基因與細胞治療方法

① 細胞治療的原理是什麼

您好

細胞治療方法的原理是通過體外的基因改造，將CAR安裝到T細胞上，進行體外擴增，最後回輸到患者體內使其能夠特異性識別並殺死癌細胞。經歷了三代的發展。第一代CAR介導的T細胞激活是通過CD3ζ鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。CD3ζ鏈能夠提供T細胞激活、裂解靶細胞、調節IL-2分泌以及體內發揮抗腫瘤活性所需的信號。但第一代CAR改造T細胞的抗腫瘤活性在體內受到了限制，T細胞增殖減少最終導致T細胞的凋亡。第二代CAR在胞內增加了一個新的共刺激信號，常用的共刺激分子為CD28和CD137（4-1BB）。第三代CAR，增加了額外的共刺激信號，目前正在研究的第四代CAR-T則在為治療的安全性考慮，增加了自殺基因等便於在T細胞完成抗癌作用後的體內消除，從而避免毒副作用。

CART細胞治療還可以分為自體和通用的兩種，患者的自體T細胞取出來進行改造，回輸的治療相對安全性較高，但由於很多癌症晚期的病患的自體T細胞已經非常虛弱，很難進行體外改造，體外擴增的數量往往非常有限，則考慮親緣關系近的親屬或者通用性的CAR-T技術，即異源的T的免疫原性相關因素去除，在體外進行改造馴化，再回輸給患者，這種通用性的CAR-T技術又被稱為UCAR-T，國內外已經有很多新型的公司在做這方面的研究，結合最近CRISPR技術進行T細胞的體外改造，使其適用於大眾患者，從而節約成本和治療時間。

2017年，FDA(美國食品葯品監管局)率先批准了全球第一、第二個CAR-T療法上市，來自諾華公司的Kymriah和吉利德旗下Kite制葯的Yescarta分別獲批治療特定類型的急性淋巴細胞瘤和大B細胞淋巴瘤，2017年被稱為細胞免疫治療的「元年」，2017年 12月11日，南京傳奇生物科技有限公司（金斯瑞旗下的全資子公司）申報的LCAR-B38MCAR-T細胞自體回輸制劑新葯注冊已被正式受理，2018年3月12日上午10點，國家葯監局批准了LCAR-B38MCAR-T細胞自體回輸制劑臨床試驗申請，這是我國首例獲受理的CAR-T療法。

② 基因治療 方式

基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當的受受體細胞中，使外源基因製造的產物能治療某種疾病。
基因治療主要分為兩類，一類為基因修正和基因置換，即將缺陷基因的異常序列進行矯正，對缺陷基因精確地原位修復，不涉及基因組的其他任何改變。通過同源重組，即基因打靶技術將外源正常的基因在特定的部位進行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復。另一類為基因增強和基因失活，是不去除異常基因，而通過導入外源基因使其表達正常產物，從而補償缺陷基因等的功能;或特異封閉某些基因的翻譯或轉錄，以達到抑制某些異常基因表達。
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(一)基因矯正
糾正致病基因中的異常鹼基，而正常部分予以保留。
(二)基因置換
指用正常基因通過同源重組技術，原位替換致病基因，使細胞內的DNA 完全恢復正常狀態。
(三)基因增補
把正常基因導入體細胞，通過基因的非定點整合使其表達，以補償缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增強，但致病基因本身並未除去
(四)基因失活
將特定的反義核酸(反義RNA、反義DNA)和核酶導入細胞，在轉錄和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，而實現治療的目的。
(五)「自殺基因」
在某些病毒或細菌中的某基因可產生一種酶，它可將原無細胞毒或低毒葯物前體轉化為細胞毒物質，將細胞本身殺死，此種基因稱為「自殺基因」。
(六)免疫基因治療
免疫基因治療是把產生抗病毒或腫瘤免疫力的對應與抗原決定族基因導入機體細胞，以達到治療目的。如細胞因子(cytokine)基因的導入和表達等。
(七)耐葯基因治療
耐葯基因治療是在腫瘤治療時，為提高機體耐受化療葯物的能力，把產生抗葯物毒性的基因導入人體細胞，以使機體耐受更大劑量的化療。如向骨髓幹細胞導入多葯抗性基因中的mdr-1。
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(摘自：http://www.bio1000.com/reseach/biomedical/238005.html)

③ 基因治療是指什麼

基因治療（gene therapy）是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償缺陷和異常基因引起的疾病，以達到治療目的。其中也包括轉基因等方面的技術應用，也就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當的受體細胞中，使外源基因製造的產物能治療某種疾病。從廣義說，基因治療還可包括從DNA水平採取的治療某些疾病的措施和新技術。 2017年10月19日，美國政府批准第二種基於改造患者自身免疫細胞的療法（yescarta基因療法）治療特定淋巴癌患者。

