目前最常用的原生質體融合方法

A. 原生質體融合的所有方法方法

現在被廣泛採用並證明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca、高pH值法和電融合法。

B. 原生質體融合常用什麼方法，急用

電擊，PEG。高PH-高Ca離子

C. 原生質體融合的誘導融合法是怎樣做的

誘導融合的方法大體可以分為物理的和化學的兩類。前者是利用顯微操作、灌流吸管、離心或振動等機械以促使原生質體融合，這種方法目前多與誘導劑結合起來使用，化學融合法是用不同的試劑作誘導劑，促使原生質體融合，形成異核體（heterokaryons）。

目前常用的較有效的是高pH—高鈣法、NaNOsubscript3subscript和聚二乙醇法。

圖3-1：原生質體融合方法

D. 細胞融合的方法有哪些

一、細胞融合的方法有三種：生物方法、化學方法、物理方法。
二、細胞融合也稱細胞雜交 , 是指細胞通過介導和培養, 在離體條件下用人工方法將不同種的細胞通過無性方式融合( 合並) 成一個核或多核的雜合細胞的過程。體細胞融合後可形成四倍體或多倍體細胞，由此形成的雜交細胞，其特性會有很大的變化。
三、化學誘導融合1.鹽類融合法。此法是應用最早的誘導原生質體融合的方法。鹽類融合劑對原生質體的破壞小。今後研究應提高其融合率 ,使其對液泡化發達的原生質體能夠誘發融合。2高鈣和高pH值融合法。高 Ca2+和高pH值可以誘發融合。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問題。3、聚乙二醇融合法(PEG法) 。1974年發現的聚乙二醇(PEG)使不同科屬的植物原生質體之間都可以融合，融合率可達30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結合，導致細胞脫水而發生質膜結構的變化，從而引起細胞融合。為了發揮PEG促進細胞融合的效力，必須採用較高的濃度(40%～50%，分子量為6000)，但PEG在高濃度下，細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是PEG融合技術的關鍵。影響原生質體融合的因素很多。特別是環境中的陽離子存在，融合時的pH 也對原生質體融合有較明顯的影響。一般來講鈣、鎂離子有助於融合。如有鈣離子存在時，可得到較高的融合率。但在缺乏鈣離子時，若pH 較低，融合頻率也較高。這是因為鈣離子和帶負電荷的PEG與細胞膜表面分子相互作用，使原生質體帶電，彼此易於附著發生凝集所致。PEG誘導細胞融合由於具有容易制備和控制、活性穩定、使用方便等特點，在細胞融合領域取得了可喜的成績，大量的研究仍採用此法。雖然PEG作為融合劑有很多成功的報道，但存在著對細胞損傷大、殘存有毒性、融合率較底及經驗性大等缺陷。
四、 物理誘導融合1。細胞電融合技術細胞電融合是以脂質膜和脂質一蛋白質膜的電學性質為基礎的，以雙向電泳和電子擊穿細胞質膜的聯合作用為手段，和細胞電注射構成一對互補技術。在短時間強電場的作用下，細胞膜發生可逆性電擊穿(Reverisb leb reakdown)，瞬時失去其高電阻和低通透特性，然後在數分鍾後恢復原狀。當可逆電擊穿發生在兩個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導他們的膜相互融合，從而導致細胞融合。細胞融合分為兩步：第一步是建立細胞間接觸(cell-to-cell contact) ； 第二步，接受區膜結構受擾動而紊亂，然後恢復並融合。根據其誘導細胞接觸的性質，分為特異性和非特異性兩大類。非特異性細胞電融合法是指在進行細胞電融合時，無法排除親本細胞的自體融合而只進行雙親本間的細胞雜交融合。主要原因是細胞間的相互接觸是無選擇性的，是非特異性細胞聚集。非特異性電融合技術包括細胞物理聚集電融合法和細胞化學聚集電融合法。細胞融合所必需的兩個步驟為：①細胞間接觸；②接觸區的膜結構受到瞬間擾動而導致融合。只要其中的任意一步有特異性，就能形成特異性的細胞融合。 2.激光誘導法。激光誘導細胞融合術是利用激光微束對相鄰細胞接觸區的細胞膜進行破壞(或擾動)，可將兩個不同特性、不同大小的細胞在顯微鏡下實現融合。即利用光鑷捕捉並拖動一個細胞使之靠近另一個細胞並緊密接觸，然後對接觸處進行脈沖激光束處理，使質膜發生光擊穿，產生微米級的微孔。這樣，由於質膜上微孔的可逆性，細胞開始變形融合，最終成為一個細胞。使用此技術時，使細胞接觸的方法可用①光俘虜法；②用低濃度的融合劑PEG (5% )使細胞聚法。目前，最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細胞間接觸，即光鑷利用激光高斯光束光場的梯度力把細胞從光束邊緣拉向光束中間，在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時，指向束腰的軸向梯度力要大於沿光束方向的散射力，該梯度力把細胞豎直地拉到激光束腰下方處，從而實現對細胞的操作。 

