基因定點誘變的常用方法是啥

『壹』 基因定點誘變是如何對蛋白質分子進行改造的

定點誘變不如叫定點突變，點突變的意思。在了解蛋白的編碼序列基礎上，改變特定的氨基酸殘基可以使蛋白具有不同的性質。具體做法是對基因改造，對編碼DNA做定點改造，可以用PCR方法，使用合成單鏈DNA引物引入突變；也可以用別的方法，比如M13之類的，很簡單，從試驗到驗證幾天就可以了。

『貳』 基因定向突變的技術的方法和原理

不論是真核生物還是原核生物的突變，也不論是什麼類型的突變，都具有隨機性、稀有性和可逆性等共同的特性。
①隨機性。指基因突變的發生在時間上、在發生這一突變的個體上、在發生突變的基因上，都是隨機的。在高等植物中所發現的無數突變都說明基因突變的隨機性。在細菌中則情況遠為復雜。
②稀有性。突變是極為稀有的，野生型基因以極低的突變率發生突變。
③可逆性。突變基因又可以通過突變而成為野生型基因，這一過程稱為回復突變
。正向突變率總是高於回復突變率，一個突變基因內部只有一個位置上的結構改變
才能使它恢復原狀。
④少利多害性。一般基因突變會產生不利的影響，被淘汰或是死亡，但有極少數會使物種增強適應性。
⑤不定向性。例如控制黑毛a基因可能突變為控制白毛的a+或控制綠毛的a
說白了，隨機性指的是突變的發生是隨機的，何時何地何人是不一定的。
不定向性指的是突變的效果千奇百怪，如同本來是白色的可以變成紅橙黃綠青藍紫等等任何一種顏色都有可能。

『叄』 誘導基因突變的常用方法

誘導基因突變的常用方法：
一、鹼基置換突變
可以通過兩個途徑即鹼基結構類似物的參入和誘變劑或射線引起的化學變化來進行。
①類似物的參入5-溴尿嘧啶(BU）是胸腺嘧啶的結構類似物。它只是在第5位碳原子上以溴原子代替了胸腺嘧啶的甲基（─GH3），並且因此更易以烯醇式出現（圖2）。基因突變
大腸桿菌在含有BU的培養基中培養後，細菌的 DNA中的一部分胸腺嘧啶被BU所取代，並且最後在培養物中可以發現有少數突變型細菌出現，取代BU的量愈大則突變型愈多。突變型細菌在不含有BU的培養基中長久培養時，不改變它的突變型性狀，可是把突變型細菌在含有BU的培養基中培養後，又可以發現少數由於發生回復突變而出現的野生型細菌。BU的誘變作用可以表示。首先在DNA復制過程中酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T鹼基對變為A:BU，在下一次DNA復制中烯醇式的BU*和鳥嘌呤G配對而出現G∶BU鹼基對，最後在又一次復制中鳥嘌呤G和胞嘧啶C配對而終於出現G:C鹼基對，完成了鹼基的置換。這里BU所起的作用是促成這一置換，起促成作用的原因是由於嘧啶的 5位上溴原子代替了甲基後便較多地出現烯醇式的嘧啶。
同一理論還可以用來說明 BU是怎樣誘發 的置換突變或者突變型的回復突變（圖4)
2-氨基嘌呤等其他鹼基結構類似物同樣具有誘變作用。
②葯物或射線引起的化學變化亞硝酸能夠作用於腺嘌呤(A）的氨基而使它變為次黃嘌呤(HX）；可以作用於胞嘧啶（c）而使它變為尿嘧啶（U）。這兩種氨基到酮基的變化帶來鹼基配對關系的改變，從而通過 DNA復制而造成A∶T→G∶C或者 G∶C→A∶T置換。
羥胺只和胞嘧啶發生專一性的反應，所以它幾乎只誘發置換G∶C→A∶T而不誘發A∶T→G∶C置換。此外，pH值低或高溫都可以促使DNA分子失去鹼基特別是嘌呤，導致鹼基置換。
紫外線的照射使 DNA分子上鄰接的鹼基形成二聚體，主要是胸腺嘧啶二聚體T-T。二聚體的形成使DNA雙鏈呈現不正常的構型（見DNA損傷修復），從而帶來致死效應或者導致基因突變，其中包括多種類型的鹼基置換。

