凍存細胞的最佳方法

Ⅰ 怎樣用液氮罐直接凍存細胞

天馳液氮罐 工作人員建議，細胞株的凍存方法可按以下步驟操作：
（1）取培養2～3天生長旺盛的細胞，用細胞培養液將細胞配成2×106～2×107/ml。
（2）在1ml細胞凍存管中加入0.5ml細胞懸液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亞碸（或甘油），混勻後密封。置4℃ 1小時，－20℃ 2小時，然後直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜後浸入液氮中。

Ⅱ 細胞凍存液怎麼配

10%-15%（常見為10%）的DMSO或甘油，含10%-20%血清的凍存培養液。

一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞。

有人親測10%血清凍存細胞，結果證明是可以的，但高血清比例的凍存液更有助於提高細胞活力，此外嬌貴的細胞可以適當提高凍存液中血清的比例以保證獲得更高的存活率及活力。

(2)凍存細胞的最佳方法擴展閱讀

細胞凍存和復甦的原則：

慢凍速融，這樣更加有利於保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會導致細胞內冰晶的產生，從而使細胞產生內源性的機械損傷，引起細胞內環境滲透壓，PH，電解質等的改變，進而促使細胞死亡。

常用的凍存保護劑為二甲基亞碸（DMSO）和甘油，凍存細胞時加入保護劑，一方面可以提高細胞膜對水的通透性，另一方面使冰點降低，延緩凍結過程。

緩慢凍存細胞的過程中，加入保護劑可以使細胞內水分滲出到細胞外，一定程度上減少胞內冰晶的產生，而在快速復甦細胞的過程中，能使胞外冰晶迅速融化，防止水分滲入胞內再次形成冰晶而損傷細胞。

Ⅲ 動物細胞培養中細胞如何凍存

細胞凍存的原則是：凍存緩慢降溫，復甦快速升溫。不同的動物細胞稍微有點不同，下面是一般的方法：
（一）細胞凍存
1. 配製含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養液；
2. 取對數生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、；
3. 離心1000rpm，5min；
4. 去除胰蛋白酶及舊的培養液，加入適量配製好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；
5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；
6. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者；
7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/
min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然後放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
（二） 細胞復甦
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，並不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管並滴加10倍以上培養液，混勻；
3. 離心， 1000rpm，5min；
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養；
5. 次日更換一次培養液，繼續培養。

Ⅳ 低溫保存細胞的方法,原理與應用

低溫保存細胞的原理,冷凍保護劑可以均勻充分地和細胞相接觸,保護效果好.對組織而言,保護劑只能作用於其表面,對深層細胞無法起到保護作用.為了提高組織的存活率,應同時控制降溫的速率.控制降溫速率的慢速降溫可以使細胞外溶液中的水結冰,導致細胞外溶液濃度升高,胞內水向膜外滲出,在達到一定溫度時,將組織置於灤低溫冰箱或液氮中凍存,可以減輕細胞內結晶對細胞的損傷,保持細胞的活性.
慢速冷卻低溫保存法是目前較為常用的保存方法,其工作程序為：失將細胞放在含有抗凍劑的溶液中進行預處理,接著用程序降溫儀將細胞連同溶液以較慢的速度降溫.首先是細胞外溶液中的水分結冰使溶液的濃度升高,細胞內的水分透過細胞膜向外滲出,細胞體積收縮,細胞內液的濃度與滲透壓增加,冰點下降；隨著溫度的下降,上述過程繼續進行,到一定的溫度時迅速降低到一80℃(下冰溫度)或一196℃(液氮溫度)結冰,並在此溫度下長期保存.在零下某一溫度結冰時,先是凝結成小冰晶,細小的冰晶對細胞損害較少,但小冰晶表面勢能大,往往互相結合成大冰晶.該現象易發生在一30℃一一40℃.大冰晶破壞細胞結構,使細胞壞死.即使小冰晶在冷凍過程中未完全形成大冰晶,在復溫過程中也會結成大冰晶,同樣導致細胞死亡.不同的細胞要求不同的降溫速率,速率過快則在細胞內形成冰晶,在復溫過程中細胞內冰晶會產生再結晶,而使細胞損傷.若降溫速率過慢,會導致細胞收縮劇烈,並且細胞較長時間處於高滲溶液中也同樣會造成細胞的損傷.降溫的過程是傳熱與滲透兩個因素相互作用的過程,所謂的最佳降溫速率是指這兩個因素的最好配合.
應用於低溫保存皮膚、氣管、血管等生物材料,在臨床實踐中的應用效果也比較理想.