E. 原生質體融合的步驟

原生質體融合的程序包括：①標記菌株的篩選；②原生質體的制備和再生（過程見8.1.1）；③原生質體的融合；④融合子遺傳標記的篩選；⑤融合子的鑒定。

8.2.2.1 標記菌株的篩選

進行原生質體融合的親本需要攜帶遺傳標記，以便於融合後重組子的篩選。常用營養缺陷型和抗性作為遺傳標記，也可以採用熱致死、孢子顏色、菌落形態作為遺傳標記。遺傳標記的選擇要根據實際實驗目的來確定。如果原生質體融合的目的是進行遺傳分析，那麼應該採用帶有隱性基因的營養缺陷型或抗性菌株；如果從育種角度進行原生質體融合，由於大多數營養缺陷型菌株都會影響代謝產物的產量，所以在選擇營養缺陷型標記時，應盡量避免採用對正常代謝有影響的缺陷型菌株。

8.2.2.2 原生質體的融合

原生質體融合就是把親株的原生質體在高滲條件下進行混合。在原生質體融合中，誘導融合的方法主要有化學法（PEG促融法）、物理法（包括電融合和激光誘導融合法等）。

僅僅將原生質體等量地混合在一起融合頻率通常是很低的，只有通過加入融合劑例如表面活性劑聚乙二醇（PEG）或特定物理措施例如電擊和激光誘導等，融合頻率才會提高。

（1）PEG促融法：其誘導融合的可能機制是PEG帶有負電荷的醚鍵，與帶負電荷的原生質體相遇後，在Ca²⁺等陽離子作用下形成共同的靜電荷，從而促進異源原生質體的黏著和接合，常用的PEG是相對分子量為4000和6000的兩種。在有鈣離子存在的條件下融合時為鹼性能刺激產生最大的融合頻率，這是因為pH值能夠改變體系的電性狀態，從而影響原生質體的融合。PEG既是融合劑又是滲透壓穩定劑，濃度低於20%會使原生質體破裂而失去穩定性，濃度過高又會引起原生質體收縮而降低融合頻率，因此，融合時PEG的最終濃度常採用30%～40%。由於PEG的加入，原生質體間的黏著強烈地發生，融合就能較長時間有效地進行，所以PEG的處理時間不得太長。此外，PEG在高濃度下有毒，因此也要求融合時間不宜過長。

（2）電融合法：其原理是在短時間強電場的作用下，當原生質體被置於電導率很低的溶液中時，電場通電後，電流即通過原生質體，使原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串，原生質體成串排列後，立即給予高頻直流脈沖，細胞膜發生可逆性電擊穿，瞬時失去其高電阻和低通透性，然後在數分鍾內恢復原狀。當可逆電擊穿發生在兩個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導它們的膜相互融合，從而導致細胞融合。電融合是以空間定向，時間同步的可控方式來實現原生質體的融合，從而改變了PEG融合的隨機過程。該法的優點是融合頻率高，無化學毒性，操作簡便，可在顯微鏡下進行，具有極強的可操控性。