二、移碼突變
誘發移碼突變的誘變劑種類較少，主要是吖啶類染料（圖6）。這些染料分子能夠嵌入DNA分子中，從而使DNA復制發生差錯而造成移碼突變。

三、定向誘變
利用重組DNA技術使DNA分子在指定位置上發生特定的變化，從而收到定向的誘變效果。例如將DNA分子用某一種限制性核酸內切酶處理，再用分解DNA單鏈的核酸酶S1處理，以去除兩個粘性末端的單鏈部分，然後用噬菌體T4連接酶將兩個平頭末端連接起來，這樣就可得到缺失了相應於這一限制性內切酶的識別位點的幾個核苷酸的突變型。相反地，如果在四種脫氧核苷三磷酸(dNTP）存在的情況下加入 DNA多聚酶Ⅰ，那麼進行互補合成的結果就得到多了相應幾個核苷酸的兩個平頭末端。在T4接連酶的處理下，便可以在同一位置上得到幾個核苷酸發生重復的突變型。
在指定的位置上也可以定向地誘發置換突變。誘變劑亞硫酸氫鈉能夠使胞嘧啶脫氨基而成為尿嘧啶，但是這種作用只限於 DNA單鏈上的胞嘧啶而對於雙鏈上的胞嘧啶則無效。用識別位點中包含一個胞嘧啶的限制性內切酶處理DNA分子，使粘性末端中的胞嘧啶得以暴露（例如HindⅢ的識別位點是，經限制酶HindⅢ處理後得到粘性末端，中間的這一胞嘧啶便暴露了）。經亞硫酸氫鈉處理後胞嘧啶（c）變為尿嘧啶（U)。通過DNA復制原來的鹼基對C∶G便轉變成為 T∶A。這樣一個指定位置的鹼基置換突變便被誘發。
還可以把人工合成的低聚核苷酸片段引入基因組中，以一定的方式改變某一基因等。

『肆』 基因定位誘變是啥呀

在DNA水平上產生多肽編碼順序的特異性改變稱為基因的定向誘變。利用這項技術一方面可對某些天然蛋白質進行定位改造，另一方面還可以確定多肽鏈中某個氨基酸殘基在蛋白質結構及功能上的作用，以收集有關氨基酸殘基線性序列與其空間構象及生物活性之間的對應關系，為設計製作新型的突變蛋白提供理論依據。一般而言，含有單一或少數幾個突變位點的基因定向突變可選用下列五種策略，而大面積的定位突變則採取基因全合成的方法。

1 局部隨機摻入法

將待突變的靶基因克隆在一個載體質粒的特定位點上，其上游緊接著兩個酶切位點RE1和RE2，它們分別能產生5』和3』突出的單鏈粘性末端。用大腸桿菌核酸外切酶III末端特異性降解經RE1和RE2雙酶切開的重組質粒3』凹端，並通過酶解反應時間控制新生成的單鏈區域大小（單鏈區域越短，突變精度越高）。終止反應後，單鏈區域用Klenow酶補平，底物除四種正常的dNTP外，還包括一種特殊結構的脫氧核糖核苷酸類似物，在缺口填補過程中，該類似物摻入到DNA鏈的一處或多處。隨後再用S1核酸酶處理單鏈末端，並以T4-DNA連接酶連接成環。重組分子轉化大腸桿菌，在體內復制過程中，由於類似物的鹼基配對非特異性，50%的擴增產物分子內部引入了錯配鹼基，並導致位點突變。由這種方法產生的突變體一般含有幾對取代鹼基，而突變的區域則取決於外切酶III末端降解的程度。

