粗蛋白測定方法有哪些

⑴ GB 6432-1986 飼料粗蛋白測定方法是什麼呢

不知道，只知道現在用凱氏定氮法

一、原理

蛋白質是含氮的有機化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標准溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即為蛋白質含量。

1.有機物中的胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4

反應式為：

2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化劑）

2.在凱氏定氮器中與鹼作用，通過蒸餾釋放出NH3，收集於H3BO3溶液中

反應式為:

(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4

2NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O

3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標准溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的含量，然後乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量

反應式為：

(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

二、試劑

所有試劑均用不含氨的蒸餾水配製。

2.1硫酸銅。

2.2硫酸鉀。

2.3硫酸。

2.42%硼酸溶液。

2.5混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。

2.640%氫氧化鈉溶液。

2.70.025mol/L硫酸標准溶液或0.05mol/L鹽酸標准溶液。

三、儀器

定氮蒸餾裝置：如圖所示。

凱氏定氮法儀器1.安全管

2.導管

3.汽水分離管

4.樣品入口

5.塞子

6.冷凝管

7.吸收瓶

8.隔熱液套

9.反應管

10.蒸汽發生瓶

四、操作方法

1、樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入乾燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻後於瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支於有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷後，移入100ml容量瓶中，並用少量水洗定氮瓶，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。

2、按圖裝好定氮裝置，於水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。

3、向接收瓶內加入10ml2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，並使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，立即將玻璃蓋塞緊，並加水於小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標准溶液定至灰色或藍紫色為終點。

同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

計算：

X=(（V1-V2）*N*0.014)/(m*（10/100）)*F*100%

X：樣品中蛋白質的百分含量，g；

V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標准液的體積，ml；

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標准溶液的體積，ml；

N：硫酸或鹽酸標准溶液的當量濃度；

0.014：1N硫酸或鹽酸標准溶液1ml相當於氮克數；

m：樣品的質量（體積），g（ml）；

F：氮換算為蛋白質的系數。蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質，乳製品為6.38，麵粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其製品為5.71，肉與肉製品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為5.30。

五、注意事項

（1）樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。

（2）樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。

（3）硝化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷後，慢慢加入30%過氧化氫（H2O2）2-3ml，促使氧化。

（4）在整個消化過程中，不要用強火。保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

（5）如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。

（6）加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作鹼性反應的指示劑。

（7）混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

（8）氨是否完全蒸餾出來，可用PH試紙試餾出液是否為鹼性。

（9）吸收液也可以用0.01當量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N鹼液滴定，計算時，A為試劑空白消耗鹼液數，B為樣品消耗鹼液數，N為鹼液濃度，其餘均相同。

（10）以硼酸為氨的吸收液，可省去標定鹼液的操作，且硼酸的體積要求並不嚴格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。

（11）向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱物，這是由於分解促進鹼與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱。有時銅離子與氨作用，生成深l藍色的結合物[Cu(NH3)4]2+

（12）這種測算方法本質是測出氮的含量，再作蛋白質含量的估算。只有在被測物的組成是蛋白質時才能用此方法來估算蛋白質含量。

⑵ 監測蛋白質含量

蛋白質含量測定主要有五種方法,分別是凱式定氮法、雙縮脲法、紫外吸收法、酚試劑法和考馬斯亮藍法。

1.凱氏定氮法：

蛋白質是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化,使蛋白質分解,產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨,留在消化液中,然後加鹼蒸餾使氨游離,用硼酸吸收後,再用鹽酸標准溶液滴定,根據酸的消耗量來乘以蛋白質換算系數,即得蛋白質含量。因為食品中除蛋白質外,還含有其它含氮物質,所以此蛋白質稱為粗蛋白。

2.雙縮脲定氮法：

在強鹼性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物,稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有:硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

3.紫外吸收定寬前氮法：

蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯吵旦環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質。形成顏色產物的量取決於蛋白質的濃度。實際測定時,必須預先用標准蛋白質溶液製作一個標准校正曲線,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白質標准溶液。

不同濃度的標准蛋白質溶液加入雙縮脲試劑後,反應生成的顏色產物用紫外-可見分光光度計在540nm 波長下測定吸光度,以雙縮脲試劑加緩沖或水作空白對照。然後將測得的值分別對蛋白濃度(mg/ ml) 作圖,得標准曲線。

未知蛋白樣品用雙縮脲試劑做同樣處理,根據測得吸光度值在標准曲線上直接查得未知蛋白質樣品中得蛋白質濃度。進行紫外吸收法測定時,由於蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標准曲線的pH相一致。

4.酚試劑法：

此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin —酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是:

①在鹼性條件下,蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。

②Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產生深藍色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,藍色深度與蛋白的量成正比。

5.考馬斯亮藍法：

考馬斯亮蘭G-250染料,在酸性溶液中與蛋白質結合,使染料的最大吸收峰的位置(λmax),由465nm變為595nm,溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為,染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。在595nm下測定的吸光度值A595,與蛋白質濃度成正比。

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檢查過程

(1) 標准法制定標准曲線取14支試管，分兩組按下表a平行操作。繪制標准曲線：以A595nm為縱坐標，標准蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標准曲線。

(2) 微量法制定標准曲線取12支試管，分兩組按下表b平行操作。繪制標准曲線：以A595nm為縱坐標，標准蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標准曲線。

(3) 未知樣品蛋白質濃度測定測定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測定值在標准曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標准曲線上查出其相當於標准蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/ml)。

參考資料網路——蛋白質含量測定

⑶ 請教：有關粗蛋白測定的干法和濕法

凱式定氮的方法是濕法，因為要用酸消化嘛 干法是指：杜馬斯燃燒法 對不同的種類的原料，二者測定的CP含量差異不同，通常是杜法高於凱法

⑷ 飼料中干物質。粗灰分、粗蛋白質和粗脂肪的測定方法與原理

粗蛋白質含量的檢測可是通過凱氏定氮法進行測定，而粗脂肪含量的檢測通過使用索氏抽提法進行測定分析，而灰分的測定則是飼料中灰分的測定一般採用灰化法。將試樣在550℃燒灼，使構成飼料有機物的主要元素C、N、H、等氧化，所余殘渣即飼料中所含各種礦物元素的氧化物、氯化物及碳酸鹽，以及混雜在飼料中粘土、砂粒等，稱為粗灰分。