（3）激光融合法：其原理是先讓細胞或原生質體緊密貼在一起，再用高峰值功率密度激光照射接觸處，從而使質膜擊穿或產生微米級的微孔，質膜上產生微孔是一個可逆的過程，質膜恢復的過程中細胞連接微孔的表面曲率很高，使細胞處於高張力狀態，此時細胞由啞鈴形逐漸變為圓球狀，進而細胞發生融合。該法的優點是毒性小，損傷小，具高度選擇性；缺點是操作技術難度大，所需設備昂貴復雜，因此很難被推廣應用。

8.2.2.3 融合子遺傳標記的篩選

原生質體融合後，融合子的選擇方法是使原生質體融合技術得以應用的關鍵。以A和B細胞融合來說，可能會形成AA，AB及BB 三種融合形式。而要篩選出的是AB，即具有A細胞核B細胞的兩個遺傳標記就可以確定其為融合子。因此，就可以通過A和B細胞所分別具有的選擇性遺傳標記，在選擇培養基上挑出融合子。但是，由於原生質體融合後會產生兩種情況，一種是真正的融合，即產生雜合二倍體或單倍重組體；另一種是暫時的融合，形成異核體。兩者均可以在選擇培養基上生長，一般前者較穩定，而後者則是不穩定的，會分離成親本類型，有的甚至可以以異核狀態轉接幾代。因此，要獲得真正的融合子，必須在融合原生質體再生後，進行幾代自然分離、選擇，才能加以確定。融合子的篩選是融合過程的關鍵。下面列舉幾種常見的篩選方法。營養缺陷型標記篩選融合子、抗葯性標記篩選融合子、熒光色素標記篩選融合子、滅活原生質體標記篩選融合子、利用雙親對碳源利用不同而篩選融合子和利用某些特殊生理特徵作為標記篩選融合子等方法篩選。

8.2.2.4 融合子的鑒定

融合子篩選出後，還要對其進行鑒定。常用的鑒定方法有菌體或孢子形態、大小的比較，同工酶電泳譜帶的比較，酶活性的測定，DNA含量的比較，對結構蛋白及非基因直接編碼的次生代謝產物的分析，對染色體穩定性的研究等。劉玲等（2007）採用酯酶同工酶電泳對f1和f2融合子進行鑒定，融合子有不同於親本的新酶帶出現，融合子菌落呈現新的性狀，菌落形態、顏色、菌絲形狀都與親本部分性狀相似，又存在差異，並且菌株生長速度也不同於雙親本，在生理生化性狀上與親本存在明顯的差異，這說明融合子f1、f2是融合雙親性狀的新菌株。

F. 植物是怎樣進行原生質體培養與體細胞雜交的

植物原生質體是指植物細胞除去細胞壁後質膜包圍的裸露細胞原生質培養是給予游離原生質體適當的培養條件，使之重新形成細胞壁，並分裂增殖，直至分化形成再生植株的過程不同物種的原生質體融合多採用電融法和化學融合法在原生質體培養過程中更容易產生變異，其中包括抗病性變異，通過抗病體細胞突變體篩選，可獲得抗病新種質，用於抗病育種原生質體可作為基因工程的受體，通過脂質體介導法PEG(聚乙二醇)融合法等，將外源基因導入植物細胞

通過原生質體融合(protoplastfusion)創造雜種的方法稱為體細胞雜交(somatichybridization)由於不經過有性過程，避過了有性雜交不親和的生殖障礙，適於轉移遠緣種屬的抗病基因例如，可以利用體細胞雜交的方法，將野生歐白芥或亞麻芥對黑斑病(Alternariabrassicae)的抗病性導入甘藍，得到高度抗病的體細胞雜種(Hansen等，1997;Sigareva等，1999)用蕪菁和抗細菌性軟腐病的甘藍作親本，經原生質體融合，獲得了體細胞雜種，有的個體抗病性甚至高於抗病親本(Ren等，2000)連勇等(2004)應用原生質體電融合技術獲得了茄子近緣野生種與栽培種(六葉茄)的種間體細胞融合四倍體再生植株，帶有抗病基因，部分植株能正常結果

