peg方法融合細胞常用濃度

⑴ 細胞融合的融合方法

同種細胞在培養時2個靠在一起的細胞自發合並，稱自發融合；異種間的細胞必須經誘導劑處理才能融合，稱誘發融合。
仙台病毒法融合
①兩種細胞在一起培養，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞
膜上。並使兩細胞相互凝聚；
②在37℃中，病毒與細胞膜發生反應，細胞膜受到破環，此時需
要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；
②細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP；
④融合成巨大細胞，仍需ATP。
聚乙二醇（PEG）法
聚乙二醇（PEG）結構為：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大於200小於6000者均可用作細胞融合劑。PEG經高壓滅菌後，與溫熱的Engle氏液混合。一般選用分子量為4,000，常用濃度為50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。
電融合法
在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發生改變，使異種細胞粘合並發生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。
優點：融合率高、重復性強、對細胞傷害小；
裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；
免去PEG誘導後的洗滌過程、誘導過程可控性強。
離心振動
物理方法之一，使用離心機等機器實現細胞之間的融合。

⑵ peg介導的細胞融合率受哪些因素影響

細胞膜有內外兩層，細胞融合首先發生在外層，然後再到內層，由此就出現了兩種融合通道，細胞體內物質通過這兩種通道轉移。病毒膜與目標細胞融合時，只出現一種融合通道，即導致融合的基因只能在病毒中找到，而在目標細胞中卻找不到。

通過EFF-1發生的細胞融合則是一個雙向融合過程，需要EFF-1出現在兩個相互融合的細胞中。

理論上說任何細胞，都有可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對於種質資源的開發和利用具有深遠的意義。融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。

體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發生重組，從而產生新的核外遺傳系統。淋巴細胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。

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有性繁殖時發生的精卵結合是正常的細胞融合，即由兩個配子融合形成一個新的二倍體。而細胞融合為在自然條件下或用人工方法（生物的、物理的、化學的）使兩個或兩個以上的細胞合並形成一個細胞的過程。

其中人工誘導的細胞融合，在六十年代作為一門新興技術而發展起來。由於它不僅能產生同種細胞融合，也能產生種間細胞的融合，因此細胞融合技術目前被廣泛應用於細胞生物學和醫學研究的各個領域。

自發條件下或人工誘導下，兩個不同基因型的細胞或原生質體融合形成一個雜種細胞。基本過程包括細胞融合導致異核體的形成，異核體通過細胞有絲分裂導致核的融合，形成單核的雜種細胞。有性生殖時發生正常的細胞融合，即由兩個配子融合成一個合子。

⑶ 聚乙二醇融合法

具體操作過程如下：取等量、密度相近的兩種不同原生質體懸浮液，在玻璃容器內混合均勻，取150μL左右的原生質體懸浮液滴在蓋玻片上，緩慢加入450μL左右的PEG溶液，放在2030攝氏度條件保溫培養0.51h，然後用原生質體培養介質將原生質體漂洗幾遍以除去PEG，再將原生質體樣品重新懸浮在培養介質中。
聚乙二醇法（PEG）為我國學者高國楠首創，是最成功的原生質體融合技術。PEG作為一種高分子化合物，由於PEG分子中醚鍵的存在使其分子末端帶有微弱負電荷，能與水、蛋白質、糖等極性物質的正極形成氫鍵。當PEG分子足夠長時，可作為鄰近原生質表面之間的分子橋而使之粘連。PEG也能連接Casuperscript2+superscript等陽離子，Casuperscript2+superscript可在一些負極化基團和PEG之間形成橋，因而促進粘連。
在洗滌過程中，連接在原生質體膜上的PEG分子可被洗脫，這樣將引起電荷的紊亂和再分布或使膜表面局部脫水，或改變構型使原生質類脂「液態」化而引起融合。PEG法已經廣泛地用於原生質體融合，因為它能得到較高的異核體產率，對大多數細胞的毒性都很低，利於形成雙核異核體。
PEG促融合是非特異的，因此對種間融合、基因間融合都是有用的。PEG法的缺點是對原生質體有一定毒害，而且融合率一般較低，不超過1%。

