結核病的檢疫常用的實驗方法

1. 肺結核的檢查方法是什麼

胸透不清楚，拍個x光吧，又經驗的醫生一眼就能看出來。
結核病的典型的症狀是：咳嗽，胸悶，發熱。你有這些症狀嗎？
如果有的話，建議化驗一下血沉吧，結合病人的血沉高。

2. 簡述結核菌素試驗的原理、方法和結果分析

本試驗是用結核菌素進行的皮膚IV型過敏變態反應試驗，用以判斷機體是否受到結核菌感染進行結核病流行病學調查，發現病人，協助診斷和鑒別診斷，選擇卡介苗（BCG）接種對象並考核其接種效果，藉以判斷機體細胞免疫狀態的一種常用試驗。 「抗原」有兩種即舊結核菌素簡稱舊結素（old tuberculin，OT）和結核菌純蛋白洐化物（purified protein derivative，PPD）。OT為人型結核桿菌培養二個月後，加熱殺死結核菌，將濾去死菌後含菌體自溶及培養基成分的剩餘部分濃縮至原量1/10的棕色透明液體，1952年WHO將其標准化，每ml含1000mg相當10萬TU（結素單位）。PPD是用化學方法從結核菌培養液中提取的結核菌蛋白，較OT更精純，用後不產生非特異性反應（表7-2）。「方法」有皮上、皮膚劃痕或點刺與皮內注射法，以後者應用最為廣泛，效果准確。1、 部位，選左臂屈側中部皮膚無瘢痕部位，如近期（2周內）已作過試驗，則第2次皮試應選在第一次注射部位斜上方3~4cm處，或取右前臂。2、 局部75％酒精消毒，用1.0ml注射器、4.5號針頭（針頭斜面不宜太長），吸取稀釋液0.1ml （5TU）皮內注射，使成6~8mm大小圓形皮丘。3、 注後48小時觀察一次，72小時判讀結果，測量注射局部紅腫處的硬結橫與縱徑，取其均值為硬結直徑。＜5mm為陽性，5~9mm為弱陽性（+），10~19mm為陽性（+ +），≥20mm或局部出現水泡、壞死或有淋巴炎，均為強陽性（+ + +）。「意義」陽性：①示機體受到結核桿菌感染，且已產生變態反應；②城市居民，成人絕大多數為陽性，一般意義不大；如用高倍稀釋液（1/10000）1TU皮試呈強陽性，提示體內有活動性結核病灶；③3歲以下兒童，呈陽性反應（+ +），不論有無臨床症狀，均現為有新近感染的活動性結核，應予治療。陽性：提示①機體未受到結核菌感染，或雖已感染但機體變態反應尚未建立（4~8周內）；如一周後，再用5TU重新皮試，利用結素的復強作用，若仍為陽性，則可除外結核菌感染。此外見於：②高齡，一般60歲以上20％、70歲以上30％、80歲以上50％為陰性；③兒童患麻疹、百日咳後，變態反應被抑制，大約3周後可漸恢復；④重症結核病，當經過治療隨病情好轉，結素反應可復陽；⑤結節病（陽性率僅10％，且多為弱陽性）、淋巴瘤與其他惡性腫瘤患者；⑥接受糖皮質激素或免疫抑制劑治療者；⑦營養不良和AIDS（acquired immune deficiency syndrome）患者。「注意事項」1、 已配製稀釋液置有色瓶內。避免日光直射、4℃可保存2周。2、 玻璃及塑料對結素有明顯吸附作用，抽取後務於1小時內用完，否則效價降低影響效果。3、 結素試驗後可能會出現一些異常反應，應予妥善處理。局部：出現水泡、潰瘍，應保持清潔，塗2％甲紫，必要時可用注射器將水泡液抽除。全身：①發熱，多屬熱原反應與器具消毒不嚴有關，一般於數小時內可恢復；②厥與休克，多與精神緊張、恐懼有關，可囑其平卧、保溫，必要時皮下注射0.1％腎上腺素0.5~1.0ml；③病灶反應，注後數小時肺部病灶周圍毛細血管擴張，通透性增加，侵潤滲出，形成變態反應性病灶周圍炎，一般不必特殊處理，2~5天可自行消退。4、有下列情況暫不宜作結素試驗 發熱，體溫37.5℃以上；傳染病恢復期，器質性心臟病、肝腎血管疾病、精神病、癲癇、細胞免疫功能缺陷、丙種球蛋白缺乏和月經期。

