A. 簡述主要免疫細胞分離方法和分離原理
免疫磁珠法分離細胞原理：
免疫磁珠法分離細胞是基於細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由於不能與連接著磁珠的特異性單抗結合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。
免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法：
陽性分離法－磁珠結合的細胞就是所要分離獲得的細胞
陰性分離法－磁珠結合不需要的細胞，游離於磁場的細胞為所需細胞
一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。
BD™ Imag 磁珠：
· 大小在0.1－0.45mm
· 包被了BD Pharmingen生產的高質量單抗
· 磁珠已為白細胞亞群的陽性和陰性分離法所優化
· 用於BD™ IMagnet direct magnet
將包被了特異性單抗的BD IMag磁珠加入細胞懸液，磁珠特異性地與有相應抗原的細胞亞群結合，通過BD™ IMagnet direct magnet分離得到的連有BD IMag磁珠的細胞可直接用於功能試驗和用流式細胞儀檢測。
缺點：
• 對細胞造成機械壓力，影響其生物學活性，不利於分離後培養
• 純度低
• 容易阻塞FCM的噴嘴
BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分離系統的優點，開發出直徑約200nm中等大小磁珠。
• 技術簡單，分離在普通的試管中完成
• 易於增大細胞用量
• 對細胞溫和，不影響細胞功能及其分離後培養，可直接上流式
• 純度高，回收率高
• 成本低
此外，Mouse lineage panel中biotin標記的抗體還可用於FCM分析細胞表面抗原，以及進行細胞/組織免疫熒光實驗。
BD提供2種免疫磁珠：
· 包被了針對白細胞亞群的單抗的磁珠
· 包被了鏈霉親和素（streptavidin）的磁珠：此種情況下，在實驗系統中加入生物素標記的單抗，磁珠通過streptavidin與生物素標記的單抗結合，單抗與細胞表面相應抗原特異性結合而使細胞被磁珠間接捕獲，從而達到分離。這種磁珠使研究者可根據自己需要選擇生物素標記的各種單抗去分離目的細胞，應用范圍更廣泛，使用更靈活。
不同物種磁珠分離試劑
人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；
小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.
ë 利用Streptavidin連接的磁珠，只需選配biotin標記的所需單抗,就能分離更多種類細胞
新貨聚焦：
現在，BD PMG又推出用於分離小鼠造血幹細胞/祖細胞的新試劑mouse lineage panel。
其中包括5種biotin標記單抗，這些單抗能結合小鼠造血細胞的主要分化系細胞: T、B淋巴細胞，單核/巨噬細胞，粒細胞和紅細胞。將這組試劑與Streptavidin Plus BD™ IMag Particles (557812) 聯合使用，就能通過免疫磁性分離法去除小鼠骨髓造血細胞的主要分化系細胞，從而富集到造血幹細胞和祖細胞（陰性片斷）。
Mouse Lineage Panel（559971）：（5×2ml/vial） 可分離109 Mouse骨髓細胞
1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain)；
2) Biotin-anti-mouse CD11b；
3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220；
4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1)；
5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76)
磁分離細胞的重要指標是：
純度和得率，這取決於磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大小（磁性），然而太大的磁珠會影響細胞活性，也無法直接上流式。
目前市場上有2種磁性細胞分離系統：
* Small particles (≈50 nm) － MACS
* Large particles (1200~4500 nm) －others（如Dynal）
小磁珠 優點：
• 對細胞溫和，不影響分離細胞的後續培養