2 鹼基定點轉換法

能導致鹼基定點轉換的最簡單方法是使用某些化學試劑在體外誘變DNA分子。通常將質粒DNA或待突變DNA片段用誘變劑處理後，轉化大腸桿菌，構建突變體文庫。最常見的體外誘變劑為亞硫酸氫鈉，在DNA單鏈的情況下，它能特異性地使胞嘧啶殘基脫氨形成尿嘧啶殘基。處理後的DNA單鏈再由DNA聚合酶體外轉化為雙鏈結構，在復制過程中，原DNA分子上的CG鹼基對便轉換成TA鹼基對。從表面上看這種方法所引入的突變並非定點，但如果合適地控制誘變劑的處理條件，便能做到每個DNA單鏈分子只含單一轉換的鹼基，而且其位點隨機分布，這樣即可在樣本龐大的突變體文庫中挑選出在期望位點上突變的重組分子。
除了上述化學誘變外，還可以藉助於酶促合成對DNA分子進行所有可能的鹼基對轉換。其原理是使單鏈DNA在不理想的反應條件下進行體外復制，如較高或較低的離子強度、不平衡的四種核苷酸底物濃度以及缺少從3』至5』核酸外切活性的DNA聚合酶（Taq）等。在體外DNA聚合反應系統中，如果某種核苷酸底物濃度過低，當模板要求該底物時便有可能為其它三種底物所取代，從而導致序列突變。

3 部分片段合成法

如果在待突變的位點上下游含有合適的限制性內切酶識別序列，尤其當多個待突變位點集中分布在該區域時，可考慮直接化學合成這一片段，在此過程中將欲突變的鹼基設計進去，然後以此人工合成的寡聚核苷酸片段置換重組質粒上對應的待突變區域，即可完成基因的定點突變。部分片段合成法特別適用於系統改變功能蛋白的氨基酸序列，並在體內觀察突變位點對蛋白質生物功能的影響，從而確立突變前這些氨基酸殘基對蛋白質結構和功能的貢獻。例如，在大腸桿菌噬菌體433和P22阻遏蛋白分子中，-螺旋-轉角--螺旋結構域與操作子DNA的結合特性就是用上述方法研究的。

4 引物定點引入法

引物定點引入法實質上是一種寡聚核苷酸介導的定點誘變方法，它能在克隆基因內直接產生各種點突變和區域突變。首先將待突變的目的基因克隆在M13-RF DNA載體上，轉化大腸桿菌，挑選重組噬菌斑，從中分離出重組DNA正鏈；人工合成與待突變區域互補的寡聚核苷酸引物，並在此過程中設計引入突變鹼基，然後在較溫和條件下與重組DNA正鏈退火，經DNA體外復制和連接後，雙鏈分子重新轉化大腸桿菌；以上述合成的寡聚核苷酸片段為探針，在嚴格條件下（如將雜交溫度提高5-10℃）雜交篩選含有突變鹼基的噬菌斑，從中分離純化出RF DNA雙鏈分子進行克隆表達。相似地，若要在DNA特定位點上插入或缺失一段，也可設計合成特殊結構的寡聚核苷酸引物，並將之引入待突變區域。但須注意的是欲插入或缺失的DNA片段應小於引物本身的長度，否則退火操作相當困難。
從理論上來講，在DNA體外復制並克隆後，攜帶突變鹼基的噬菌斑應為重組噬菌斑總數的一半，但由於技術上的原因，這種期望的噬菌斑通常只有1～5%。為了特異性富集突變體便於篩選，可將待突變的重組M13-RF DNA分子首先轉化具有t和ung兩個DNA代謝酶基因缺陷的大腸桿菌受體菌株。前者由於不能合成dUTP水解酶，致使細菌細胞內dUTP含量急劇上升，在DNA體內復制時，dUTP部分取代dTTP摻入到DNA新生鏈中；後者為尿嘧啶糖基化酶基因缺陷，這種變異株喪失了切除DNA鏈中脫氧尿嘧啶核苷酸殘基的能力。由該菌株產生的重組M13 DNA正鏈分子中大約有1%的T為U所取代，經體外復制後，再將雙鏈DNA分子導入正常的大腸桿菌受體細胞中。此時，該菌的尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA鏈上的脫氧尿嘧啶核苷酸殘基，使原來的模板鏈降解，而突變鏈因不含U被完整地保留下來。