3. 肺結核的診斷方法有哪些

1．病史和症狀體征

（1）症狀體征情況：肺結核患者的症狀一般沒有特異性，但明確症狀的發展過程對結核病診斷有重要參考意義。體征對肺結核的診斷意義有限。

（2）診斷治療過程：確定患者是新發現還是已發現病例。不少肺結核患者首次就診多在綜合醫院，且接受治療，應記錄首次診斷情況特別是痰排菌情況、用葯品種、用葯量和時間、堅持規律用葯情況等，這對將來確定治療方案有重要價值。如果是復發患者，治療史對判斷耐葯情況有參考意義。

（3）肺結核接觸史：主要是家庭內部接觸史，對鄰居、同事、宿舍等有無肺結核患者也應了解。記錄接觸患者的病情、排菌情況、治療方案和用葯規律情況、接觸時間、接觸密切程度等。

2．影像學診斷

胸部X 線檢查是診斷肺結核的重要方法，可以發現早期輕微的結核病變，確定病變范圍、部位、形態、密度、與周圍組織的關系、病變陰影的伴隨影像；判斷病變性質、有無活動性、有無空洞、空洞大小和洞壁特點等。肺結核病影像特點是病變多發生在上葉的尖後段和下葉的背段，密度不均勻、邊緣較清楚和變化較慢，易形成空洞和播散病灶。診斷最常用的攝影方法是正、側位胸片，常能將心影、肺門、血管、縱隔等遮掩的病變以及中葉和舌葉的病變顯示清晰。

CT 能提供橫斷面的圖像，減少重疊影像，易發現隱蔽的病變而減少微小病變的漏診；比普通胸片更早期顯示微小的粟粒結節；能清晰顯示各型肺結核病變特點和性質，與支氣管關系，有無空洞，以及進展惡化和吸收好轉的變化；能准確顯示縱隔淋巴結有無腫大。

常用於對肺結核的診斷以及與其他胸部疾病的鑒別診斷，也可用於引導穿刺、引流和介入性治療等。

3．痰結核分枝桿菌檢查

確診肺結核病的主要方法，也是制訂化療方案和考核治療效果的主要依據。每一個有肺結核可疑症狀或肺部有異常陰影的患者都必須查痰。

（1）痰標本的收集：肺結核患者的排菌具有間斷性和不均勻性的特點，傳染性患者查一次痰也許查不出，所以要多次查痰。菌陽患者1 個痰標本塗片檢查約80% 陽性，2 個痰標本塗片檢查約90%陽性，3 個痰標本塗片檢查約95% 陽性。通常初診患者要送三份痰標本，包括清晨痰、夜間痰和即時痰，如無夜間痰，宜在留清晨痰後2 ～ 3 小時再留一份痰標本。復診患者每次送兩份痰標本。無痰患者可採用痰誘導技術獲取痰標本。

（2）痰塗片檢查：簡單、快速、易行和可靠的方法，但欠敏感。

每毫升痰中至少含5000 ～ 10000 個細菌時可呈陽性結果。常採用的是齊－尼氏染色法。痰塗片檢查陽性只能說明痰中含有抗酸桿菌，不能區分是結核分枝桿菌還是非結核性分枝桿菌，由於非結核性分枝桿菌少，故痰中檢出抗酸桿菌有極重要的意義。

（3）培養法：結核分枝桿菌培養為痰結核分枝桿菌檢查提供准確可靠的結果，常作為結核病診斷的金標准。同時也為葯物敏感性測定和菌種鑒定提供菌株。結核分枝桿菌培養費時較長，一般為2 ～ 6周，陽性結果隨時報告，培養至8 周仍未生長者報告陰性。常用的培養方法為改良羅氏法和小川法。近期採用測定細菌代謝產物的BACTEC TB460 或BACTEC MGIT 960 法，約2 周左右可獲得結果。

（4）葯物敏感性測定：主要為臨床耐葯病例的診斷、制定合理的化療方案以及流行病學監測提供依據。

（5）其他檢測技術：如聚合酶鏈式反應（PCR）、核酸探針檢測特異性DNA 片段、色譜技術檢測結核硬脂酸和分枝菌酸等菌體特異成分以及採用免疫學方法檢測特異性抗原和抗體等，使結核病快速診斷取得一些進展，但這些方法仍在研究階段，尚需改進和完善。

4．纖維支氣管鏡檢查

纖維支氣管鏡檢查常應用於支氣管結核和淋巴結支氣管炎的診斷，支氣管結核表現為黏膜充血、潰瘍、糜爛、組織增生、形成瘢痕和支氣管狹窄，可以在病灶部位鉗取活體組織進行病理學檢查、結核分枝桿菌培養。對於肺內結核病灶，可以採集分泌物或沖洗液標本做病原體檢查，也可以經支氣管肺活檢獲取標本檢查。

