A. 從育種方面如何獲得高產菌株
菌株分離（separation）就是將一個混雜著各種微生物的樣品通過分離技術區分開，並按照實際要求和菌株的特性採取迅速、准確、有效的方法對他們進行分離、篩選，進而得到所需微生物的過程。菌株分離、篩選（screening）雖為兩個環節，但卻不能絕然分開，因為分離中的一些措施本身就具有篩選作用。工業微生物產生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進一步純化並進行代謝產物鑒別。
在實驗工作中，為使篩選達到事半功倍的效果，總的說來可從以下幾個途徑進行收集和篩選：
（1）向菌種保藏機構索取有關的菌株，從中篩選所需菌株。
（2）由自然界採集樣品，如土壤、水、動植物體等，從中進行分離篩選。
（3）從一些發酵製品中分離目的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產生菌，從酒醪中分離澱粉酶或糖化酶的產生菌等。該類發酵製品經過長期的自然選擇，具有悠久的歷史，從這些傳統產品中容易篩選到理想的菌株。
菌株的分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、產物鑒別幾個步驟。
第一節 含微生物樣品的採集
自然界含菌樣品極其豐富，土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，種類數量十分可觀。但總體來講土壤樣品的含菌量最多。
一、從土壤中采樣
土壤由於具備了微生物所需的營養、空氣和水分，是微生物最集中的地方。從土壤中幾乎可以分離到任何所需的菌株，空氣、水中的微生物也都來源於土壤，所以土壤樣品往往是首選的採集目標。一般情況下，土壤中含細菌數量最多，且每克土壤的含菌量大體有如下的遞減規律：細菌（108）>放線菌（107）>黴菌（106）>酵母菌（105）>藻類（104）>原生動物（103），其中放線菌和黴菌指其孢子數。但各種微生物由於生理特性不同，在土壤中的分布也隨著地理條件、養分、水分、土質、季節而有很大的變化。因此，在分離菌株前要根據分離篩選的目的，到相應的環境和地區去採集樣品。
（一）根據土壤特點
1．土壤有機質含量和通氣狀況
一般耕作土、菜園土和近郊土壤中有機質含量豐富，營養充足，且土壤成團粒結構，通氣飽水性能好，因而，微生物生長旺盛，數量多，尤其適合於細菌、放線菌生長。山坡上的森林土，植被厚，枯枝落葉多，有機質豐富，且陰暗潮濕，適合黴菌、酵母菌生長繁殖，微生物數量相應也比較少。
從土層的縱剖面看，1～5cm的表層土由於陽光照射，蒸發量大，水分少，且有紫外線的殺菌作用，因而微生物數量比5～25cm土層少；25cm以下土層則因土質緊密，空氣量不足，養分與水分缺乏，含菌量也逐步減少。因此，采土樣最好的土層是5～25cm。一般每克土中含菌數約幾十萬到幾十億個，並且各種類型的細菌和放線菌幾乎都能分離到。如好氣芽孢桿菌、假單胞菌、短桿菌、大腸桿菌、某些嫌氣菌等。但總的說來酵母菌分布土層最淺，約5～10cm，黴菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層。
2.土壤酸鹼度和植被狀況
土壤酸鹼度會影響微生物種類的分布。偏鹼的土壤（pH7.0～7.5）環境，適合於細菌、放線菌生長。反之在偏酸的土壤（pH7.0以下）環境下，黴菌、酵母菌生長旺盛。由於植物根部的分泌物有所不同，因此，植被對微生物分布也有一定的影響。如番茄地或腐爛番茄堆積處有較多維生素C生產菌。葡萄或其他果樹在果實成熟時，其根部附近土壤中酵母菌數量增多。豆科植物的植被下，根瘤菌數量比其他植被下占優勢。
3．地理條件
南方土壤比北方土壤中的微生物數量和種類都要多，特別是熱帶和亞熱帶地區的土壤。許多工業微生物菌種，如抗生素產生菌，尤其是黴菌、酵母菌，大多從南方土壤中篩選出來。原因是南方溫度高，溫暖季節長，雨水多，相對濕度高，植物種類多，植被覆蓋面大，土壤有機質豐富，造成得天獨厚的微生物生長環境。
4．季節條件
不同季節微生物數量有明顯的變化，冬季溫度低，氣候乾燥，微生物生長緩慢，數量最少。到了春天隨著氣溫的升高，微生物生長旺盛，數量逐漸增加。但就南方來說，春季往往雨水多，土壤含水量高，通氣不良，即使有微生物所需的溫度、濕度，也不利於其生長繁殖。隨後經過夏季到秋季，約有7～10個月處在較高的溫度和豐富的植被下，土壤中微生物數量比任何時候都多，因此，秋季采土樣最為理想。
（二）采樣方法
用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25處的土樣10～25，裝入事先准備好的塑料袋內紮好。北方土壤乾燥，可在10～30處取樣。給塑料袋編號並記錄地點、土壤質地、植被名稱、時間及其他環境條件。一般樣品取回後應馬上分離，以免微生物死亡。但有時樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠，難以做到及時分離，則可事先用選擇性培養基做好試管斜面，隨身帶走。到一處將取好的土樣混勻，取3～4撒到試管斜面上，這樣可避免菌株因不能及時分離而死亡。