• 可直接上流式檢測，不影響散射光
缺點：
• 需要很強的磁場來分離細胞
• 分離速度很慢，得率不高
• 需要一次性的分離柱，不能在普通試管進行
• 成本昂貴
大磁珠
• 技術簡單，分離可在試管中完成
• 易於增減細胞用量
• 速度快，得率高
• 成本低
B. 如何分離巨噬細胞與血細胞
你可以嘗試差速離心，巨噬細胞密度應該大於血細胞吧。或者你用濾膜好了，巨噬細胞的體積更大
C. 如何從PBMC中將單核巨噬細胞提出
單核細胞 單核細胞描述：約佔3％，體積大，胞質豐富，染成灰藍色，胞核常呈腎形或馬蹄形，細胞形狀不一，有圓形，多角形等（因數量少，不易找到，可看示教片）
單核細胞是體積最大的白細胞。其細胞核常偏位，呈多形性，如卵圓形、腎形(a)、馬蹄形(b)、不規則形（c）等，常有折疊感(c)；染色質呈疏鬆網狀，著色較淺。胞質較多，嗜鹼性，但因含大量細小的嗜天青顆粒而染成灰藍色，顆粒含過氧化物酶。血塗片，Giemsa染色
無顆粒白細胞的一種。 單核細胞是血液中最大的血細胞。目前認為它是巨噬細胞的前身，具有明顯的變形運動，能吞噬、清除受傷、衰老的細胞及其碎片。單核細胞還參與免疫反應，在吞噬抗原後將所攜帶的抗原決定簇轉交給淋巴細胞，誘導淋巴細胞的特異性免性反應。單核細胞也是對付細胞內致病細菌和寄生蟲的主要細胞防衛系統，還具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力。淋巴細胞則為具有特異性免疫功能的細胞。T淋巴細胞主要參與細胞免疫反應而B淋巴細胞參與體液免疫反應。
外周血單個核細胞 外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。體外檢測淋巴細胞首先要分離外周血單個核細胞，目前主要的分離方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度離心法，因為血液中各有形成分的比重存在差異，因此得以分離。紅細胞和粒細胞密度大於分層液，同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積於管底。血小板則因密度小而懸浮於血漿中，唯有與分層液密度相當的單個核細胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸。本法分離單個核細胞純度可達95％，淋巴細胞約佔90％～95％，細胞獲得率可達80％以上，其高低與室溫有關，超過25℃時會影響細胞獲得率。
D. 檢測巨噬細胞的功能還有什麼方法
巨噬細胞功能檢測方法：
人巨噬細胞可從外周血或經斑蝥激發的皮皰液中獲取，也可從肺灌洗液或患者腹膜透析液中分離，但操作繁鎖，得量不多。許多實驗室在進行基礎或配合臨床研究巨噬細胞功能及其與疾病的關系、或篩檢免疫增強葯物和探討其作用機制時，常選用小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，常用的檢測方法如下。
（一）炭粒廓清試驗
正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%炭粒醫學教|育網搜集整理，脾巨噬細胞約吞噬清除10%炭粒，據此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時間反復取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。
（二）吞噬功能的檢測
巨噬細胞具有較強的吞噬功能，實驗室常用比細菌大的細胞性抗原作為被吞噬顆粒，如雞紅細胞。其檢測原理是將受檢細胞與適量的顆粒抗原混合後，置
37℃保溫0.5～1h，其間時加振搖，最後離心取測定細胞製成塗片，染色鏡檢，分別計數出吞噬百分比和吞噬指數。各實驗室應根據自己的條件建立正常參考值。
（三）巨噬細胞溶酶體酶的測定
巨噬細胞富含溶酶體酶，如酸性磷酸酶、非特異性酯酶、溶菌酶等，測定這些酶的活性也是衡量巨噬細胞功能的實用指標之一。
1.酸磷酸酶的測定
（1）硝酸鉛法：本法優點是用普通試劑，價格便宜，一般實驗室均有條件做，封片後可較長時間保存，並可用電子顯微鏡研究觀察細胞的超微結構。缺點是細胞必需固定，而且固定條件要求嚴格，如處理不當酶活性易消失，反應步驟也較多。
該法基本原理是在適當的酶性條件下，巨噬細胞內的酸性磷酸酶能使β甘油磷酸鈉水解成磷酸鹽後，後者與硝酸鉛反應產生磷酸鉛，而磷酸鉛再與硫酸銨反應則形成黑色硫化鉛，沉積在胞漿內酸所在處，顯示棕黑色顆粒。酶活性強弱可根據顆粒的數量和粗細不同而分級判斷，顆粒數量少則細的為+，顆粒多而粗的為++，顆粒很多且很粗的為+++.