5．結核菌素試驗

廣泛應用於檢出結核分枝桿菌的感染，而非檢出結核病。結核菌素試驗對兒童、少年和青年的結核病診斷有參考意義。由於許多國家和地區廣泛推行卡介苗接種，結核菌素試驗陽性不能區分是結核分枝桿菌的自然感染還是卡介苗接種的免疫反應。因此，在卡介苗普遍接種的地區，結核菌素試驗對檢出結核分枝桿菌感染受到很大限制。目前世界衛生組織和國際防癆和肺病聯合會推薦使用的結核菌素為純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）PPDRT23，以便於國際結核感染率的比較。

結核菌素試驗選擇左側前臂曲側中上部l/3 處，0.lml（5IU）皮內注射，試驗後48 ～ 72 小時觀察和記錄結果，手指輕摸硬結邊緣，測量硬結的橫徑和縱徑，得出平均直徑=（橫徑＋縱徑）/2，而不是測量紅暈直徑，硬結為特異性變態反應，而紅暈為非特異性反應。

硬結直徑≤ 4mm 為陰性，5 ～ 9mm 為弱陽性，10 ～ 19mm 為陽性，≥ 20 或雖＜ 20mm 但局部出現水泡和淋巴管炎為強陽性反應。結核菌素試驗反應愈強，對結核病的診斷，特別是對嬰幼兒的結核病診斷愈重要。凡是陰性反應結果的兒童，一般來說，表明沒有受過結核分枝桿菌的感染，可以排除結核病。但在某些情況下，也不能完全排除結核病，因為結核菌素試驗可受許多因素影響，結核分枝桿菌感染後需4 ～ 8 周才建立充分變態反應，在此之前，結核菌素試驗可呈陰性；營養不良、HIV 感染、麻疹、水痘、癌症、嚴重的細菌感染包括重症結核病如粟粒性結核病和結核性腦膜炎等，結核菌素試驗結果則多為陰性和弱陽性。

4. 結核病的實驗室檢查具體有什麼呢

結核病的實驗室檢查有這些：

（1）結核菌細菌學檢查痰塗片查抗酸桿菌是WHO推薦的肺 結核診斷方法，是全世界的結核病實驗室都在使用的最基本的細菌學檢 查方法。痰塗片檢查不僅可以明確結核病傳染源，而且十分經濟，符合 我國國情。塗片的優點是簡便、快速、價廉。塗片的缺點是陽性率低。 結核菌培養仍是目前診斷支氣管結核病（MTB)的金標准，缺點是培養 時間長，特異性差。(2) 免疫學檢測技術

① 皮膚變態反應：結核菌素或PPD實驗，臨床意義同前。

② 結核抗體測定：目前常用的檢測方法主要有ELISA、免疫層析試 驗、免疫印跡試驗和蛋白晶元技術等檢測血清抗體方法。

③ 結核抗原測定和循環免疫復合物（CIC)測定。

(3) 干擾素分析為體外測定結核菌抗原刺激誘發的T淋巴細胞分 泌y干擾素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物學方法檢測核酸雜交、聚合酶鏈式反應（PCR)可 檢測樣本中的結核桿菌核酸，並能鑒別耐葯株。

