常用重組質粒轉染的方法有

① 重組質粒是如何導入受體細胞的

各種方法。
一般大腸桿菌用CaCl2轉染法。
動物或植物可以採用脂質載體，基因槍，電擊，顯微注射，花粉管通道，病毒轉染等方法

② 重組dna技術包括哪些主要步驟

重組DNA技術主要包括四個步驟：提取目的基因、目的基因與運載體結合、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測和表達。

1、提取目的基因

獲取目的基因主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。直接分離基因最常用的方法是「鳥槍法」，又叫「散彈射擊法」。

2、目的基因與運載體結合

目的基因與運載體結合的過程實際上是不同來源的DNA重新組合的過程，是基因工程的核心。

3、將目的基因導入受體細胞

用人工方法使體外重組的DNA分子轉移到受體細胞，主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。目的基因導入受體細胞後，就可以隨著受體細胞的繁殖而復制，由於細菌的繁殖速度非常快，在很短的時間內就能夠獲得大量的目的基因。

4、目的基因的檢測和表達

目的基因導入受體細胞後，是否可以穩定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程。

(2)常用重組質粒轉染的方法有擴展閱讀

重組DNA技術是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然後轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意願穩定遺傳並表達出新產物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術的三大基本元件。

重組DNA技術使用的酶有限制性核酸內切酶、DNA連接酶。常用的載體有質粒載體、噬菌體載體、Ti質粒、人工染色體。

③ 重組質粒導入兔的成纖維細胞的方法

重組質粒導入兔的成纖維細胞的方法是顯微注射法。迄今為止，顯微注射技術是轉基因動物中採用最多，也是最為有效的一種將目的基因導入動物細胞的方法。

④ 質粒的轉換的方法有哪些質粒轉化後如何篩選

轉化的方法：最常用的是感受態法，包括熱激和電轉化等，轉染不是轉化，這是不同的概念。

轉化後，可以根據質粒上帶有的某種特殊基因的表達來鑒定菌落，最常用的有：抗葯性基因的表達，比如質粒帶有氨苄抗性基因，能在AMP平板上長的一般可以初步判斷為轉化成功的菌；還有就是顯色篩選，比如質粒上的LacZ基因表達，間接促使添加了X-gal的培養基變藍，綠色熒光蛋白基因表達後菌落發熒光等。

⑤ 將重組DNA導入細胞內有哪些方法它們的原理是什麼

(1)將重組質粒導入原核細胞稱轉化，通常用氯化鈣法使大腸桿菌細胞處於感受態，從而將外源DNA導入細胞。另一個常用方法是用脈沖高壓電瞬間處理，使外源DNA高效導入細胞，稱為電穿孔法。
(2)將重組體DNA包裝成噬菌體，使外源基因導入宿主細胞稱轉導，在適宜條件下使轉化率提高。
(3)將外源基因導入動物細胞常用方法有磷酸鈣轉染技術，電穿孔轉染技術，脂質體載體法，DEAE-葡聚糖轉染技術，顯微注射法等。將外源基因導入植物細胞常用方法是用Ti質粒將外源基因導入植物的外植體，也可將植物細胞的細胞壁消化，再用將外源基因導入動物細胞常用方法將外源基因導入原生質體，再誘導產生細胞壁。還有一個方法，是用基因槍將外源DNA射入植物組織或細胞。

⑥ 質粒轉化步驟

質粒的轉化，滿滿干貨
原理：在受體細胞經過化學試劑或者電擊處理等方法處理後，受體細胞的膜通透性發生改變，質粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進入到細菌體內而實現擴增。

感受態細胞：是指細胞自然或者經過誘導處於容易吸收外源DNA的一種生理狀態。在基因工程中，用於轉化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導入外源DNA進行切割）一般通過誘導的方式實現。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。

質粒的轉化主要包含

Ⅰ感受態細胞制備

Ⅱ質粒DNA轉化

Ⅲ質粒DNA的提取

（Ⅰ）感受態細胞制備

1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個單菌落，接種於3ml LB培養基的試管中，37℃振盪培養過夜。

2）將該菌懸液按照1:100轉接到液體培養基中，100ml，37℃振盪擴大培養，2~3h。當培養液開始渾濁時，間段性測試OD600，在數值為0.3-0.5時停止培養。

3）培養好的菌液轉移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。

4）棄掉上清，管口倒置以便培養液棄除干凈。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣溶液30ml，小心懸浮沉澱細胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率）