二．根據微生物生理特點采樣
1.根據微生物營養類型
每種微生物對碳\氮源的需求不一樣,分布也有差異。研究表明，微生物的營養需求和代謝類型與其生長環境有著很大的相關性。如森林土有相當多枯枝落葉和腐爛的木頭等，富含纖維素，適合利用纖維素作碳源的纖維素酶產生菌生長；在肉類加工廠附近和飯店排水溝的污水、污泥中，由於有大量腐肉、豆類、脂肪類存在，因而，在此處采樣能分離到蛋白酶和脂肪酶的產生菌；在麵粉加工廠、糕點廠、酒廠及澱粉加工廠等場所，容易分離到產生蛋白酶、糖化酶的菌株。若要篩選以糖質為原料的酵母菌，通常到蜂蜜、蜜餞、甜果及含糖濃度高的植物汁液中采樣。在篩選果膠酶產生菌時，由於柑橘、草莓及山芋等果蔬中含有較多的果膠，因此，從上述樣品的腐爛部分及果園土中采樣較好。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產或處理這種化合物的工廠附近採集樣品，容易得到滿意的結果。在油田附近的土壤中就容易篩選到利用碳氫化合物為碳源的菌株。Hartman等人曾從乙烯氯化物的工廠附近分離到一株以乙烯氯化物為碳源和能源的分枝桿菌。含1%乙烯氯化物的空氣通過該菌培養可除去93%的毒性。也有人從含油污泥中篩選出能以20#機械潤滑油為惟一碳源的3株石油降解菌菌株，分別為動膠菌屬（Zoogloea sp.）、氮單胞菌屬（Azomonas sp.）和假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。當然，也可將一種需要降解的物質作為樣品中微生物的惟一碳源或氮源進行富集，然後分離篩選。
此外，不少微生物對碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產生菌同樣也可以分解澱粉或其他糖類物質獲得能源而生長。以石油等碳氫化合物為碳源的油田微生物，也可以利用一些糖類為碳源。具有以上特性的微生物在一般土壤、水、及其他樣品中也會存在。不過數量較少。
2.根據微生物的生理特性
在篩選一些具有特殊性質的微生物時，需根據該微生物獨特的生理特性到相應的地點采樣。如篩選高溫酶產生菌時，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發處及北方的堆肥中採集樣品；分離低溫酶產生菌時可到寒冷的地方，如南北極地區、冰窖、深海中采樣；分離耐壓菌則通常到海洋底部采樣。因為深海中生活的微生物能耐很高的靜水壓，如從海中篩到一株水活微球菌（Micrococcus aquivivus）,它能在600個大氣壓下生長。分離耐高滲透壓酵母菌時，由於其偏愛糖分高、酸性的環境，一般在土壤中分布很少，因此，通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣堆積處采樣。如有人曾在花蜜中分離到一株能耐30%高糖的耐高滲透壓的酵母菌。
三、特殊環境下采樣
1．局部環境條件的影響
值得注意的是微生物的分布除了本身的生理特性和環境條件綜合因素的影響之外，還要受局部環境條件的影響。如北方氣候寒冷，年平均溫度低，高溫微生物相對較少。但在該地區的溫泉或堆肥中，卻會出現為數眾多的高溫微生物。氧氣充足的土層中按理只適合於好氧菌生長，實際上也有一些嫌氣菌生活，原因是好氣菌生長繁殖消耗了土層中大量氧氣，為嫌氣菌創造了局部生長的有利環境，故一般土壤中也能分離到嫌氣菌。
海洋對於微生物來說是一個特殊的局部環境，盡管許多微生物也是經河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來，但由於海洋獨特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件，使海洋微生物具備特殊的生理活性，相應也產生了一些不同於陸地來源的特殊產物。前蘇聯學者發現，20%～50%的海鞘、海參體內的微生物可產生具有細菌毒性和殺菌活性的化合物。此外，美國馬里蘭大學也曾從海綿體內的共生或共棲的細菌中分離到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物質。日本發現深海魚類腸道內的嗜壓古細菌，80%以上的菌株可以生產EPA 和DHA，最高產量可達36%和24%。筆者從鱈魚腸道中分離到一株pj20細菌，產EPA14.78mg/L，在15℃培養時EPA占脂肪酸的12.7%。日本也從海洋Thraustochvtrium aureum中篩選到一株產DNA達290mg/L的菌株。從海洋中采樣時，可參考其中不同種類微生物的分布規律：表層多為好氣異養菌，底層由於有機質豐富，硫化氫含量高，厭氣性腐敗菌和硫酸鹽還原菌較多，兩層中則多為紫硫菌。
