化鈉等。另外，所有緩沖溶劑的配製計量都能從以上的算式准確獲得。

(7)基因工程常用緩沖體系及配置方法擴展閱讀

緩沖溶液的pH計算：

1、緩沖液的pH值與該酸的電離平衡常數Ka及鹽和酸的濃度有關。弱酸的pKa值衡定，但酸和鹽的比例不同時，就會得到不同的pH值。酸和鹽濃度相等時，溶液的pH值與PKa值相同。

2、酸和鹽濃度等比例增減時，溶液的pH值不變。

3、酸和鹽濃度相等時，緩沖液的緩沖效率為最高，比例相差越大，緩沖效率越低，緩沖液的一般有效緩沖范圍為pH=pKa±1,pOH=pKb±1。

8. Tris-HCl緩沖液的配製方法

Tris-HCl緩沖液的配製方法：
Tris：三羥甲基氨基甲烷
三羥甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般簡稱為Tris）是一種有機化合物，其分子式為(HOCH2)3CNH2。Tris被廣泛應用於生物化學和分子生物學實驗中的緩沖液的制備。例如，在生物化學實驗中常用的TAE和TBE緩沖液（用於核酸的溶解）都需要用到Tris。由於它含有氨基因此可以與醛發生縮合反應
Tris為弱鹼，在室溫（25℃下，它的pKa為8.1；根據緩沖理論，Tris緩沖液的有效緩沖范圍在pH7.0到9.2之間。
Tris鹼的水溶液pH在10.5左右，一般加入鹽酸以調節pH值至所需值，即可獲得該pH值的緩沖液。但同時應注意溫度對於Tris的pKa的影響。
由於Tris緩沖液為弱鹼性溶液，DNA在這樣的溶液中會被去質子化，從而提高其溶解性。人們常常在Tris鹽酸緩沖液中加入EDTA製成「TE緩沖液」，TE緩沖液被用於DNA的穩定和儲存。如果將調節pH值的酸溶液換成乙酸，則獲得「TAE緩沖液」（Tris/Acetate/EDTA），而換成硼酸則獲得「TBE緩沖液」（Tris/Borate/EDTA）。這兩種緩沖液通常用於核酸電泳實驗中。
用途：有機合成中間體。在電泳緩沖液中同甘氨酸構成緩沖體系，穩定電泳過程中的PH值。在凝膠中也起到穩定PH的作用，只不過是Tris-HCl緩沖體系。
Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質的溶劑，還有許多重要用途。Tris被用於不同pH條件下的蛋白質晶體生長。Tris緩沖液的低離子強度特點可用於線蟲（C.
elegans核纖層蛋白lamin）的中間纖維的形成。Tris也是蛋白質電泳緩沖液的主要成分之一。此外，Tris還是制備表面活性劑、硫化促進劑和一些葯物的中間物。Tris也被用作滴定標准物。
1
M
Tris-HCl
(pH7.4，7.6，8.0)
組份濃度
1
M
Tris-HCl
配製量
1L
配製方法：
1.稱量121.1
g
Tris置於l
L燒杯中。
2.加入約800
ml的去離子水，充分攪拌溶解。
3.按下表加入濃HCl量調節所需要的pH值。
pH值
濃HCl
7.4
約70
ml
7.6
約60
ml
8.0
約42ml
4.將溶液定容至1
L。
5.高溫高壓滅菌後，室溫保存。
注意：應使溶液冷卻至室溫後再調定pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1℃，溶液的pH值大約降低0.03個單位。
1.5
M
Tris-HCl
(pH8.8)
組份濃度
1.5
MTris-HCl
配製量
1
L
配製方法
1.稱量181.7
g
Tris置於1
L燒杯中。
2.加入約800
ml的去離子水，充分攪拌溶解。
3.用濃HCl調節pH值至8.8。
4.將溶液定容至1
L。
5.高溫高壓滅菌後，室溫保存。
注意：應使溶液冷卻至室溫後再調定pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1℃，溶液的pH值大約降低0.03個單位。
TE即Tris-EDTA
buffer（10mM
Tris，1mM
EDTA，pH7.4
pH7.6
pH8.0）。
常用分子生物學試劑，用於DNA的溶解等。
配製1
0×TE
Buffer
(pH7.4,
7.6，8.0)
組份濃度：
100
mM
Tris-HCl，10
mM
EDTA
配製量：
1
L
配製方法：
1.
量取下列溶液，置於l
L燒杯中。
1
M
Tris-HCl
Buffer(pH7.4，7.6，8.0)
100
ml
500
mM
EDTA(pH8.0)
20
ml
2.向燒杯中加入約800
ml的去離子水，均勻混合。
3.將溶液定容至1
L後，高溫高壓滅菌。
4.室溫保存。

9. 緩沖溶液如何配置

緩沖體系配製方法為;先把各組分配成0.1mol/L的溶液，然後在檸檬酸(或磷酸氫二鈉，三(羥甲基)氨基甲烷)中逐滴加入鹽酸或檸檬酸，用酸度計測量pH值至所需要的pH值為止

10. 常見緩沖溶液是由什麼組成的

常用作緩沖溶液的酸類由弱酸及其共軛酸鹽組合成的溶液具有緩沖作用。常見的緩沖體系有：
1、弱酸和它的鹽（如HAc---NaAc）
2、弱鹼和它的鹽（NH3·H2O---NH4Cl）
3、多元弱酸的酸式鹽及其對應的次級鹽（如NaH2PO4---Na2HPO4）的水溶液組成。

而生化實驗室常用的緩沖系主要有磷酸、檸檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羥甲基氨基甲烷）等系統，生化實驗或研究工作中要慎重地選擇緩沖體系，因為有時影響實驗結果的因素並不是緩沖液的pH值，而是緩沖液中的某種離子。如硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽和三羥甲基甲烷等緩沖劑都可能產生不需要的化學反應。

硼酸鹽：硼酸鹽與許多化合物形成復鹽、如蔗糖。
檸檬酸鹽：檸檬酸鹽離子容易與鈣結合，所以存在有鈣離子的情況下不能使用。
磷酸鹽：在有些實驗，它是酶的抑止劑或甚至是一個代謝物，重金屬易以磷酸鹽的形式從溶液中沉澱出來。而且它在pH7.5以上時緩沖能力很小。
三羥甲基氨基甲烷：它可以和重金屬一起作用，但在有些系統中也起抑製作用。其主要缺點時溫度效應。這點往往被忽視，在室溫pH是7.8的Tris緩沖液，4℃時是8.4，37℃時是7.4，因此，4℃配製的緩沖液在37℃進行測量時，其氫離子濃度就增加了10倍。在pH7.5以下，其緩沖能力極為不理想。