⑷ 細胞融合的方法有哪些

一、細胞融合的方法有三種：生物方法、化學方法、物理方法。
二、細胞融合也稱細胞雜交 , 是指細胞通過介導和培養, 在離體條件下用人工方法將不同種的細胞通過無性方式融合( 合並) 成一個核或多核的雜合細胞的過程。體細胞融合後可形成四倍體或多倍體細胞，由此形成的雜交細胞，其特性會有很大的變化。
三、化學誘導融合1.鹽類融合法。此法是應用最早的誘導原生質體融合的方法。鹽類融合劑對原生質體的破壞小。今後研究應提高其融合率 ,使其對液泡化發達的原生質體能夠誘發融合。2高鈣和高pH值融合法。高 Ca2+和高pH值可以誘發融合。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問題。3、聚乙二醇融合法(PEG法) 。1974年發現的聚乙二醇(PEG)使不同科屬的植物原生質體之間都可以融合，融合率可達30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結合，導致細胞脫水而發生質膜結構的變化，從而引起細胞融合。為了發揮PEG促進細胞融合的效力，必須採用較高的濃度(40%～50%，分子量為6000)，但PEG在高濃度下，細胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是PEG融合技術的關鍵。影響原生質體融合的因素很多。特別是環境中的陽離子存在，融合時的pH 也對原生質體融合有較明顯的影響。一般來講鈣、鎂離子有助於融合。如有鈣離子存在時，可得到較高的融合率。但在缺乏鈣離子時，若pH 較低，融合頻率也較高。這是因為鈣離子和帶負電荷的PEG與細胞膜表面分子相互作用，使原生質體帶電，彼此易於附著發生凝集所致。PEG誘導細胞融合由於具有容易制備和控制、活性穩定、使用方便等特點，在細胞融合領域取得了可喜的成績，大量的研究仍採用此法。雖然PEG作為融合劑有很多成功的報道，但存在著對細胞損傷大、殘存有毒性、融合率較底及經驗性大等缺陷。
四、 物理誘導融合1。細胞電融合技術細胞電融合是以脂質膜和脂質一蛋白質膜的電學性質為基礎的，以雙向電泳和電子擊穿細胞質膜的聯合作用為手段，和細胞電注射構成一對互補技術。在短時間強電場的作用下，細胞膜發生可逆性電擊穿(Reverisb leb reakdown)，瞬時失去其高電阻和低通透特性，然後在數分鍾後恢復原狀。當可逆電擊穿發生在兩個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導他們的膜相互融合，從而導致細胞融合。細胞融合分為兩步：第一步是建立細胞間接觸(cell-to-cell contact) ； 第二步，接受區膜結構受擾動而紊亂，然後恢復並融合。根據其誘導細胞接觸的性質，分為特異性和非特異性兩大類。非特異性細胞電融合法是指在進行細胞電融合時，無法排除親本細胞的自體融合而只進行雙親本間的細胞雜交融合。主要原因是細胞間的相互接觸是無選擇性的，是非特異性細胞聚集。非特異性電融合技術包括細胞物理聚集電融合法和細胞化學聚集電融合法。細胞融合所必需的兩個步驟為：①細胞間接觸；②接觸區的膜結構受到瞬間擾動而導致融合。只要其中的任意一步有特異性，就能形成特異性的細胞融合。 2.激光誘導法。激光誘導細胞融合術是利用激光微束對相鄰細胞接觸區的細胞膜進行破壞(或擾動)，可將兩個不同特性、不同大小的細胞在顯微鏡下實現融合。即利用光鑷捕捉並拖動一個細胞使之靠近另一個細胞並緊密接觸，然後對接觸處進行脈沖激光束處理，使質膜發生光擊穿，產生微米級的微孔。這樣，由於質膜上微孔的可逆性，細胞開始變形融合，最終成為一個細胞。使用此技術時，使細胞接觸的方法可用①光俘虜法；②用低濃度的融合劑PEG (5% )使細胞聚法。目前，最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細胞間接觸，即光鑷利用激光高斯光束光場的梯度力把細胞從光束邊緣拉向光束中間，在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時，指向束腰的軸向梯度力要大於沿光束方向的散射力，該梯度力把細胞豎直地拉到激光束腰下方處，從而實現對細胞的操作。 