具有特殊性質的微生物通常分布在一些特殊的環境中。如得克薩斯州中南部的一個岩洞中存在著大量嗜鹼性的，能進行氨氧化和產幾丁質酶的微生物，其原因是這里生活這2000萬只蝙蝠，它們每晚吃釣5萬lb（磅）昆蟲，其排泄物造成了洞內0m深的豐富營養層，這種特殊的環境對該種微生物起了選擇和富集的作用。還有人從侵蝕木船的一種蠕蟲腸道中分離到既能固氮又能降解纖維素的微生物。從考拉(Koala)熊腸中也曾分離到萜烯分解酶的產生菌，這可能因為考拉專吃含有高萜烯的桉樹類植物，給該種微生物創造了一個適宜的生長環境。美國從用硝酸處理過的花生殼中分離到一株節桿菌，該菌以木質素為唯一碳源，它對處理過的花生殼的消化率可達到63%，再加入釀酒酵母使其蛋白質含量達到13.6%，可作為牛、豬、雞飼料的添加劑。
2．極端環境條件的影響
微生物一般在中溫、中性pH條件下生長。但在絕大多數微生物所不能生長的高溫、低溫、高酸、高鹼、高鹽或高輻射強度的環境下，也有少數微生物存在，這類微生物被稱為極端微生物。生活所處的特殊環境，導致它們具有不同與一般微生物的遺傳特性、特殊結構和生理機能，因而在冶金、采礦及生產特殊酶制劑方面有著巨大的應用價值。
嗜冷菌（thermophiles）的最適生長溫度為15℃，在0℃也可生長繁殖，最高溫度不超過20℃。主要分布於寒冷的環境中，如南北兩極地區、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環境中。這類微生物在低溫發酵時可生產許多風味食品且可節約能源及減少中溫菌的污染。最適生長pH在8.0以上，通常在pH9～10之間的微生物，稱之為嗜鹼菌（alkaliphiles）。大量不同類型的嗜鹼菌已經從土壤、鹼湖、鹼性泉甚至海洋中分離得到。由於大部分鹼湖伴有高鹽，許多嗜鹼菌同時也是嗜鹽菌。該類菌所產生的酶如耐鹼蛋白酶和鹼性纖維素酶可作為洗滌劑的舔加成分，也可將鹼性澱粉酶用於紡織品工業。嗜鹼菌中的基因還可以用來調節其他細菌中基因產物的表達和分泌。嗜熱微生物是嗜熱菌最好的來源。有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌。從義大利境內的噴硫磺氣的火山口中分離到一種原始的微生物，在pH2和90℃時生長最好，其代謝類型極不尋常，既能作為耗氧型自養菌將硫氧化成硫酸，使自己增殖，又能作為厭氧菌用氫還原硫，生成H2S
B. 如何理解致病性分化
differenciation of pathogeni-city
李振岐
一種病原物的不同菌株對寄主植物中不同屬、種或品種的致病能力的差異，也稱寄生專化性（parasitic specialization）或生理專化性（physiologic specialization），一般說來，寄生性程度越高的病原物其致病性分化程度越高如麥類銹菌、白粉菌等。寄生性程度越低的病原物其致病性分化程度也越低如一些兼性寄生菌。
人類發現植物病原物的致病性分化現象已有100多年歷史。1894年瑞典埃里克森（J.Eriksson）通過對稈銹菌試驗證實了病原物的致病性有分化現象，並根據在不同屬、種、品種上的反應差異，證實禾穀類稈銹菌有六個專化型。1917年美國斯坦克曼（Elvin Charles Stakman）發現，在小麥稈銹病菌的專化型內還有小種的分化。1950年在研究小麥品種Thatcher喪失抗稈銹性過程中又發現在小種內還有生物型的分化。這些研究結果在理論上和技術上為以後開展病原物致病性的分化研究奠定了基礎。
分化現象的形成
病原物的致病性分化現象是在病原物與其寄主植物長期演化過程中相互適應和選擇下形成的。與寄主植物的抗病性類型相對應，一般可分為專化（或垂直）致病性和非專化（或非垂直）致病性。專化致病性與專化抗病性和非專化致病性與非專化抗病性是兩組互為前提而共現的生物學性狀。弗洛爾的「基因對基因」學說指出：在進化過程中寄主群體中有一個控制抗病性的基因，病原物群體中就相應地有一個控制致病性的基因。病原物與寄主共同發展過程如下：腐生微生物克服了高等植物的自然免疫性，獲得了侵襲力，由腐生演化到寄生，開始具有一般致病性，而寄主方面也具有一般抗病性。在繼續長期共存中，寄主和病原物由於多種變異和相互選擇，寄主方面產生了專化抗性，而病原物方面或遲或早產生能克服這種專化抗性的毒性基因。（見基因對基因概念）
病原物專化致病性的特點，是與其所適應的寄主不同品種之間有特異性或專化性互作關系，而病原物的非專化致病性的特點，是與其所適應的寄主的不同品種之間無特異性互作關系。
毒力
病原物的一定菌系對具有一定抗病基因品種的專化性和垂直致病力。又稱毒性。研究病原物的毒性主要採取分析病原物小種、毒力頻率和聯合致病性的方法。
小種
病原物種、變種或專化型以下的分類單位。小種之間在形態上無差異，區別不同的小種（race），主要根據它們對具有不同抗病基因的鑒別品種的致病力差異。細菌的小種有時稱為菌系（strain）或致病型（pathotype）。