(5) 血沉多增快，結合臨床表現及X線檢查可協助判斷結核病的 活動性。

5. 早期肺結核的檢查方法

肺結核應該做哪些檢查？ 一結核菌檢查 是確診肺結核最特異性的方法痰中找到結核菌是確診肺結核的主要依據塗片抗酸染色鏡檢快速簡便在我國非典型分枝桿菌尚屬少見故抗酸桿菌陽性肺結核診斷基本即可成立直接厚塗片陽性率優於薄塗片為目前普遍採用熒光顯微鏡檢查適合於大量標本快速檢查無痰或兒童不會咳嗽可採用清晨的胃洗液找結核菌成人亦可通過纖支鏡檢查或從其涮洗液中查找結核菌痰菌陽性表明其病灶是開放性的具有傳染性若排菌量多(每毫升10萬個以上)直接塗片易呈陽性為社會傳染源痰菌量較少(每毫升1萬個以下)可用集菌法 培養法更為精確除能了解結核菌有無生長繁殖能力外且可作葯物敏感試驗與菌型鑒定結核菌生長緩慢使用改良羅氏培養基通常需4～8周才能報告培養雖較費時但精確可靠特異性高若塗片陰性或診斷有疑問時培養尤其重要培養菌株進一步作葯物敏感性測定可為治療特別是復治時提供參考 將標本在體外用聚合酶鏈反應(PCR)法使所含微量結核菌DNA得到擴增用電泳法檢出1個結核菌約含1fgDNA40個結核菌即可有陽性結果該法不必體外預培養特異性強2天即可出報告快速簡便並可鑒定菌型不足之處是可能出現假陽性或假陰性 二影像學檢查 胸部X線檢查可以發現肺內病變的部位范圍有無空洞或空洞大小洞壁厚薄等X線對各類結核病變的透過度不同通過X線檢查大致能估計結核病灶的病理性質並能早期發現肺結核以及判斷病情發展及治療效果有助於決定治療方案必須指出不同病因引起的肺內病變可能呈現相似的X線影像故亦不能僅憑X線檢查輕易確定肺結核的診斷 X線攝片結合透視有助於提高診斷的准確性可發現肋骨縱隔膈肌或被心臟遮蓋的細小病灶並能觀察心肺膈肌的動態 肺結核的常見X線表現包括：纖維鈣化的硬結病灶表現為密度較高邊緣清晰的斑點條索或結節;浸潤性病灶表現為密度較淡邊緣模糊的雲霧狀陰影;乾酪樣病灶表現為密度較高濃淡不一有環形邊界透光區的空洞等肺結核病灶通常在肺上部單側或雙側存在時間較長且有多種不同性質的病灶混合存在及肺內播散跡象 凡X線胸片上顯示滲出性或滲出增殖性病灶乾酪樣肺炎乾酪樣病灶空洞(除凈化空洞外)遠均提示為活動性病變;增殖性病變纖維包囊緊密的乾酪硬結灶及纖維鈣化灶等均屬非活動性病變活動性病灶的痰中仍可找到結核菌由於肺結核病變多為混合性在未達到完全增殖或纖維鈣化時均仍應考慮為活動性 胸部CT檢查對於發現微小或隱蔽性病變了解病變范圍及肺病變鑒別等方面均有幫助 三結核菌素(簡稱結素)試驗 是診斷結核感染的參考指標 舊結素(old tuberculin,OT)是結核菌的代謝產物由液體培養長出的結核菌提煉而成主要含有結核蛋白OT抗原不純可能引起非特異性反應在人群中作普查時可用1：2000的OT稀釋液0.1ml(5IU)在左前臂屈側作皮內注射經48～72小時測量皮膚硬結直徑如小於5mm為陰性5～9mm為弱陽性(提示結核菌或結核分枝桿菌感染)10～19mm為陽性反應20mm以上或局部出現水泡與壞死者為強陽性反應 結素的純蛋白衍化物(purified protein derivative,PPD)由舊結素濾液中提取結核蛋白精製而成為純潔素不產生非特異性反應國際上常用的PPD——RT23已經取代OT我國從人型結核菌製成的PPD(PPD-C)及從卡介苗製成BCG-PPD純度均較好已廣泛用於臨床診斷皮內注射0.1ml(5IU)硬結平均直徑≥5mm為陽性反應結素試驗除引起局部皮膚反應外偶可引起全身反應臨床診斷通常使用5IU如無反應可在一周後再用5IU(產生結素增強效應)如仍為陰性大致可除外結核感染 結素試驗仍是結核病綜合診斷中常用手段之一有助於判斷有無結核菌感染若呈強陽性反應常表示為活動性結核病結素試驗陽性反應僅表示曾有結核感染並不一定現有患病我國城市成年居民曾患結核感染率在60%以上故用5IU結素進行檢查其一般陽性結果意義不大結素試驗嬰幼兒的診斷價值較成人為大因年齡越小自然感染率越低;3歲以下強陽性反應者應視為有新近感染的活動性結核病有必要進行治療如果2年內結素反應從<10mm增加至10mm以上並增加6mm以上時可認為有新感染 結素試驗陰性反應除表示沒有結核菌感染外尚應考慮以下情況結核菌感染後需4～8周才建立充分變態反應在該變態反應產生之前結素試驗可呈陰性應用糖皮質激素等免疫抑制葯物或營養不良麻疹百日咳等患者結素反應亦可暫時消失嚴重結核病及各種重危患者對結素無反應或僅出現弱陽性與人體免疫力及變態反應暫時受抑有關待病情好轉可轉為陽性反應其他如淋巴細胞免疫系統缺陷(如白血病淋巴瘤結節病艾滋病等)患者或年老體衰者的結素反應亦常為陰性 四其他檢查 結核病患者血像通常無改變嚴重病例常有繼發性貧血急性粟粒型肺結核時白細胞總數減低或出現類白血病反應血沉增快常見於活動性肺結核但並無特異性診斷價值血沉正常亦不能排除活動性肺結核患者無痰或痰菌陰性而需與其他疾病鑒別時用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)檢出患者血清中特異性抗體可能對肺外結核的診斷提供參考纖支鏡檢查對於發現支氣管內膜結核了解有無腫瘤吸取分泌物解除阻塞或作病原菌及脫落細胞檢查以及取活組織作病理檢查等均有重要診斷價值淺表淋巴結活檢有助於結核的鑒別診斷 近年來應用分子生物學及基因工程技術以非培養方法來檢出與鑒定臨床標本中的結核菌展示其敏感快速及特異性高等優點如核酸探針(DNA probe)染色體核酸指紋術等