（2）偶氮法：本法操作簡便，反應液中的底物α-萘磷酸鈉被酸性磷酸酶分解後，形成萘酚和磷酸鹽，而萘酚結構中的羥基（-OH）鄰近的活潑碳原子，立即與偶氮染料起反應，而產生鮮艷的棕色沉積在酶所在處，缺點是封片後保存時間短。
2.非特異性酶的測定該酶比較穩定，酶活性喪失較慢，細胞經塗片乾燥，置室溫至少可保存半天至一天，因此特別有利於臨床檢驗室採用。
常用α-萘醋酸法，該酶可將-萘醋酸分解成萘酚和醋酸，萘酚迅速與偶染料結合，形成有色反應物而沉積。
（四）巨噬細胞促凝血活性測定
激活巨噬細胞可產生一種與膜結合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經37℃預溫的正常兔血漿和CaC12混合液，加入經粘附單層巨噬細胞的試管中，移置37℃，即時記錄血漿凝固時間。實驗證明當巨噬細胞與LPS、腫瘤相關抗原或HbsAg等溫育後，可見血漿凝固時間明顯縮短。本法穩定方便，也是檢測不同疾病患者巨噬細胞功能的指標之一。
E. 免疫細胞分類及分離方法是什麼
免疫細胞（immune cell）主要是指能識別抗原，產生特異性免疫應答的淋巴細胞等。淋巴細胞是免疫系統的基本成分，在體內分布很廣泛泛，主要是T、B淋巴細胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、發生特異性免疫應答。除T淋巴細胞和B淋巴細胞外，還有K淋巴細胞和NK淋巴細胞，共四種類型。T淋巴細胞是一個多功能的細胞群。除淋巴細胞外，參與免疫應答的細胞還有漿細胞、粒細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞及單該吞噬細胞系統的細胞。免疫細胞分離技術
1、淋巴細胞的分離
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋後，沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細胞分離液的試管內(注意勿與分離液混合，然後2000r／min 水平離心20min，管內分為4 層，自上而下依次為血漿，單個核細胞，顆粒白細胞、紅細胞(圖2—1)。用毛細管伸至單個核細胞層中(位於細胞分離液與血漿的界面上)，沿管壁輕輕吸出全部細胞。然後用Hanks 液洗兩次，每次2000r／min 離心10min，最後用RPMI l640 培養液將細胞配成2×106／m1 的細胞懸液備用。
2、T 細胞及B 細胞的分離
將淋巴細胞懸液通過尼龍棉柱，B 細胞粘附於尼龍棉上，T細胞則不粘附，先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱，流下的細胞懸液含有豐富的T 細胞。然後用力反復擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細胞，並用少量的RPMI l640 培基洗脫，此細胞懸液含有豐富的B 細胞。尼龍柱(塑料管)的長短和尼龍棉的多少，視分離細胞的多少而定。
3、CD4 細胞及CD8 細胞的分離
（1）CD4 細胞的分離：將一定量的T 細胞懸液通過一根SephDdexC—10 柱，然後用少量的RPMll640 培養洗滌，收獲的細胞懸液約含85％的CD4 細胞。
（2）CD8 細胞分離：用Tris 緩沖液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg／m1)包被一平皿表面，然後放置4℃過夜，沒有包被上的抗體用PBS 洗凈。然後將已標記有抗CD8 單克隆抗體的T 細胞(細胞濃度為1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿內，4℃放置2 小時，用PBS 輕輕洗凈末粘附的細胞，然後用毛細管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細胞經洗滌後懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細胞亦可用此法分離。
4、單核巨噬細胞的分離
單核巨噬細胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴細胞則無此特性，藉此可將這兩類細胞分開，其方法簡述如下。將待分離的細胞懸液(如實物動物的腹腔液)加入適當大小的塑料或玻璃平皿內，置於37℃ C02 溫箱內溫育1 小時，然後用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面，去除非粘附細胞，再將粘附有細胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷，收集粘附的單核巨噬細胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細胞，可重復上述過程。
F. 請教：小鼠腹腔巨噬細胞提取的經驗方法
人巨噬細胞可從外周血或經斑蝥激發的皮皰液中獲取，也可從肺灌洗液或患者腹膜透析液中分離，但操作繁鎖，得量不多。許多實驗室在進行基礎或配合臨床研究巨噬細胞功能及其與疾病的關系、或篩檢免疫增強葯物和探討其作用機制時，常選用小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，常用的檢測方法如下。單核細胞滲出血管，進入組織和器官後，可進一步分化發育成巨噬細胞，成為機體內吞噬能力最強的細胞。
巨噬細胞在不同組織中的名稱不同：在肺里稱「肺巨噬細胞」；在神經系統里稱為「小神經膠質細胞」；在骨里則稱為「破骨細胞」。
單核-巨噬細胞是對他們的統稱。
G. 請教外周血單核，巨噬細胞的分離和培養方法
博凌科為以前認為紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等都是分化終末細胞.很難在體外培養生長或僅能短期培養而不能傳代,但是近來技術的發展,有血細胞培養純化的 報道.血細胞可從外周血中用梯度離心法獲得,也可從脾臟中用機械法切碎過篩分離獲得(尤其是淋巴細胞).從腹腔沖洗可獲得較多的巨噬細胞.也可從骨髓中取 前體血細胞,然後加上促進單核/巨噬細胞分化和生長的細胞因子,從而誘導前體血細胞向所要的細胞方向分化.