小種鑒定方法
不同病原物小種的鑒定方法不完全相同。病原真菌和細菌小種的鑒定大多是採用一套鑒別品種，根據供測菌株在鑒別品種上的致病力表現來確定小種，目前鑒定病菌的小種有的（如鑒定小麥稈銹病的小種）採用國際通用鑒別寄主，有的（如鑒定小麥條銹病菌的小種）採用變動鑒別寄主，有的（如鑒定馬鈴薯晚疫病菌、稻瘟病菌和稻白葉病菌等的小種）採用已知基因或單基因品種作為鑒別品種。此外，鑒別非專化寄生物的小種還可根據病原物的生理生化性狀，培養性狀，血清學和熒光反應等作輔助鑒別。病毒株系間的區別主要根據它們在一定寄主上的症狀差異。區別是否為同種病毒的不同株系，也可根據血清學反應和彼此是否有交互保護作用以及是否有相似的寄主范圍和傳播方式來鑒定。
小種命名方法
不同病菌小種的命名方法也不完全相同，有的採用順序編號法即按國際統一編號如小麥稈銹病菌；或按國家或地區編號，如小麥條銹病菌命名；有的如燕麥稈銹菌採用毒力公式法命名，即用對該小種有效的抗病基因作分子，無效的抗病基因作分母寫成的公式：無毒力（R）/有毒力（S）；有的如稻瘟病菌採用分段加數（加抗或加感）法命名。
小種鑒定程序
一般有五個步驟，如小麥銹菌小種的鑒定程序如下：①菌種採集。採集菌種標樣是做好小種鑒定的首要環節。一般采自不同地區、不同品種田間病株或病葉，要從新發病的品種上採集。標樣採得後應分別裝入玻璃紙袋內，防止混雜和污染，並註明採集地點和時間，以備登記和分析。②菌種純化和繁殖。純化菌種是取一個新鮮夏孢子堆，作單菌株隔離繁殖，在菌種少時，也可先將標樣接種到有代表性的鑒定品種幼苗上，待發病後再挑取不同反應型的單個孢子堆，隔離繁殖。菌種繁殖在溫室內高感品種上進行。③菌種保存。保存的方法很多，最常見的低溫保存法和冷凍乾燥保存法。低溫保存法是將培養的菌種保存在4～8℃的冰箱中，每隔6～8個月移植一次，注意防止污染。一些生活力較差的病原真菌可保存在－20℃的低溫冰箱中。近年來應用超低溫（用液態氮保持－196℃或用乾冰保持－70℃）保存菌種的越來越多，其優點是保存時間長，保存效果好，不足之處是需要較多的設備。冷凍乾燥保存方法也是當前常用的保存菌種的方法之一。④接種鑒別寄主。鑒別品種一般播種在花盆內，每盆2～4個品種，相互隔開，中間插播高感對照品種。接種方法，可根據情況，選用手指塗抹法、噴霧法等。接種後，隔離，保溫，然後在適溫下培養。⑤鑒定小種類型。接種後，經一定時間，當被測品種的反應型穩定後，尤其是感病品種發病穩定後，進行記載。記載項目主要是反應型，其次是病株率和嚴重度，然後將記載的反應型與已知小種在鑒定品種上的反應進行比較，以確定小種的種類。
同一小種的致病力也可進一步分化出不同的致病類型，稱為生物型（biotype），即小種內由遺傳上一致的個體所組成的群體。在一個小種內可有一個生物型，也可有多個生物型。鑒定小種的生物型主要根據供試菌系在輔助鑒別品種上的反應。
毒力頻率和聯合（綜合）致病性
毒力頻率（vir
ulence frequency）是一種病原物群體中對一定抗病品種（抗病基因）有毒力的菌株（毒性菌株）出現頻率。毒力頻率（%）＝有毒力菌株數/總菌株數×100。聯合致病性（pathogenicity association）是一種病原物的群體中對二個以上被測品種（抗病基因）有毒力的菌株（毒性基因）出現頻率（%）。毒力頻率分析反映一個被測品種與一個病原物群體中多個小種（菌株）的相互關系，而聯合致病性分析則反映2個以上被測品種與一個病原物群體中多個小種的相互作用。有了這兩方面的分析結果，育種和品種利用工作的依據就會更為充分。
寄主適合度
指寄生物在寄主上的定殖能力、繁殖或產孢速度及數量等適應能力。寄生適合度高，兩者為親合組合，其中病原物的侵染能力（侵染力）愈強。
致病性相關基因
pathogenicity related genes
何晨陽
病原物中決定對植物致病性的有關基因。致病基因決定了病原物在侵染植物過程中，與植物建立寄生關系和破壞植物正常生理功能，調控著對植物的吸附、侵入並在植物中定殖、擴展，最終破壞寄主同時顯示症狀的過程。
類型
根據功能分為毒性基因、無毒基因和決定寄主范圍的基因。
毒性基因
決定對植物基本親和性的基因，調控病害發生所必需的致病過程。根據基因產物性質，已知的毒性基因（virulence genes）包括胞外降解酶基因、毒素基因、激素基因、胞外多糖基因以及未知產物基因。胞外降解酶基因包括結構編碼基因，調節基因和分泌基因。降解酶包括果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、半纖維素酶和植保素降解酶等。對於這些性質清楚的致病因子的基因克隆，可以在平板上直接檢測克隆DNA產物。未知產物的毒性基因已發現hrp基因和dsp基因兩類。hrp基因決定病原物對寄主植物的致病性和誘導非寄主植物過敏性反應。dsp基因決定病菌侵襲力並參與代謝的能力。對於未知產物毒性基因的克隆，通常用物理、化學或生物誘變法，誘導病原物中與致病性相關基因突變，獲得相應的突變體。用基因庫互補法從基因文庫中篩選出能夠互補突變體功能的重組克隆；或者用分子雜交法，與突變基因序列雜交，從基因文庫中獲得目的基因克隆。