遺傳病的基因治療(Gene Therapy)是指應用基因工程技術將正常基因引入患者細胞內，以糾正缺陷基因而根治疾病。糾正的途徑既可以是原位修復有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因轉入細胞基因組的某一部位，以替代缺陷基因來發揮作用。基因是攜帶生物遺傳 信息的基本功能單位，是位於染色體上的一段特定序列。將外源的基因導入生物細胞內必須藉助一定的技術方法或載體，基因轉移的方法分為生物學方法、物理方法和化學方法。腺病毒載體是基因治療最為常用的病毒載體之一。基因治療主要是治療那些對人類健康威脅嚴重的疾病，包括：遺傳病（如血友病、囊性纖維病、家庭性高膽固醇血症等）、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、類風濕等）。基因治療是將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學高技術。基因治療與常規治療方法不同：一般意義上疾病的治療針對的是因基因異常而導致的各種症狀，而基因治療針對的是疾病的根源--異常的基因本身。基因治療有二種形式：一是體細胞基因治療，正在廣泛使用；二是生殖細胞基因治療，因能引起遺傳改變而受到限制。

基因治療的靶細胞主要分為兩大類：體細胞和生殖細胞，如今開展的基因治療只限於體細胞。生殖細胞的基因治療是將正常基因直接引入生殖細胞，以糾正缺陷基因。這樣，不僅可使遺傳疾病在當代得到治療，而且還能將新基因傳給患者後代，使遺傳病得到根治。但生殖細胞的基因治療涉及問題較多，技術也較復雜，因此，如今更多地是採用體細胞基因治療。體細胞應該是在體內能保持相當長的壽命或者具有分裂能力的細胞，這樣才能使被轉入的基因能有效地、長期地發揮「治療」作用。因此幹細胞、前體細胞都是理想的轉基因治療靶細胞。以如今的觀點看，骨髓胞是唯一滿足以上標準的靶細胞，而骨髓的抽取，體外培養、再植入等所涉及的技術都已成熟；另一方面，骨髓細胞還構成了許多組織細胞(如單核巨噬細胞)的前體。因此，不僅一些涉及血液系統的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成障礙性貧血、鐮狀細胞貧血、CGD等以骨髓細胞作為靶細胞，而且一些非血液系統疾病如苯丙酮尿症、溶酶體儲積病等也都以此作為靶細胞。除了骨髓以外，肝細胞、神經細胞、內皮細胞、肌細胞也可作為靶細胞來研究或實施轉基因治療。

(1)生殖細胞基因治療：生殖細胞基因治療(germ cell gene therapy)是將正常基因轉移到患者的生殖細胞（精細胞、卵細胞中早期胚胎）使其發育成正常個體，顯然，這是理想的方法。實際上，這種靶細胞的遺傳修飾至今尚無實質性進展。基因的這種轉移一般只能用顯微注射，然而效率不高，並且只適用排卵周期短而次數多的動物，這難適用於人類。而在人類實行基因轉移到生殖細胞，並世代遺傳，又涉及倫理學問題。因此，就人類而言，多不考慮生殖細胞的基因治療途徑。

(2)體細胞基因治療：體細胞基因治療(somatic cell gene therapy)是指將正常基因轉移到體細胞，使之表達基因產物，以達到治療目的。這種方法的理想措施是將外源正常基因導入靶體細胞內染色體特定基因座位，用健康的基因確切地替換異常的基因，使其發揮治療作用，同時還須減少隨機插入引起新的基因突變的可能性。對特定座位基因轉移，還有很大困難。

體細胞基因治療採用將基因轉移到基因組上非特定座位，即隨機整合。只要該基因能有效地表達出其產物，便可達到治療的目的。這不是修復基因結構異常而是補償異常基因的功能缺陷，這種策略易於獲得成功。基因治療中作為受體細胞的體細胞，多採取離體的體細胞，先在體外接受導入的外源基因，在有效表達後，再輸回到體內，這也就是間接基因治療法。

體細胞基因治療不必矯正所有的體細胞，因為每個體細胞都具有相同的染色體。有些基因只在一種類型的體細胞中表達，因此，治療只需集中到這類細胞上。其次，某些疾病，只需少量基因產物即可改善症狀，不需全部有關體細胞都充分表達。