6. 確診結核的方法

痰液塗片染色找到抗酸桿菌或痰液培養出結核桿菌。

7. 結核菌素試驗的實驗步驟

基於Ⅳ型變態反應（見變態反應）原理的一種皮膚試驗，用來檢測機體有無感染過結核桿菌。凡感染過結核桿菌的機體，會產生相應的致敏淋巴細胞，具有對結核桿菌的識別能力。當再次遇到少量的結核桿菌或結核菌素時，致敏T淋巴細胞受相同抗原再次刺激會釋放出多種可溶性淋巴因子，導致血管通透性增加，巨噬細胞在局部集聚，導致浸潤。約在48～72小時內，局部出現紅腫硬節的陽性反應。若受試者未感染過結核桿菌，則注射局部無變態反應發生。
結核菌素是結核桿菌的菌體成分，有兩種，舊結核菌素（old tuberculin，OT）是柯赫（R.Koch）首先發明的。而純蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）則是由塞伯爾（Seibert）首先制備的。結核菌素試驗方法很多，常用的是芒圖（Mantoux）氏法，即將OT或PPD用無菌生理鹽水稀釋成不同濃度，取0.1毫升注射於左前臂掌側前1/3中央皮內（注意：左手），72（48h～96h）小時檢查反應情況，應注意局部有無硬節，不可單獨以紅暈為標准。若注射部位有針眼大的紅點或稍有紅腫，硬節直徑小於0.5厘米，則為陰性反應。若注射部位硬節直徑超過0.5厘米，但在1.5厘米以下，為陽性反應。若注射部位反應較強烈或硬節直徑超過1.5厘米以上，為強陽性反應。陽性反應表明機體對結核桿菌有變態反應，過去曾感染過結核，但不表示有病，因接種過卡介苗的人也呈陽性反應。強陽性反應則表明可能有活動性感染，應進一步檢查是否有結核病。陰性反應表明無結核菌感染，但應考慮以下情況：如受試者處於原發感染早期，尚未產生變態反應，或正患嚴重結核病，機體已喪失反應能力，或受試者正患其他傳染病，在此類情況下，均可暫時出現陰性反應。結核菌素試驗可為接種卡介苗及測定免疫效果提供依據。若結核菌素試驗陰性者應接種卡介苗，接種後若反應轉為陽性，即表示接種已產生免疫效果。結核菌素試驗還可作為嬰幼兒結核病診斷的參考，測定腫瘤患者的非特異性細胞免疫功能及在未接觸過卡介苗的人群中調查結核病的流行情況。

8. 如何用PCR技術檢測結核桿菌

結核桿菌可以導致全身性疾病，特別是在發展中國家，其發病率較高，危害性極大.近幾年結核桿菌的變異性較大，對抗癆葯物的耐葯性增加，從而使結核病的發病大幅度增高.雖然傳統的塗片抗酸染色、細菌培養以及胸片檢查對大部分結核能作出正確的診斷，但對某些病人亦可造成誤診或漏診;動物接種雖特異性較高，但因時間較長，不能滿足臨床快速診斷的需要.近幾年也出現了幾種快速診斷方法，但也存在較大的缺陷，如短期培養後抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測BACTEC培養瓶中被培養標本所分泌的抗原，該方法可在BACTEC瓶本身鑒定出細菌之前，結合ELISA和塗片抗酸染色有效地鑒別典型和非典型分枝桿菌，敏感性較高，但存在培養時間長，重復性尚差的缺點.另一種是短期培養後核酸探針雜交法，即用特異性DNA探針與BACTEC瓶中培養的細菌染色體DNA雜交.該方法能有效地防止培養的假陰性結果，但卻易發生假陽性結果，加之採用的方法較為復雜和繁瑣，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近來已較少應用.上面兩種方法都要藉助細菌培養來進行，雖然在時間上比傳統培養大大縮短，但缺乏快速診斷的優勢.近幾年興起的PCR方法基本實現了快速、靈敏、准確地診斷結核的目的，並且該方法正趨於常規化地應用於臨床一般實驗室.應用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性DNA引物.該引物所引導的DNA擴增序列應是結核桿菌獨有的，且是結核桿菌的保守序列，這樣才能保證檢測結果的特異性.PCR方法的另外幾個關鍵因素是:①DNA提取，即對有限的結核桿菌應盡量地將其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR產物的檢測方法，即將PCR產物進行快速、靈敏、安全、准確的檢測.