無毒基因
決定對寄主植物特異性不親和性的基因，亦稱為寄主專化性基因或反向調節的寄主范圍基因。在病原物與寄主植物之間存在基因對基因的關系中，病原物無毒基因（avirulence genes）表達，與寄主植物中相對應抗病基因互作，從而導致不親和反應。病原物在植物中的定殖和擴展受抑制，或者在侵染初期就破壞了親和關系。病原物無毒基因不僅決定了對植物不同品種的無毒性，也決定了對植物不同種和非寄主植物的無毒性。從病原細菌、真菌和病毒中都已克隆到無毒基因。如從丁香假單胞菌大豆致病變種6號小種克隆的avr A，黃枝孢（番茄葉霉病菌）中的avr9和煙草花葉病毒（TMV）的具有無毒基因功能的外殼蛋白基因。然而對無毒基因的產物特徵和功能尚未完全清楚。一般認為無毒基因直接或間接地編碼了激發子的產生。如番茄葉霉病菌avr9編碼了63個氨基酸的多肽，這個專化性激發子激發了番茄中帶有相應抗病基因cf9的品種的過敏性反應。丁香假單胞菌番茄致病變種中的avrD的產物是酶，能將細菌代謝物轉化為低分子量的脂類激發子而釋放出去。克隆無毒基因常用基因文庫互補法。將病原物基因文庫DNA向其它小種、致病變種或其它不同種病菌中轉移，通過測定轉化接合子對植物的致病表型，篩選出能使受體菌對特定植物表現為無毒性的重組克隆，獲得無毒基因。
寄主范圍決定基因
擴大病原物寄主范圍的基因。從青枯病假單胞菌花生菌株基因文庫中重組克隆DNA，導入對花生不致病的番茄菌株，使得後者變得對花生致病。從根癌土壤桿菌廣寄主范圍的菌株基因文庫中獲得的重組DNA克隆，能使寄主范圍較窄的葡萄菌株擴大其侵染植物的種類。
性狀
病原物致病基因數量眾多，大多數成簇排列，並高度保守，具有多效性功能。
數量
致病基因是病原物對植物致病過程所必需，而體外生長並不需要的基因。根據突變體致病基因突變頻率和營養突變頻率推算，病原細菌致病基因數量有50～100個。從細菌已鑒定和分離出50多個致病基因，但這些基因並不一定共存在某一個病原菌中。
成簇性
致病基因定位於染色體上和（或）質粒上。大多數致病基因都是成簇排列的。根癌土壤桿菌致病基因主要集中排列在質粒上的T區和V區，V區就包含了virA、virB、virC、virD、virE、virF、virG、virH8個調節子。病原細菌中的hrp基因也是大基因簇。丁香假單胞菌菜豆致病變種hrp基因簇中含有9個互補群，全長達22千鹼基對。青枯病假單胞菌（Pseudomonas solanacearum）hrp基因DNA片段長達17～22千鹼基對，至少有9個轉錄單位。胞外降解酶及泌出基因、多糖合成酶基因等都是以基因簇方式存在。菊歐文氏菌果膠酶的5種同工酶基因以兩個基因簇方式存在。油菜黃單胞菌油菜致病變種（甘藍黑腐病菌）與胞外酶泌出和多糖合成有關的基因也是成簇的。
保守性
由於營養要求和生化代謝的基本相似性，從一種病原物中克隆的致病基因，可以在該病原物的其它小種、致病變種、其它種病原物和非病原物甚至動物病原物中發現其結構上同源序列，其產物的生化特徵也基本類似，但並不一定具有相同的致病功能。hrp基因在丁香假單胞菌許多致病變種中是同源的；青枯病假單胞菌的hrp基因和油菜黃單胞菌不同致病變種之間也具有同源性（見圖）。hrp基因在某些病原細菌中可以相互交換，因此向其它細菌導入hrp基因可以導致寄主防衛反應。從丁香假單胞菌丁香致病變種克隆的32kb的hrp大基因簇片段，在丁香假單胞菌煙草致病變種、熒光假單胞菌（Pseudomonas flurescens）或大腸桿菌（E coli）中表達，可以導致煙草植株的過敏性反應。根癌土壤桿菌和油橄欖假單胞菌中與生長素和細胞分裂素生物合成有關的基因也同源。盡管無毒基因具有不同的專化性功能，但許多無毒基因之間存在明顯的序列同源性。如從油菜黃單胞菌辣椒致病變種中克隆的avr Bs3與其它致病變種中的無毒基因高度同源。油菜黃單胞菌水稻致病變種（水稻白葉枯病菌）avr10也發現有廣泛同源性，不僅在不同小種中有同源序列，在其它致病變種和其它屬中也有同源性。
青枯病假單胞菌和油菜黃單胞菌油菜致病變種hrp基因區的結構同源性（黑點區和斜線區表示相互之間的同源區）（引自Arlat，M et al1991）
多效性
致病基因突變對病原物表型改變具有多效性。無毒基因突變，可以使病原物對特定寄主表現毒性，避免了植物過敏性反應的激發和識別過程發生。突變的無毒基因使寄主相應的抗病基因喪失功能，但並不明顯地影響病原物的毒性或其他生物學性狀。毒性基因突變，在致病性和寄生性上的影響不同。有些突變體在同源寄主上表現不完全的致病性，或者全部喪失，或者部分降低，對非寄主植物誘導過敏性反應的能力也有影響。有些突變體可以在植物體內生長和定殖，但不產生任何症狀。致病基因的突變還可以賦予病原物豐富多樣的生化表型，與各種胞外降解酶、多糖、毒素和激素等致病生化因子發生連鎖改變，有的致病生化因子產生能力低於野生型菌株，有的卻比野生型菌株高。表明了致病基因的復雜性以及致病基因與代謝途徑中涉及的有關基因之間存在著可能的調控關系。