⑸ 促進動物細胞融合常用的化學誘導劑是什麼

聚乙二醇（PEG）法

聚乙二醇（PEG）結構為：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大於200小於6000者均可用作細胞融合劑。PEG經高壓滅菌後，與溫熱的Engle氏液混合。

一般選用分子量為4,000，常用濃度為50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3調整），分子量小的PEG，融合效應差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。

(5)peg方法融合細胞常用濃度擴展閱讀：

在一般條件下，聚乙二醇是很穩定的，但在120℃或更高的溫度下它能與空氣中的氧發生作用。在惰性氣氛中(如氮和二氧化碳)，它即使被加熱至200～240℃也不會發生變化，當溫度升至300℃會發生熱裂解。加入抗氧化劑，如質量分數為0.25%～0.5%的吩噻嗪，可提高它的化學穩定性。它的任何分解產物都是揮發性的，不會生成硬殼或粘泥狀的沉澱物。

⑹ 植物細胞的誘導融合，物理法是什麼 化學法一般是用（），簡寫為（）做誘導劑

聚乙二醇（PEG）法
聚乙二醇（PEG）結構為：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH,分子量大於200小於6000者均可用作細胞融合劑.PEG經高壓滅菌後,與溫熱的Engle氏液混合.一般選用分子量為4,000,常用濃度為50%,pH8.pH8.2（用10%NaHCO3調整）,分子量小的PEG,融合效應差,又有毒性,分子量過大,則粘性太大,不易操作.

⑺ 原生質體融合的步驟

原生質體融合的程序包括：①標記菌株的篩選；②原生質體的制備和再生（過程見8.1.1）；③原生質體的融合；④融合子遺傳標記的篩選；⑤融合子的鑒定。

8.2.2.1 標記菌株的篩選

進行原生質體融合的親本需要攜帶遺傳標記，以便於融合後重組子的篩選。常用營養缺陷型和抗性作為遺傳標記，也可以採用熱致死、孢子顏色、菌落形態作為遺傳標記。遺傳標記的選擇要根據實際實驗目的來確定。如果原生質體融合的目的是進行遺傳分析，那麼應該採用帶有隱性基因的營養缺陷型或抗性菌株；如果從育種角度進行原生質體融合，由於大多數營養缺陷型菌株都會影響代謝產物的產量，所以在選擇營養缺陷型標記時，應盡量避免採用對正常代謝有影響的缺陷型菌株。

8.2.2.2 原生質體的融合

原生質體融合就是把親株的原生質體在高滲條件下進行混合。在原生質體融合中，誘導融合的方法主要有化學法（PEG促融法）、物理法（包括電融合和激光誘導融合法等）。

僅僅將原生質體等量地混合在一起融合頻率通常是很低的，只有通過加入融合劑例如表面活性劑聚乙二醇（PEG）或特定物理措施例如電擊和激光誘導等，融合頻率才會提高。

（1）PEG促融法：其誘導融合的可能機制是PEG帶有負電荷的醚鍵，與帶負電荷的原生質體相遇後，在Ca²⁺等陽離子作用下形成共同的靜電荷，從而促進異源原生質體的黏著和接合，常用的PEG是相對分子量為4000和6000的兩種。在有鈣離子存在的條件下融合時為鹼性能刺激產生最大的融合頻率，這是因為pH值能夠改變體系的電性狀態，從而影響原生質體的融合。PEG既是融合劑又是滲透壓穩定劑，濃度低於20%會使原生質體破裂而失去穩定性，濃度過高又會引起原生質體收縮而降低融合頻率，因此，融合時PEG的最終濃度常採用30%～40%。由於PEG的加入，原生質體間的黏著強烈地發生，融合就能較長時間有效地進行，所以PEG的處理時間不得太長。此外，PEG在高濃度下有毒，因此也要求融合時間不宜過長。