一、結核桿菌DNA的提取

在該技術上，目前仍無一種統一常規化的方法.現有各方法都存在著提取DNA不足的缺點，因此，敏感性受到影響.現在主要的細菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性劑法;②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;③反復凍融法;④超聲波法;⑤溶菌酶加表面活性劑法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌體的溶液，然後用乙醇從抽提後的溶液中沉澱DNA.有的學者將硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有機相的界面更牢固，這樣不但能減少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌體釋放出的DNA，該二氧化硅用70%乙醇洗滌，而後乾燥，最後用雙蒸水洗脫(55℃).有報道認為該方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的學者發現未預裂解的結核桿菌直接煮沸進行PCR的效果與預先處理的相仿，提示結核桿菌不預裂解也可直接進PCR.但加入的菌數應<約1000個，否則細菌蛋白會對PCR產生抑製作用.

二、引物的設計

根據不同型結核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內進行引物設計.

(一)編碼結核桿菌抗原的基因序列

1.編碼65-KDa蛋白抗原的基因序列:結核桿菌65-KDa蛋白抗原為存在於所有分枝桿菌細胞壁中的熱休克蛋白，也是一種交叉反應蛋白.所以依據該序列設計合成的引物，PCR能擴增出所有分枝桿菌的靶DNA片段，沒有屬內特異性.這種PCR較適用於結核病高發區大規模篩選和流行病普查.另外，對65-KDa蛋白基因的PCR擴增產物進行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准確地檢測出結核桿菌的屬內歸屬.

2.編碼MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白為結核桿菌復合群(MTBC，包括人型結核桿菌、牛型結核桿菌、BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)所特有.根據該蛋白的基因序列設計的引物進行PCR，對MTBC模板DNA顯示出高的特異性.

3.編碼38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:該序列僅存在於人型和牛型結核桿菌.採用在此基因內設計合成的引物和探針進行PCR，只能擴增人型和牛型結桿菌的DNA序列，能檢出少至10個結核桿菌的純化DNA.

4.編碼32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝桿菌的一種分泌蛋白，由它的基因序列設計的引物和探針進行PCR，可以特異地檢測出分枝桿菌的DNA片段，能檢測出50fg的純化DNA，相當於10個結核桿菌.

5.編碼MPB70抗原的基因序列:MPB70為牛型結核桿菌所特有，由該基因序列設計的引物進行PCR，對牛型結核桿菌的檢測具有高度的特異性和敏感性.

(二)結核桿菌基因組重復序列

1.克隆DNA序列:目前所應用的DNA序列都是MTBC所特有，拷貝數在10個以上，包括亞克隆重組質粒pPH7301和克隆質粒PMTb4，分別含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根據這些基因序列設計的引物，其檢出限在20個結核桿菌以下.

2.插入序列:結核桿菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它們僅見於MTBC.這兩種插入序列在基因組中的拷貝數為1--20個，選擇插入序列作為擴增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性.尤其是IS6110，是目前進行臨床PCR檢測的首選區段.

(三)人型結核桿菌特異序列

mtp40是人型結核桿菌特異性DNA片段，Portillo等選擇mtp40作為靶序列，用PCR檢測結核桿菌，結果只能擴增人型結核桿菌DNA，敏感性達到10fg純化DNA量.

(四)分枝桿菌dnaJ基因

該基因為分枝桿菌共有，但種間又存在差別，在該基因序列內設計合成的引物和探針用於PCR檢測，能檢出50fg的純化分枝桿菌DNA，相當於10個結核桿菌.並可用於區分結核桿菌和非典型結核桿菌的鑒別診斷.

(五)rRNA序列

用「通用」引物在逆轉錄酶作用下，將16SRNA逆轉錄合成cDNA，然後對cDNA進行PCR擴增，檢出限達0.1fg化的結核桿菌rRNA.臨床標本中少至10個結核桿菌亦可被檢出，該方法由於加了一步反轉錄過程相對增加了難度，臨床一般少用.

三、PCR產物的檢測方法

通常PCR產物的檢測方法是經瓊脂糖電泳後，用溴化乙錠染色，然後在紫外燈下觀察或進一步採用標記的DNA探針雜交.為了進一步提高檢測的靈敏度，現多在引物和探針的標記上進行改進.由於放射性標記物的危害性，現多採用非放射性標記，如生物素、熒光素、酶及化學發光劑.Wilson等在巢式PCR的內側引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基.PCR產物上的生物素和附著在微型滴定板表面的生物素蛋白結合，使PCR產物附著在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶結合形成抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶偶合物，利用該偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)測定.另外，還可用吖啶酯標記探針進行雜交，用硼酸鈉將未雜交的探針分解，然後加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最後測量吖啶的光通量.雖然這些方法安全、快速、但其敏感性還需進一步提高，操作還需進一步簡化.