表達調控
許多病原物致病基因的表達受到植物組分的誘導，並受到雙組分調控系統的調控。
植物組分的誘導
目前已有三種方法用植物組分對致病基因誘導作用的研究。①誘導性啟動子探針途徑是用啟動子探針鑒別出受寄主植物誘導的病原物的啟動子，篩選基因文庫中與該啟動子同源序列，從而分離出完整的受啟動控制的致病基因。②用植物誘導病原物產生的多肽制備抗血清。篩選表達性基因文庫，分離結構基因；或者用誘導的和非誘導的mRNA轉錄成cDNA進行特異性雜交，鑒別表達受調控的基因。③基因融合法。是在致病基因序列後插入轉座子的一部分形成報導基因（如lux，cat lacZ），產生基因融合體，指示致病基因的表達及其調控。
植物細胞組分起著誘導病原物致病基因表達的刺激信號的功能。這些組分有酚類、糖類以及性質尚不清楚的低分子量物質。如許多雙子葉植物受傷後釋放出一些酚類物質，尤其是乙醯丁香酮和羥基乙醯丁香酮，刺激了根癌土壤桿菌V區基因的活化和表達。許多病原細菌中hrp基因，丁香假單胞菌丁香致病變種中的sym B基因，玉米萎蔫歐文氏菌中的wts基因等表達與寄主植物的誘導有關。一些致病基因在植物體內，在無機培養基上表達水平高，而在復合培養基上不表達或表達量低。
雙組分調控機制
植物病原細菌致病基因表達調控的一種主要途徑。典型雙組分調控系統由一對感受蛋白和調節蛋白組成，分別由兩個不同基因編碼。感受蛋白一般為跨膜蛋白，能感受胞外環境的刺激信號，經變構傳入胞質。感受蛋白N端感受的信號，經過保守的C端與調節蛋白的保守的N端互作，通過磷酸化過程進行信號傳遞、被磷酸化的調節蛋白具有在轉錄水平上調控其它基因表達的功能。在許多雙組分系統中，調節蛋白是DNA結合蛋白，能特異性地與基因啟動子上游的DNA序列結合，激活基因的轉錄。所有雙組分調控系統的感受蛋白或調節蛋白在氨基酸序列上高度保守。如感受蛋白C端約250個氨基酸具明顯的同源性，N端雖不具同源性，但大多有多個疏水區。根癌土壤桿菌毒性基因virA和virG所編碼的VirA和VirG組成了雙組分調控系統。virA為跨膜蛋白，直接感受植物從傷口釋放出的酚類和糖類物質，然後將信號傳遞給調節蛋白virG，後者活化後調控其它的vir基因的表達，而vir基因激活後，促進了轉移DNA（T-DNA）向寄主植物細胞轉移和整合。許多細菌hrp基因表達也受到雙組分調控系統調控。
C. 【菌周刊】漢遜酵母表達系統開發生物製品——人細小病毒疫苗篇
人類細小病毒 B19 (HPV B19) 是一種廣泛傳播的病毒，能引發多種疾病。HPV B19 的感染在大多數具有免疫力的健康個體中可引發中和抗體，形成持久的免疫保護。然而，對免疫功能低下者和胎兒的感染可能導致嚴重後果。目前，尚無針對 HPV B19 的疫苗或抗病毒葯物。多形漢遜酵母因其在表達外源蛋白方面的高效穩定性和低熱原性，成為生產具有重要醫用價值蛋白質的理想宿主。已有多種診斷和治療價值的真核蛋白在漢遜酵母中成功表達。
HPV B19 的重組病毒樣顆粒 (VLPs) 開發是有效疫苗設計的潛在策略。VLPs 由 VP2（主）和 VP1（次）兩類蛋白組成，已有研究發現主要免疫應答由 VP1 引起。HPV B19 VLPs 的質粒構建涉及 VP2 和 VP1 的基因構建，並通過特定質粒將它們整合到酵母基因組中。構建的質粒包含不同選擇標記和啟動子，旨在實現目標基因的高效表達。
在構建好質粒後，將 VP1 和 VP2 轉化到漢遜酵母中進行共表達。通過 ELISA 檢測 VP2 和 VP1 的表達水平，篩選出高表達菌株，制備雙組分 VLPs。發酵過程在特定條件下進行，最終收集酵母溶液。重組 VLPs 通過凝膠柱層析和陰離子交換層析進行純化，並通過 SDS-PAGE 和 Western blot 進行表徵。純化 VLPs 的粒徑和純度通過 SEC-HPLC 法測定，最終使用透射電鏡（TEM）檢測 VLPs 的完整性和均一性。
漢遜酵母在疫苗開發中的應用展示了其在生物技術領域的潛力。耀海生物在漢遜酵母表達重組疫苗方面擁有豐富的經驗，包括菌種改造、工藝開發、方法開發和 GMP 生產等服務，可提供從菌種構建到 GMP 生產的完整解決方案。如需了解更多詳情，可聯系耀海生物。
D. 生物制葯工藝學萃取分離有哪些方法
微生物制葯技術
工業微生物技術是可持續發展的一個重要支撐，是解決資源危機、生態環境危機和改造傳統產業的根本技術依託。工業微生物的發展使現代生物技術滲透到包括醫葯、農業、能源、化工、環保等幾乎所有的工業領域，並扮演著重要角色。歐美日等國已不同程度地制定了今後幾十年內用生物過程取代化學過程的戰略計劃，可以看出工業微生物技術在未來社會發展過程中重要地位。