（2）電融合法：其原理是在短時間強電場的作用下，當原生質體被置於電導率很低的溶液中時，電場通電後，電流即通過原生質體，使原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串，原生質體成串排列後，立即給予高頻直流脈沖，細胞膜發生可逆性電擊穿，瞬時失去其高電阻和低通透性，然後在數分鍾內恢復原狀。當可逆電擊穿發生在兩個相鄰細胞的接觸區時，即可誘導它們的膜相互融合，從而導致細胞融合。電融合是以空間定向，時間同步的可控方式來實現原生質體的融合，從而改變了PEG融合的隨機過程。該法的優點是融合頻率高，無化學毒性，操作簡便，可在顯微鏡下進行，具有極強的可操控性。

（3）激光融合法：其原理是先讓細胞或原生質體緊密貼在一起，再用高峰值功率密度激光照射接觸處，從而使質膜擊穿或產生微米級的微孔，質膜上產生微孔是一個可逆的過程，質膜恢復的過程中細胞連接微孔的表面曲率很高，使細胞處於高張力狀態，此時細胞由啞鈴形逐漸變為圓球狀，進而細胞發生融合。該法的優點是毒性小，損傷小，具高度選擇性；缺點是操作技術難度大，所需設備昂貴復雜，因此很難被推廣應用。

8.2.2.3 融合子遺傳標記的篩選

原生質體融合後，融合子的選擇方法是使原生質體融合技術得以應用的關鍵。以A和B細胞融合來說，可能會形成AA，AB及BB 三種融合形式。而要篩選出的是AB，即具有A細胞核B細胞的兩個遺傳標記就可以確定其為融合子。因此，就可以通過A和B細胞所分別具有的選擇性遺傳標記，在選擇培養基上挑出融合子。但是，由於原生質體融合後會產生兩種情況，一種是真正的融合，即產生雜合二倍體或單倍重組體；另一種是暫時的融合，形成異核體。兩者均可以在選擇培養基上生長，一般前者較穩定，而後者則是不穩定的，會分離成親本類型，有的甚至可以以異核狀態轉接幾代。因此，要獲得真正的融合子，必須在融合原生質體再生後，進行幾代自然分離、選擇，才能加以確定。融合子的篩選是融合過程的關鍵。下面列舉幾種常見的篩選方法。營養缺陷型標記篩選融合子、抗葯性標記篩選融合子、熒光色素標記篩選融合子、滅活原生質體標記篩選融合子、利用雙親對碳源利用不同而篩選融合子和利用某些特殊生理特徵作為標記篩選融合子等方法篩選。

8.2.2.4 融合子的鑒定

融合子篩選出後，還要對其進行鑒定。常用的鑒定方法有菌體或孢子形態、大小的比較，同工酶電泳譜帶的比較，酶活性的測定，DNA含量的比較，對結構蛋白及非基因直接編碼的次生代謝產物的分析，對染色體穩定性的研究等。劉玲等（2007）採用酯酶同工酶電泳對f1和f2融合子進行鑒定，融合子有不同於親本的新酶帶出現，融合子菌落呈現新的性狀，菌落形態、顏色、菌絲形狀都與親本部分性狀相似，又存在差異，並且菌株生長速度也不同於雙親本，在生理生化性狀上與親本存在明顯的差異，這說明融合子f1、f2是融合雙親性狀的新菌株。

⑻ 影響PEG融合的因素

答：1. PEG的分子量與濃度: 細胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高, 對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實驗時常常採用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。2. PEG的pH值: 經驗證，PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。3. PEG的處理時間: 處理時間越長，融合效果越好, 但對細胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限制在1分鍾之內。本實驗中細胞融合後無需繼續培養, 故處理時間可適當放寬至數分鍾。4. 融合時的溫度: 由於生物膜膜的流動性與溫度成正比，故細胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果, 在細胞可能承受的溫度范圍內可適當提高處理的溫度。對於哺乳動物的細, 一般採用的溫度為38~40℃。