四、PCR檢測結核桿菌的敏感性和特異性

(一)PCR的特異性

PCR特異性的關鍵首先取決於所選靶序列的特異性.現在常用的靶序列有:①分枝桿菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型結核桿菌特異的靶序列，如mpt40序列.引物設計對PCR的特異性也至關重要.引物序列在靶DNA上的專一性、以及引物的特異性和保守性，以及引物本身的許多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特異性和保守性及引物長度等都影響PCR的特異性，另外在設計引物時也要防止出現引物間的過多配對，以免形成過多的引物聚合體，造成非特異性擴增.

PCR擴增TB的特異性除上述先決條件外，也與PCR反應本身有極重要的關系.其中退火溫度是一個重要因素，退火溫度過低時，引物易發生非特異性結合，造成非特異性擴增.由於結核桿DNA中G+C含量高，因此可以適當提高退火溫度，以獲得更高的特異性.

另外，PCR緩沖液的組成，尤其是Mg2+濃度對PCR的特異性也有較大影響，Mg2+濃度過高，會提高PCR產物的產量，但同時也會增加非特異性擴增.

(二)PCR的敏感性

PCR的敏感性很高，一般可以檢測出1～100fg純化的結核桿菌DNA，相當於1～20個結核桿菌，這種敏感性明顯高於塗片法和培養法.PCR還可以檢出培養法易發生失敗的病例，從而大大提高菌陰結核病的診斷.另外PCR檢測TBDNA不受抗癆治療的影響，可以准確觀察抗癆治療的效果，防止血清學方法所帶來的假陰性結果.PCR敏感性受下列因素影響:①擴增靶序列的拷貝數.一般認為，結核桿菌染色體中含靶序列拷貝數越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在結核桿菌染色體中只有一個，而IS6110序列的拷貝數卻有10～12個，結果PCR敏感性後者比前者高100倍;②PCR的循環次數.在一定程度上，PCR循環次數越多，其敏感性就越高，但要合適.因為，循環次數過多會增加非特異性問題，造成結果判斷上的失誤，產生假陽性結果;③結核桿菌DNA的提取技術.處理標本時首先要富集(如離心)標本中的TB，使單位體積內TB含量變高，從而增加了起始模板數，有利於提高PCR的靈敏性.同時提取過程要盡可能減少抑製成份，並提高DNA的提取率.④PCR產物的檢測方法.雖然DNA探針雜交要比直接電泳法敏感性高得多，但步驟繁瑣，這也是影響PCR臨床應用的原因之一.但一般情況下，直接電泳法的敏感性完全能夠達到檢測的需要.

五.PCR在結核病臨床診斷中的應用

PCR檢測結核桿菌的優點決定了它在臨床上的應用價值和范圍，PCR檢測TB的優點主要表現如下:

1.能早期診斷TB菌血症:在TB感染的早期，特別是在TB病灶通過血源性外傳播時、及在外周血中存在極少量的TB時，PCR就能給於擴增並確診.此外，由於外周血中TB的含量甚微，又沒有新的病灶形成，因而血清學方法和物理方法均難以達到確診的目的，而對這類病灶的早期診斷在臨床治療上具有指導意義，因為早期菌血症是較易控制的，並可以防止繼發性TB病灶的形成.

2.時間短;PCR檢測TB僅需2-4h對於某些培養法難以實施的病例，PCR法則行之有效，同時提高了敏感性和特異性，可以檢測到1個TB菌.

3.有利於鑒別診斷:對於肺結核來說，其中的結核球和成人型原發性結核等，經常易於同肺癌的診斷相混淆.病灶中心部位經常出現既未見TB又未見癌細胞的壞死區.此時塗片檢測常是陰性的.在這種情況下，PCR檢測就顯得特別有效.它不但可以擴增能著色的活菌，還可以擴增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，從而確定這樣的病灶是惡性還是良性.在許多情況下，TB可以導致腦膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.塗片法盡管在診斷上具有直接、簡便的優點，但敏感性差就局限了它的診斷范圍和實用價值.PCR檢測這類標本，可以說極其有效.其極高的特異性和敏感性可以很容易地確定TB性腦膜炎及TB性胸腹水.另外，對於腎結核、泌尿生殖系統結核的診斷，PCR都可以予以完成.

4.抗癆治療的評價:對於抗癆治療效果的評價，以前的方法顯得軟弱無力.而PCR法則可以通過定期檢測，採用定量PCR法確切地評價抗癆葯物的療效及殘存菌的數量和活性度.在體內一般情況下，細菌死後，其蛋白系統很快崩潰，而DNA則能相對較長時間地保存下來.這些DNA在某種情況下又會復活.所以，細胞的死亡最可靠的評價指標是其基因DNA的完全降解.特別是在許多問題未搞清楚以前，更應該以DNA的降解來判定病原體的死與活.從理論上講，PCR擴增結果將是最可靠的療效評價指標.