6）4℃離心10min（4000r/min）。

7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細胞（冰上放置）片刻，感受態細胞製成。

8）可直接用於實驗，4℃保存。也可分裝長期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。

（Ⅱ）質粒DNA的轉化

1）取100ul新鮮制備的感受態細胞，加入質粒1ul DNA混勻,同時設置對照組（未加質粒，未加受體菌，已知具有轉化活性的DNA）。

冷凍的感受態細胞要在冰上解凍，待管中最後一點冰融化後，迅即加入DNA. 解凍感受態細胞溫度高於0℃，會降低轉化效率。

2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動離心管）。冰浴時間短於30min ,可能影響轉化率。然後迅速冰浴2min。

3）向離心管加800ulLB液體培養基，37℃振盪培養1h（150r/min）。37℃生長1小時能夠對於細胞恢復和抗生素抗葯性表達具有最佳效果。

4）取適當（50ul）的復甦細胞培養液，塗布在含抗性的選擇性培養基上，將培養皿放置在37℃恆溫培養箱中，正置30min。等菌液完全被培養基吸收後，倒置培養皿，在37℃恆溫培養箱中，培養12~16h，出現菌落。

5）菌落結果：

① 無菌落

失敗或者培養條件不充分

② 布滿菌落,

呈苔樣，失敗。可能是抗生素濃度不夠或失敗。出現大菌斑，大多是由於黴菌污染所致

③ 布滿菌落

濃度太高，失敗

④ 出現菌落

符合要求

Ⅲ）質粒DNA的提取

質粒DNA的提取，由於其本身分子量小，一般採用鹼裂解法提取。目前已研發出多種質粒提取試劑盒，實驗操作簡單，只需按照產品操作說明操作即可。不過對於其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實驗過程中的一些問題，或者能夠更好的解決問題。

各廠家提供的試劑盒中試劑不盡相同，一般的提取純化試劑盒，主要包括以下試劑：

A. 細胞懸浮試劑: 主要作用是將菌體細胞懸浮起來。菌體懸浮不完全會導致裂解不完全，質粒的提取純度和得率都會下降。通常需要在裡面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常選用Tris-HCl作為體系中pH穩定緩沖液。EDTA，金屬離子螯合劑可以和細菌體內的金屬離子結合而DNase的活性受到抑制。有的會有葡萄糖，可用來增加溶液粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉澱時間。

B. 細胞裂解試劑：主要作用是裂解細胞，通過鹼溶液的作用破壞細胞膜結構，使其雙層膜結構改變，而導致細胞裂解。一般由一定濃度的NaOH和SDS組成。SDS的作用與後期中和過程中清除掉蛋白質等細胞雜質有關系。此步驟中需要注意的是，鹼溶液的作用時間不能太長，也不可劇烈離心管，反之會導致鹼破壞基因組DNA，導致同等大小的基因組DNA被提純，造成污染。

C. 中和試劑：主要作用使中和掉細胞裂解試劑中的鹼性物質，並去除掉其中的蛋白等雜質物質。組份有醋酸鉀和醋酸，或者乙酸鉀和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多餘的鹽離子。DNA被試劑盒中的提取柱吸附之後，需要用wash buffer 洗脫掉多餘的鹽離子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇對後續酶切和測序反應會有影響，因此在後續洗脫DNA前，必須完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脫Buffer: 主要作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。

1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通過重力的作用，使平衡buffer都流出。

2.細胞收獲：對於高拷貝質粒（培養液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培養液,離心去上清；對於低拷貝質粒（培養液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培養液，離心去上清。

3. 細胞懸浮：加0.4mL的細胞懸浮液(containing RNase A)懸浮細胞，並使其混勻。

4. 細胞裂解：加入0.4mL細胞裂解液，通過上下顛倒帶蓋子管子5次使其輕輕混勻，不要渦旋，之後在室溫下放置5min.

