絮狀免疫沉澱實驗常用操作方法

⑴ 沉澱反應的介紹

免疫沉澱反應(Immunoprecipitation)主要用於抗原或者抗體的定性檢測。其原理是指可溶性抗原與相應抗體在有電解質存在的情況下，按適當比例所形成的可見沉澱物現象。據此現象設計的沉澱實驗主要包括絮狀沉澱試驗，環狀沉澱試驗和凝膠內的沉澱試驗。凝膠內的沉澱試驗依所用的實驗方法又可分為免疫擴散實驗和免疫電泳技術2類。

⑵ 免疫沉澱法(IP)的原理及方法步驟

原理就是溶液中的離子強度不同時，不同蛋白質的溶解度不同，步驟就是不斷加硫酸銨…以血漿為例：加到鹽濃度20~30%時纖維蛋白原沉澱，再加到濃度50%時球蛋白沉澱，飽和時清蛋白沉澱…

⑶ 免疫沉澱的實驗步驟

（1）收獲細胞，加入適量細胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上或者4℃裂解30min,
12,000g離心30
min後取上清；
（2）
取少量裂解液以備Western
blot分析，剩餘裂解液將1μg相應的抗體和10-50
μl
protein
A/G-beads加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；
（3）免疫沉澱反應後，在4°C
以3,000
g速度離心5
min,將protein
A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein
A/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最後加入15μl的2×SDS
加樣緩沖液，沸水煮10分鍾；
（4）SDS-PAGE,
Western
blotting或進行質譜分析。

⑷ 常用蛋白質沉澱方法有哪些有哪些應用實例

1、鹽析法：此方法並未破壞蛋白質天然狀態，沉澱出的蛋白質可不變性，所以鹽析法是分離制備蛋白質或蛋白類生物制劑的常用方法2、有機溶劑沉澱法：通過破壞蛋白質的水化膜而使蛋白質沉澱，此方法在常溫下可使蛋白質變性，低溫下可使變性速度減慢3、重金屬鹽沉澱法：可與蛋白質結合形成不溶於水的蛋白質沉澱，引起蛋白質變性。

⑸ 染色質免疫共沉澱的一般流程

ChIP 的一般流程：
甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA，結合抗體-靶蛋白-DNA復合物，並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。
在PCR分析這一塊，比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向於Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做晶元分析，做法在ChIP的基礎上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據公司的要求來准備樣品）。
具體操作流程：
第一天：
（一）、細胞的甲醛交聯與超聲破碎。
1、取出1平皿細胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養基共有9ml）。
2、37攝氏度孵育10min。
3、終止交聯：加甘氨酸至終濃度為0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸於平皿中。混勻後，在室溫下放置5min即可。
4、吸盡培養基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。
5、細胞刮刀收集細胞於15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預冷後2000rpm 5min收集細胞。
6、倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。假設MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800ul。
7、超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。
（二）、除雜及抗體哺育。
8、超聲破碎結束後，10000g 4℃離心10min。去除不溶物質。
留取300ul做實驗，其餘保存於-80℃。
300ul中，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65℃處理3h解交聯，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。
9、在100ul的超聲破碎產物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉混勻1h。
10、1h後，在4℃靜置10min沉澱，700rpm離心1min。
11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉過夜。
（三）、檢驗超聲破碎的效果。
取100ul超聲破碎後產物，加入4ul 5M NaCl，65℃處理2h解交聯。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。
第二天：
（一）、免疫復合物的沉澱及清洗。
12、孵育過夜後，每管中加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃顛轉2h。
13、4℃靜置10min後，700rpm離心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉澱復合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉10min，4℃靜置10min沉澱，700rpm離心1min，除去上清。
洗滌溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.LiCl wash buffer-one wash
d.TE buffer-two wash
15、清洗完畢後，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul10%SDS，100ul 1MNaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉15min，靜置離心後，收集上清。重復洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
16、解交聯：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。
混勻，65℃解交聯過夜。
第三天：
（一）、DNA樣品的回收
17、解交聯結束後，每管加入1ul RNaseA（MBI），37℃孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5MEDTA，20ul 1MTris.HCl（PH6.5），2ul 10mg/ml蛋白酶K。
45℃處理2h。
19、DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶於100ul ddH2O。
（二）、PCR分析

⑹ Ascoli沉澱實驗是怎樣的

vAscoli試驗（炭疽熱沉澱反應）：
炭疽桿菌菌體多糖抗原能耐熱、耐腐敗，對於不適合進行炭疽芽胞桿菌培養的陳舊標本或已腐敗的屍體臟器標本，經長時間煮沸，仍可與相應免疫血清(抗體)發生沉澱反應。
常用於皮革檢疫。