微生物制葯技術是工業微生物技術的最主要組成部分。微生物葯物的利用是從人們熟知的抗生素開始的，抗生素一般定義為：是一種在低濃度下有選擇地抑制或影響其他生物機能的微生物產物及其衍生物。(有人曾建議將動植物來源的具有同樣生理活性的這類物質如魚素、蒜素、黃連素等也歸於抗生素的范疇，但多數學者認為傳統概念的抗生素仍應只限於微生物的次級代謝產物。)近年來，由於基礎生命科學的發展和各種新的生物技術的應用，報道的微生物產生的除了抗感染、抗腫瘤以外的其他生物活性物質日益增多，如特異性的酶抑制劑、免疫調節劑、受體拮抗劑和抗氧化劑等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活動的范圍。但這些物質均為微生物次級代謝產物，其在生物合成機制、篩選研究程序及生產工藝等方面和抗生素都有共同的特點，但把它們通稱為抗生素顯然是不恰當的，於是不少學者就把微生物產生的這些具有生理活性（或稱葯理活性）的次級代謝產物統稱為微生物葯物。微生物葯物的生產技術就是微生物制葯技術。可以認為包括五個方面的內容：
第一方面 菌種的獲得
根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。
分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求、菌種的特性，採用各種篩選方法，快速、准確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。具體分離操作從以下幾個方面展開。
定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養特性。
采樣：有針對性地採集樣品。
增殖：人為地通過控制養分或培條件，使所需菌種增殖培養後，在數量上占優勢。
分離：利用分離技術得到純種。
發酵性能測定：進行生產性能測定。這些特性包括形態、培養特徵、營養要求、生理生化特性、發酵周期、產品品種和產量、耐受最高溫度、生長和發酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。
第二方面 高產菌株的選育
工業上生產用菌株都是經過選育過的。工業菌種的育種是運用遺傳學原理和技術對某個用於特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現存的優良性狀強化，或去除不良性質或增加新的性狀。
工業菌種育種的方法：誘變、基因轉移、基因重組。
育種過程包括下列3個步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規模和工業生產規模)。
選擇育種方法時需綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質及與發酵工藝的關系(例如分批或者連續發酵差棗試驗)；(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學方面認識的明了程度；(3)經濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半採用隨機誘變、篩選及選育等技術；如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。
工業敏埋菌種具體改良思路：(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟（通過增加特定基因的拷貝數或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。） (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產品的耐受力。(4)抑制或消除產品分解酶。 (5)改進菌種外泌產品的能力。(6)消除代謝產品的反饋抑制。如誘導代謝產品的結構類似物抗性。
第三部分 菌種保藏技術
轉接培養或斜面傳代保藏；
超低溫或在液氮中冷凍保藏；
土壤或陶瓷珠等載體乾燥保藏。
第四部分 發酵工藝條件的確定
微生物的營養來源
能源，自養菌：光虛拿拆；氫，硫胺；亞硝酸鹽，亞鐵鹽。異養菌：碳水化合物等有機物，石油天然氣和石油化工產品，如醋酸。
碳源，碳酸氣；澱粉水解糖，糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等，石油、正構石蠟，天然氣，醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產品
氮源，豆餅或蠶蛹水解液，味精廢液，玉米漿，酒糟水等有機氮，尿素，硫酸銨，氨水，硝酸鹽等無機氮，氣態氮