H. 如何分離小鼠肝臟kupffer細胞
Kupffer細胞是巨噬細胞中的一種。肝臟巨噬細胞(即Kupffer細胞)
肝巨噬細胞：又稱庫普弗細胞（Kupffer cells, KC），又稱枯否細胞。位於肝血竇腔內，具有變形運動和活躍的吞噬功能，還具有處理和傳遞抗原、調節機體免疫應答等作用，屬單核吞噬細胞系統主要成員。是清除細菌及其毒素從而拮抗感染的重要防禦細胞，同時也通過釋放各種炎症介質，在內毒素性肝損傷的發生中發揮主導作用 。
I. 求助魚的巨噬細胞分離培養
求助魚的巨噬細胞分離培養
吞噬細胞功能檢測的臨床應用 試驗原理是將人巨噬細胞與雞紅細胞(chicken red blood cell，CRBC) 混合後孵育，通過計算巨噬細噬 CRBC 百分率和吞噬指數判斷人巨噬細胞的 吞噬功能。通過觀察 CRBC 消化程度，反映巨噬的消化功能。 一、中性粒細胞功能檢測的臨床意義 趨化能力顯著下降見於 Chediak-Higashi 綜合征、Lasy 白細胞綜合征、 慢性皮膚黏膜白色念珠感染、糖尿病、燒傷等。正常新生兒中性粒細胞趨 化能力亦明顯低下。吞噬能力明顯低下者見於補或抗體缺陷症時。酶代謝 能力顯著降低見於慢性肉芽腫、6 磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PD)高度缺陷。 NBT 試驗不僅是檢測中性粒細胞的胞內殺菌能力的試驗，還作為疾病的 鑒別指標。正常人外血中性粒細胞 NBT 陽性率約為 10％，全身性細菌性感 染在 NBT 試驗陽性率明顯增高；病毒性感或無感染的低熱患者陽性率一般 在 10％以下。器官移植病人術後因細菌感染伴發熱時，NBT 陽性升高；而 因排斥反應發熱者，NBT 則正常。故發熱患者在暫無條件查清病因或檢測報 告較遲時，可用 NBT 試驗對發熱病因作過篩性鑒別。 二、巨噬細胞功能檢測的臨床意義 單核巨噬細胞系統具有直接吞噬和殺傷病原體和腫瘤細胞的功能，還 具有參與抗原加工、遞呈免疫調節的重要作用，檢測巨噬細胞吞噬功能對 於判斷巨噬細胞的功能，了解機體的特異性和非特性免疫狀態有重要作用。 巨噬細胞吞噬功能低下，主要見於原發和繼發的吞噬細胞功能缺陷、 胃癌、腸癌等多種腫瘤病，腫瘤病灶中浸潤的巨噬細胞與腫瘤的擴散與轉 移呈負相關，檢測這兩個指標有助於判斷機體抗腫的能力。
J. 如何獲取機體中的吞噬細胞
一般從外周血中獲得，具體方法如下：
1，外周血中單個核細胞（PBMC）的分離
肘靜脈采血，加入抗凝劑，再以Hanks液稀釋到3倍，密度梯度離心後，取中間的單個核細胞層，將此PBMC層移至另一離心管，以hanks液（或者生理鹽水）清洗離心幾次，其中的殘留紅細胞、血小板可以低滲裂解祛除。得到較純凈的PBMC，這其中就含有單核細胞（巨噬細胞）、淋巴細胞。
2，單核局勢細胞的分離
巨噬細胞培養具有貼壁生長的特性，將上述PBMC至於細胞培養瓶中培養，淋巴細胞懸浮於培養液中，可以祛除，貼壁生長的就是單核巨噬細胞了。改變培養條件，就可以將其從貼壁上懸浮起來，稀釋成適當濃度即可。
3，本方法僅提取的是外周血中的巨噬細胞，是常用的方法。
4，吞噬細胞是一類細胞的總稱，在不同的組織中叫法不一樣，所包含細胞也很多，血液中的吞噬細胞一般以巨噬細胞（單核細胞）為主