Ⅳ 我的細胞培養不用血清，凍存要怎麼樣

細胞培養不用血清，凍存可以用無血清凍存液
配方為細胞條件無血清培養基與含10%二甲基亞碸的新鮮的無血清培養基1比1混勻

凍存過程：
消化貼壁細胞或收集懸浮細胞，將細胞懸液收集至離心管並1000rpm離心10分鍾，棄上清液
用一定量凍存液將細胞重懸，計數並調整細胞密度至100個每毫升左右
將細胞懸液分裝至2ml凍存管中，每管1ml並將凍存管口封，貼上標簽做好記錄
降溫： 4度1小時，負20度1小時，負80度18小時或隔夜，液氮

Ⅵ 幹細胞凍存實驗中，凍存前多久需要給細胞換上新鮮的培養基

在凍存前一天最好換一次培養液。
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置於-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復甦細胞用於實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。 細胞凍存時向培養基中加入保護劑--終濃度5%．15%的甘油或二甲基亞碸(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。 採用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標准冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min，當溫度低於-25℃時可加速，到-80℃之後可直接投入液氮內(-196℃)。

Ⅶ 凍存細胞處於什麼時期

這要看你凍存的時候是在什麼期保種的
一般都選在細胞對數生長期保種（考慮細胞的生長周期，一般提前一天換新鮮的培養基,第二天凍存保種），所以一般大多數細胞的保種屬於生長最旺盛的階段。
有些實驗室也沒有講究對數生長期，直接在細胞密度差不多的時候就保種。

Ⅷ 細胞凍存可以一直放在-80℃嗎

會有些影響,在活率方面.70%的細胞應該沒問題.
1）傳統方法: 凍存管置於4℃ 40min--->-20℃ 30min--->-80℃ 16～18h
(或隔夜)--->液氮中長期儲存.
注意：-20℃不可超過1小時,以防止胞內冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些.
（2）程序降溫：利用已設定程序的程序降溫儀以-1～-3℃/min的速度由室溫降至（-80℃以下）-120℃,再放在液氮中長期儲存.

Ⅸ 細胞凍存液中一般加哪幾種有機溶劑，加多少凍存細胞一般是迅速還是

一般加DMSO，採用慢凍速溶的方法能較好的保證細胞存活。

Ⅹ 存儲細胞樣本用什麼液氮罐比較好

你好，好高興回答你的問題。一般來講，1.預先配製凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存預冷；
2.用胰酶對細胞進行消化：倒去培養瓶中的培養基或用槍小心吸去培養板中的培養基，PBS沖洗兩次，用胰酶消化細胞（盡可能溫和）；
3.再次用完全培養液懸浮細胞，將預冷的凍存液加入消化完全的細胞中，用滴管輕輕吹打混勻。
4.在每支凍存管中加入1ml細胞液，密封後標記凍存細胞名稱和凍存日期。
5.凍存步驟的細致直接關繫到細胞復甦時的活力，如果有程序降溫器（放在-80℃冰箱過夜，放入液氮罐）最好；或者可以在4℃，2h；
再總結一句，一般細胞在-80℃存放半年左右，在液氮里可以放置更長時間細胞可以放在凍存管里，吊在液氮罐里，如果存放的數量多，可以選擇使用液氮罐提籃（大口徑液氮罐另配）。天馳液氮罐 工作人員建議，細胞株的凍存方法可按以下步驟操作：
（1）取培養2～3天生長旺盛的細胞，用細胞培養液將細胞配成2×106～2×107/ml。
（2）在1ml細胞凍存管中加入0.5ml細胞懸液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亞碸（或甘油），混勻後密封。置4℃ 1小時，－20℃ 2小時，然後直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜後浸入液氮中。
班德液氮罐介紹：液氮罐儲存樣品使用注意事項有以下幾點：
1. 本液氮罐採用凍存盒儲存樣品。
2.桶壁為高強度鋁合金製作，但要防止猛烈碰撞。
3. 後部上方有一黑色塑料蓋，內為罐體真空夾層密封口，請勿擠壓。
4. 測量液氮液面請用隨機配備的測量尺。
5. 液氮罐上配有報警器，請定期檢查電池是否有電，電池為常用九伏電池。如更換電池請注意勿扯拉探頭連線，以防止線頭扯斷造成報警失靈。
6. 建議定期用測量尺檢查液氮面,以防止報警器失靈造成樣品損壞。
7. 建議每次取樣品和加液氮應作詳細記錄以防止漏加(液氮罐為滿罐狀態，液氮揮發量最小)
你好，好高興回答你的問題。一般來講，1.預先配製凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清，4℃冰箱保存預冷；
2.用胰酶對細胞進行消化：倒去培養瓶中的培養基或用槍小心吸去培養板中的培養基，PBS沖洗兩次，用胰酶消化細胞（盡可能溫和）；
3.再次用完全培養液懸浮細胞，將預冷的凍存液加入消化完全的細胞中，用滴管輕輕吹打混勻。
4.在每支凍存管中加入1ml細胞液，密封後標記凍存細胞名稱和凍存日期。
5.凍存步驟的細致直接關繫到細胞復甦時的活力，如果有程序降溫器（放在-80℃冰箱過夜，放入液氮罐）最好；或者可以在4℃，2h；
再總結一句，一般細胞在-80℃存放半年左右，在液氮里可以放置更長時間細胞可以放在凍存管里，吊在液氮罐里，如果存放的數量多，可以選擇使用液氮罐提籃（大口徑液氮罐另配）。天馳液氮罐 工作人員建議，細胞株的凍存方法可按以下步驟操作：
（1）取培養2～3天生長旺盛的細胞，用細胞培養液將細胞配成2×106～2×107/ml。
（2）在1ml細胞凍存管中加入0.5ml細胞懸液，0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亞碸（或甘油），混勻後密封。置4℃ 1小時，－20℃ 2小時，然後直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜後浸入液氮中。