概念
狹義概念
指用具有正常功能的基因置換或增補患者體內有缺陷的基因，因而達到治療疾病的目的。

廣義概念
指把某些遺傳物質轉移到患者體內，使其在體內表達，最終達到治療某種疾病的方法。

④ 將外源基因導入原核細胞或真核細胞分別有哪些方法

1 物理方法
1.1 DNA直接注射法: 是目的基因導入的最簡單方法, 但注入量有限, 能夠接觸到的腫瘤細胞有限,故獲得的腫瘤細胞轉化率很低, 多通過腫瘤局部多點注射給葯。
1.2 顆粒轟擊技術:將目的基因包被金屬以後,利用高壓發射裝置, 加速包裹目的基因的金屬顆粒進入細胞,從而提高腫瘤細胞的轉化率。
2 化學方法
即用化學方法構建非病毒載體系統，借之完成基因轉導。主要包括以下兩種。
2.1 脂質體載體：方法具有安全、簡單、低毒、無免疫原性等優點，適用於注射方法進行器官靶向性轉移並有一定的轉移效率。是除病毒載體轉移方法之外的另一種有價值的體內基因轉移方法。多用於體外轉化細胞，或通過瘤組織內注射〔1〕進行體內轉化,並已有少數臨床應用的報告。目前常用的是陽離子脂質體(商品名為Lipofectin)。它可自發的與DNA形成復合物，保護外源DNA不被核酸酶降解，具有制備簡單、安全無毒、無免疫原性、重復性、對基因片段大小無限制且轉染操作方便等優點。由於它可與細胞膜直接融合而能有效地避免溶酶體破壞，故遠比傳統的脂質體效率高。缺點是靶向性有限。Nishikawa等〔2〕從BALB/c小鼠的尾靜脈注射以熒光素酶基因為報告基因的質粒DNA-脂質體復合物， 發現肺、肝、脾等器官組織中都有熒光素酶基因及其產物，持續表達超過3個月。常規脂質體易被網狀內皮系統(RES)細胞攝取，在巨噬細胞本身可成為靶細胞的部位，RES的這種親合性是有利的。Hasegawa等〔3〕採用日本血凝病毒( hemagglutinating virus of Japan , HVJ)脂質體為載體，用HSV-tk/Gcv系統治療肝癌發現，在體外試驗中當Gcv的濃度100microg/ml時幾乎所有腫瘤均被殺死，甚至當轉導率只有20％時，也有1/3腫瘤被消滅。此方法重復應用效果更佳，且皮下注射未見明顯的炎症反應。
2.2 受體介導法：利用肝細胞上富含轉移因子和糖蛋白受體的特點，人工合成多聚陽離子氨基酸，進而連接轉移因子(或糖蛋白)和目的基因構成復合物，通過與肝細胞表面的受體結合來實現目的基因的轉移。此法靶向性好，但受體介導的內吞小泡會被轉運到溶酶體，易被溶酶體降解而造成目的基因表達時間短暫，表達效率低下。利用氯哇抑制溶酶體酶或腺病毒與內吞小泡相融合而將其破壞釋放出外源DNA，可提高轉化效率。
3 生物學方法
主要通過構建病毒載體來完成。
3.1 逆轉錄病毒(retrovirus，Rv):構建簡單，裝載外源基因容量最大達8kb，整合入宿主細胞基因組而無病毒蛋白表達。但僅能感染分裂期細胞，體外製備滴度較低，且其隨機整合有引起「插入性突變」的可能〔4〕。
3.2 腺病毒(adenovirus, Adv): 為近年肝細胞肝癌基因治療中報告最多的一種病毒載體〔5〕。體外製備滴度較大 ，裝載外源基因容量最大達35kb，不整合入宿主細胞基因組因而避免插入突變的危險，能感染分裂細胞和非分裂細胞。但易引起宿主免疫反應而使轉染效率下降，且大劑量靜脈給予可導致嚴重的肝臟炎症反應，因此通過全身給葯受到限制。Nagao等〔6〕發現瘤內注射重組Adv後，目的基因可有效表達，但表達時間短暫，重復注射後表達效率降低且誘發體液和細胞免疫反應。
3.3 單純皰疹病毒：單純皰疹病毒(herps simplex virus，HSV)對非分裂細胞有天然的親合力，裝載外源基因容量達30kb，體外製備滴度接近腺病毒。但構建時難以除去與裂解細胞有關的基因而對細胞毒性大〔7〕。
3.4 腺相關病毒：腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)在人類不引起任何病理性後果，它能感染非分裂S相細胞，還能將基因轉人非周期(noncyling)腫瘤細胞。AAV是一種缺陷前病毒，對人類無致病性。能用於運載外源性重組基因組，已應用於肝和肝癌細胞的治療基因轉移〔8〕。
3.5 其他病毒：痘苗病毒〔9〕(vaccini virus)可以獨立在細胞之中復制和轉錄，並能以較強的方式表達多個腫瘤抗原。桿狀病毒〔10〕(bacul virus)能夠感染肝細胞和肝腫瘤細胞，並能增強肝細胞腫瘤壞死因子a(TNFa)、IL-1a、IL-lβ的表達。