G. 誘導原生質體融合的方法

誘導原生質體融合的過程中可用的方法有三種：物理法、化學法、生物法。
將不同植物體細胞放在一起培養，必須通過一定的技術手段進行人工誘導。誘導方法有物理法和化學法兩大類。
物理法就是利用離心、振動、電刺激等促使原生質體融合；化學法是用聚乙二醇等試劑作為誘導劑誘導細胞的原生質體融合，聚乙二醇簡稱為PEG；誘導動物細胞融合時還可以用生物法，即用滅活的病毒進行誘導，重壓不能促使原生質體的融合。
植物體細胞雜交,又稱原生質體融合是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質體通過人工方法誘導融合，然後進行離體培養，使其再生雜種植株的技術。植物細胞具有細胞壁，未脫壁的兩個細胞是很難融合的，植物細胞只有在脫去細胞壁成為原生質體後才能融合，所以植物的細胞融合也稱為原生質體融合。

H. 什麼叫原生質體融合,他的基本操作是怎樣的,此法在育種工作中有何重要性

原生質體是去掉細胞壁的植物細胞，原生質體融合就是植物細胞的融合。常用的方法有振動，電擊，離心，聚乙二醇（PEG）處理等。先用纖維素酶和果膠酶處理原植物細胞，得到原生質體再在培養液中使用上述方法進行融合。這種方法的原理是細胞的流動性。當細胞核完成融合，並且重組細胞重生出細胞壁後，就表明雜種細胞已成功得到。之後利用植物的組織培養技術用得到的細胞就可以培養出完整個體，得到一株具有新形狀的植物個體。
植物細胞融合技術的發明打破了生物物種之間的界限，克服了遠緣雜交不親和的問題，為培養兼有兩種物種優良性狀的新物種提供了可能。不過由於人類還不完全了解遺傳物質的調控機理，一些雜種植物並不能按人們希望的那樣表達性狀。

希望樓主採納，這些字是我一個一個敲的。

I. 原生質體融合的高pH—高鈣法是怎樣做的

高pH—高鈣法是受動物細胞融合研究的啟發而產生的。用pH9.510.5、大於0.03molL濃度的Casuperscript2+superscript溶液處理原生質體，融合效果較好。高pH能導致質膜表面離子特性的改變，增加了質膜的流動性，有利於原生質體的融合。鈣能穩定原生質體，也起聯系融合的作用。

具體處理方法是：在原生質體沉澱中加入含有0.05molL：CaClsubscript2subscript·2Hsubscript2subscriptO和0.4molL甘露醇，pH調整到10.5，在37攝氏度下保溫0.5h，可使原生質體融合率達到10%左右。

J. 原生質體融合的原理

兩個具有不同遺傳性狀的細胞，採用適宜的水解酶溶解細胞壁後，在自發情況或融合劑作用下，兩個原生質體接觸，融合成為異核體，經過繁殖復制進一步核融合，形成雜合二倍體，再經過染色體交換產生重組體，達到基因重組的目的，並在適宜的條件下再生出細胞壁，對重組體進行生產性能、生理生化和遺傳特性分析獲得所需重組子。其中，細胞在用酶分離原生質體過程中發生的原生質體自然融合現象又稱自發融合；而分離原生質體以後，通過加入誘導劑或利用其他方法誘導不同親本原生質體發生融合的過程又稱誘導融合。理論上講原生質體融合可在包括種內、種間、屬間、科間甚至是界間的任何原生質體間進行，它不僅可以突破物種間的生殖隔離，創造遠緣雜種；還可以使雙親的細胞質基因結合在一起，從而達到改良由胞質基因控制的性狀的目的。