5. 中和：加入0.4mL的中和試劑，立即混合均勻。當大的細胞顆粒被處理後，可能會進行更劇烈的搖動。但是，不要渦旋！~12,000xg離心混合物10min. 如果是採用的4°離心，上清液需要恢復到室溫，再加入到柱子中。

6. 裝柱：吸取步驟5中的上清液到平衡柱中。讓混合液通過重力的作用流出，棄掉流出液。

7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脫柱子量次。每次清洗讓清洗液通過重力的作用流出，棄掉流出液

8. 質粒DNA洗脫：加入0.9mL的Elution Buffer。讓Elution Buffer通過重力的作用流出。不要強行弄出裡面的液體。

9. 質粒DNA沉澱：加入0.63mL異丙醇去析出，混勻，~12,000xg at/4°C離心30min。小心的去掉上清，之後風干10分鍾

10. DNA純化：將管子中的DNA溶解到TE buffer中。將這些溶液轉移到新管中。

重組質粒鑒定的方法：

① 雙酶切後跑電泳；直接DNA電泳可判斷整個DNA重組質粒是否正確。② PCR(插入片段在2kb以下時)，然後電泳。

③ 送公司測序（最為准確的鑒定方式）。

影響轉化效率的因素：

① 細胞狀態和細胞密度: 培養菌最好選用傳代次數少，且保存於-70℃或者-20℃。不要使用經過多次轉接或者保存於4℃環境中培養菌。細胞生長密度以剛進入對數其為最好，可通過檢測培養液的OD600值來判斷，密度過高或者不足，都會影響轉化效率。通常DH5α菌株在OD600的值為0.5左右，細胞密度在5*107個/ml左右比較合適。密度過高或者不足均會影響轉化效率。

② 質粒的質量和濃度：轉化的質粒DNA中，超螺旋狀態的質粒，轉化效率最好。在一定濃度范圍內，轉化的效率與添加質粒的濃度成正比。不過在添加的質粒的量和體積過大的時候，轉化效率也會降低。質粒的分子量越大，通常來說轉化率也會降低。

③試劑的質量：轉化過程中所用的試劑，如氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率。

④防止雜菌和DNA污染：實驗需要在無菌條件下進行，所用的儀器和試劑均需要滅菌處理，並防止在實驗過程中引入其他污染。

⑤培養過程的條件：培養瓶中培養基的量關乎到菌體生長過程中的能量代謝。通常來說厭氧環境做出來的感受態的轉化效率較低。建議500ml三角瓶液體培養基量不超過100ml, 250ml三角瓶液體培養基量不超過50ml. 培養基的pH值要適宜，接種前一般pH值在6.8-7.2，等培養結束後可以再測一下pH值最好在6.5以上（不低於6.0），表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好。培養基中的各種離子和溫度，也對形成好的感受態有關系。

幾種擴增常用感受態細胞：

① 普通骨架載體cDNA產品

DH5α：常用於質粒克隆，可用於藍白斑篩選

TOP10：適用於高效的DNA克隆和質粒擴增，能夠保證高拷貝質粒的穩定遺傳。

TG1: 生長速度快，常用於噬菌體的制備，同時也可用於普通質粒的構建。

CopyCutter：適用於有毒克隆。

② 慢病毒載體質粒：

Stbl3: 是慢病毒載體系統推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率

Stable（NEB）：可用於逆轉錄病毒/慢病毒載體系統擴增。

⑦ 細菌基因轉移與重組的方式有哪些

細菌基因的轉移與重組的方式有轉化、轉導、溶原性轉換、接合。

1、轉化：受體菌直接攝取供體菌游離的DNA段，從而獲得新的遺傳性狀。

2、轉導：以溫和噬菌體為載體，將供體菌的遺傳物質轉移到受體菌中去，使受體菌獲得新的遺傳性狀。

3、接合：是指細菌通過性菌毛將遺傳物質（主要為質粒）從供體菌轉移給受體菌，使受體菌獲得新的遺傳性狀。

4、溶原性轉換：是由於溫和噬菌體的DNA（前噬菌體）整合到宿主菌的染色體DNA後，使細菌的基因型發生改變，從而獲得新的遺傳性狀。

(7)常用重組質粒轉染的方法有擴展閱讀：

細菌基因的轉移與重組屬於細菌變異。細菌從外源取得DNA，並與自身染色體DNA進行重組，引起細菌原有基因組的改變，導致細菌遺傳性狀的改變。

細菌變異現象在臨床上的實際意義:

1、診斷：應注意細菌的變異株，以免誤診，漏診。

2、治療：為提高抗菌葯物療效，防止耐葯菌株的出現與擴散，在治療前應先做葯敏實驗。

3、預防：用人工方法使病原出產生變異，減低毒力，保存免疫原性，制備減霉活疫苗，預防傳染病。

⑧ 將重組質粒導入細菌的最常用方法是

不是 用氯化鈣處理細胞壁（增強通透性）後可直接導入，過程非常簡單。
顯微注射最常用於用於動物細胞，植物可用農桿菌。