5.修正以往所謂「正確」的觀念:致病菌與機體的防禦系統是一對激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打擊人體的防禦系統，以便其生存和繁殖.在健康人群和周圍環境中都攜帶或存在有大量的TB，但何時何地才會造成機體致病呢?以往認為TB很少存在於外周血，這主要是因為外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺組織中.但很難讓人相信的是，肺部血管極其豐富，淋巴組織和血管網共同構成人體的細胞外液貯存和交換的場所.所以，二者之間的交換是經常的.這種交換就包括能透過毛細血管壁的致病菌.當然，對於TB來講，大多數細菌將被機體的免疫器官禁固起來.但仍有不少「漏網之魚」，只是以前所用的方法敏感性及特異性均不夠.但在某些情況下，如情緒低落、過度勞累、感冒等情況下，機體防禦系統功能減弱，就會造成致病菌的攻擊發生疾病.所以PCR技術對於評估臨床療效、疫情的檢控、發病機理的探討均有十分重要的意義.

六、PCR在檢測TB中的注意事項

PCR如操作不嚴格會出現假陽性和假陰性結果.

發生假陽性最常見的原因是:樣品間的污染和擴增產物的污染.樣品間的交叉污染最易發生在樣品的處理過程之中.如大家共用一個加樣器、剪刀、位置等，因此在處理活檢標本時，用剪刀剪碎組織塊，每個標本用後，剪刀應在火上燒數分鍾，以徹底清除污染在剪刀上的DNA.對於液態標本的處理，盡可能在同一管子內處理.用具應為一次性的.要解決好擴增物的污染，最佳的方式是減少操作的時間，簡化操作手續並使用一次性離心管及接頭.因為擴增產物的量一般很高，易於污染實驗室任何地方.所以減少打開反應管的次數會降低假陽性的發生率.

9. 試述結核菌素實驗的方法，結果及意義

原理：
結核菌素皮膚反應是遲發型細胞超敏反應。它是抗原（結核菌或卡介苗）進入機體使機體的免疫T淋巴細胞致敏，並大量分化增殖。
當已致敏的機體再次遭受到抗原入侵時，致敏淋巴細胞就會與之結合，引起變態反應性炎症。表現在結核菌素注射部位形成硬結甚至發生水泡、壞死。
結素試驗陽性表明機體曾經受到結核菌感染或接種過卡介苗，也表示機體對結核菌有一定免疫力。但也有少數免疫力低下的人（約5%）呈陰性或因技術原因而呈現假陰性。通常接種卡介苗後，若PPD皮試陰性，說明接種失敗。
結核的免疫特點為「免疫、感染、超敏反應」共存。
判斷：
通常在前臂掌側皮內注射5IU的PPD，經48-72小時檢查局部反應，凡硬結直徑平均〉5㎜為陽性；6-10㎜為+；11-20㎜為++；＞20㎜為+++；局部發生水泡為++++。
意義：
（一）陰性反應
未受結核桿菌感染，或免疫反應窗口期。
（二）陽性反應
說明已受結核桿菌感染，可能有以下幾種情況：
1、結核病患者，但不能作為確診依據；
2、卡介苗接種後，免疫反應已建立；
3、3歲以內未種卡介苗者，提示體內存在結核病灶；
4、非結核分枝桿菌交叉反應。
（三）強陽性反應
1、有助於確診結核病；
2、已感染，未發病者；
3、強陽性人群結核病發病率高，在未找到病變時，可以實施預防性治療；
4、強陽性伴有肺部病灶時，則有利於結核病的診斷。但肺部無病灶時，說明機體處於結核菌敏感狀態。

10. 牛如何檢測結核病

診斷牛結核的有效方法是用牛型結核菌素對牛實施皮內注射法和點眼法檢疫，每次檢疫各做兩回，任何一種方法是陽性反應，即為牛結核菌素反應陽性牛。
（1）皮內注射法。不足3月齡的小牛於肩胛處，其他牛於頸部上中1/3部交界處皮內注射結核菌素，具體劑量，3月齡以下牛0.1毫升，3月齡至1歲的牛0.15毫升，1歲以上的牛0.2毫升。注射後經48～72小時觀察注射部位的反應。如果注射局部腫脹面積達35毫米×45毫米以上，或注射前的皮厚差在8毫米以上，判為結核菌素陽性反應。
（2）點眼法。將結核菌素點入牛眼內3～5滴，約0.2～0.3毫升，於3、6、9和24小時觀察反應。點眼後出現膿性眼眵，均為結核菌素陽性反應。