無機鹽，磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等其他礦鹽，鐵、錳、鈷等微量元素等
特殊生長因子，硫胺素、生物素、對氨基苯甲酸、肌醇等
培養基的確定
（1）首先必須做好調查研究工作，了解菌種的來源、生活習慣、生理生化特性和一般的營養要求。工業生產主要應用細菌、放線菌、酵母菌和黴菌四大類微生物。它們對營養的要求既有共性，也有各自的特性，應根據不同類型微生物的生理特性考慮培養基的組成。
（2）其次，對生產菌種的培養條件，生物合成的代謝途徑，代謝產物的化學性質、分子結構、一般提取方法和產品質量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養基時做到心中有數。
（3）最好先選擇一種較好的化學合成培養基做基礎，開始時先做一些搖瓶實驗;然後進一步做小型發酵罐培養，摸索菌種對各種主要碳源和氮源的利用情況和產生代謝產物的能力。注意培養過程中的pH變化，觀察適合於菌種生長繁殖和適合於代謝產物形成的兩種不同pH，不斷調整配比來適應上述各種情況。
（4）注意每次只限一個變動條件。有了初步結果以後，先確定一個培養基配比。
其次再確定各種重要的金屬和非金屬離子對發酵的影響，即對各種無機元素的營養要求，試驗其最高、最低和最適用量。在合成培養基上得出一定結果後，再做復合培養基試驗。最後試驗各種發酵條件和培養基的關系。培養基內pH可由添加碳酸鈣來調節，其他如硝酸鈉、硫酸銨也可用來調節。
（5）有些發酵產物，如抗生素等，除了配製培養基以外，還要通過中間補料法，一面對碳及氮的代謝予以適當的控制，一面間歇添加各種養料和前體類物質，引導發酵走向合成產物的途徑。
(6)根據經濟效益選擇培並基原料
考慮經濟節約，盡量少用或不用主糧，努力節約用糧，或以其他原料代糧。糖類是主要的碳源。碳源的代用品主要是尋找植物澱粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替澱粉、糊精和葡萄糖，以工業葡萄糖代替食用葡萄糖；石油作為碳源的微生物發酵也可以生產以糧食為碳源的發酵產品。有機氮源的節約和代替主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白腖和酵母粉等含有豐富蛋白質的原料為目標，代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業下腳料等。這些代用品大多蛋白質含量豐富，價格低廉，便於就地取材，方便運輸。
培養工藝的確定：
培養條件：溫度、pH值、氧、種齡、接種量、溫度
工業微生物的培養法分為靜置培養和通氣培養兩大類型。
靜置培養法即將培養基盛於發酵容器中，在接種後，不通空氣進行發酵，又稱為厭氧性發酵。通氣培養法的生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發酵，又稱為好氣性發酵。
在靜置和通氣培養兩類方法中又可分為液體培養和固體培養兩大類型，其中每一類型又有表面培養與深層培養之分。
關於液體深層培養：
用液體深層發酵罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養方法，相對於由氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養法來講，稱為深層培養法。特點是容易按照生產菌種對於代謝的營養要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度、與培養基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養條件。
深層培養基本操作的3個控制點
①滅菌：發酵工業要求純培養，因此在發酵開始前必須對培養基進行加熱滅菌。所以發酵罐具有蒸汽夾套，以便將培養基和發酵罐進行加熱滅菌，或者將培養基由連續加熱滅菌器滅菌，並連續地輸送於發酵罐內。②溫度控制：培養基滅菌後，冷卻至培養溫度進行發酵，由於隨著微生物的增殖和發酵會發熱、攪拌產熱等，所以為維持溫度恆定，須在夾套中以冷卻水循環流過。 ③通氣、攪拌：空氣進入發酵罐前先經空氣過濾器除去雜菌，製成無菌空氣，而後由罐底部進人，再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長氣泡滯留時間，可在罐內裝擋板產生渦流。攪拌的目的除了溶解氧之外，可使培養液中微生物均勻地分散在發酵罐內，促進熱傳遞，以及為調節pH而使加入的酸和鹼均勻分散等。
第五部分 發酵產物的分離提取
提取方法：
過濾
離心與沉降
細胞破碎
萃取
吸附與離子交換
色譜分離
沉析（鹽析、有機溶劑沉析、等電點等）
膜分離
結晶
乾燥
分離提取過程的幾個注意的問題：
水質
熱源去除（石棉板吸濾、活性碳吸附、過離子交換柱）
溶劑回收
廢物處理
生物安全性