5 PCR擴增突變法

將待突變的靶基因克隆在一個載體質粒上，重組分子分在含有兩種不同引物的反應管A和B中。在A管內，引物I與克隆基因的區域互補，並含有唯一一個錯配鹼基（即突變位點），引物II則與載體區域完全互補，使得兩個引物的末端位於待突變位點的右側；在B管內，兩個引物均與克隆基因互補，但引物III含有一個錯配鹼基，引物IV則完全互補，兩個引物的末端位於待突變位點的左側。經若干輪PCR擴增反應後，積累的雙鏈DNA產物均為線型平頭分子。將A、B兩管的擴增產物混合變性並退火，只有I-III和II-IV雜合雙鏈呈交叉缺口的環狀結構且含有突變位點，這種分子不經連接可直接轉化大腸桿菌，而其它組合形式的雜合雙鏈則為線型分子，通常難以形成克隆。

『伍』 常用的基因突變檢測方法有哪些

1、焦磷酸測序法

測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。

焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。

焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。

2、微數字聚合酶鏈反應

該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。該方法為絕對定量的方法。

3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。該法一般用於檢測已知的突變位點。

因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。

由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

4、高效液相色譜法

該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。

與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。

5、單鏈構象異構多態分析技術

依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。與測序法相比，靈敏性更高。

『陸』 跪求PCR方法定點誘變示意圖，並附帶說明（詳細），謝謝！

Step1.單一基因經過易錯PCR得到許多隨機突變拷貝（圖中為「DNA隨機突變庫」）

Step2.用限制酶將這些DNA切成許多隨機片段（圖中為「隨機片段庫」）

Step3.這些帶有突變的片段【互為引物和模板】進行PCR擴增，那麼這些突變會積累到子代DNA上。

注意：這一步會將突變傳遞給子代DNA，所以一部分子代DNA中會積累有許多有利突變，即對蛋白質性能的提高有利。

Step4.篩選出含有較多有利突變的子代DNA（圖中表示為「正突變重組子」），去除含有較多不利突變的子代DNA。

Step5.重復上述步驟2~3次，則可以獲得較好的結果。

『柒』 6，dna點突變常用的檢測方法有哪些

基因突變檢測方法：
（1）
pcr-sscp法是在非這性聚丙烯醯胺凝膠上，短的單鏈dna和rna分子依其大街基序列不同而形成不同構象，一個鹼基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈dna在中性條件下會形成二級結構，這種二級結構依賴於其鹼基組成，即使一個鹼基的不同，也會形成不同的二級結構而出刺同的遷移率。由於該法簡單快速，因而被廣泛用於未知基因突變的檢測。
（2）異源雙鏈分析法（ha）
ha法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型dna雙鏈。由於突變和野生型dna形成的異源雜合雙鏈dna在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產生與相應的同源雙dna不同的遷移率。該法與sscp相似，所不同的是sscp分離的是單鏈dna，ha法分離的是雙鏈dna，也只適合於小片段的分析。
（3）突變體富集pcr法（mutant-enriched
pcr）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點，如k-ras基因第12密碼子的bstni位點，第13密古巴子有bgⅰⅱ位點。用鏈續二次的巢式pcr來擴增包括k-ras第12、13密碼子的dna片段，在兩次擴增反應之間用相應的內切酶消化擴增的dna片段，野生型因被酶切而不能進入第二次pcr擴增，而突變型則能完整進入第二次pcr擴增並得到產物的富集。