常用轉染的方法有哪些

㈠ 轉染試劑的簡介

哺乳動物的轉染技術在60年代末70年代初即已引入。
目前, 將外源DNA 導入哺乳動物細胞的方法大致可分為兩大類，即生物方法和物理化學方法。物理化學方法中常用的有磷酸鈣法、顯微注射、電穿孔、脂質體介導的轉染，以及最近出現的以高分子聚合物為載體的基因傳遞技術。生物方法則主要是以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA 導入到細胞中, 其中以逆轉錄病毒及腺病毒轉染系統最為常用。
其中病毒載體的特點是整和效率高, 可使外源基因在宿主細胞中長期表達，缺點是存在潛在的安全危險性。電穿孔法及顯微注射法的特點是轉染率較高，缺點是需要昂貴的儀器，前者對細胞的損傷較大，後者在導入DNA 時需要一個細胞一個細胞地注射，不適合大量細胞研究的需要。
磷酸鈣在良好的轉染條件下，可以在293T等細胞的轉染達到較高的轉染效率。但磷酸鈣轉染有一個突出的問題，非常不穩定，尤其受PH值的影響非常大，在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優條件十分之一個PH都可能導致磷酸鈣轉染的失敗，經常即使最熟練的轉染實驗者也不能保證每次磷酸鈣轉染的成功，他們可能經常為莫名其妙的轉染失敗而沮喪。同時，他們還經常發現，往往小體積的轉染比如6孔板以下的轉染效果比較理想，可一換到大皿，經常轉染效率下降很快。磷酸鈣的先天缺陷往往是實驗梗阻的主要原因。

㈡ 將目的基因導入受體細胞常用方法

可通過物汪轉染的方法將目的基因導入受體細胞；包括化學轉染罩猜仔法：1.DEAE-葡聚糖法，兆嫌2.磷酸鈣法，3.人工脂質體和物理方法：①顯微注射②電穿孔③基因槍等；此外還可通過輔助載體（如病毒）將目的基因導入到宿主細胞。

㈢ 為什麼原代培養的細胞難轉染適合原代細胞轉染的方法有哪些

對原代培養的細胞，可以採用一下方法：
非病毒載體，選擇比較好的轉染試劑，推薦QIAGEN的superfect轉染試劑，對原代細胞還可以。

採用電轉。理論上任何細胞都可以通過電轉，不足之處：需要電轉儀器，緩沖液非常有講究，不同細胞條件要自己摸索，細胞電轉後，狀態很不好。

DEAE-葡聚糖：這是早在1965年出現的轉染方法。帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體可以結合帶負電的DNA分子，使得DNA復合物結合在帶負電的細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克，也可能是細胞內吞作用使得DNA復合體進入細胞。DEAE-葡聚糖僅限於瞬時轉染，可重復性好，轉染時要除掉血清。

磷酸鈣共沉澱轉染：最早在1973年開始採用。氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉澱黏附在細胞膜表面，藉助內吞作用進入細胞質。沉澱顆粒的大小和質量對於轉染的成功至關重要，pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉澱反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產生影響，重復性不佳。此法較易得到穩定轉染，但轉染原代細胞比較困難。

電穿孔法：通過短暫的高電場電脈沖處理細胞，沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜的暫時穿孔。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內的。電脈沖和場強的優化對於成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。理論上說電穿孔法可用於各種細胞，且不需要另外采購特殊試劑，但需要昂貴的電轉儀。此法每次轉染需要更多的細胞和DNA，因為細胞的死亡率高。每種細胞電轉的條件都需要進行多次優化。

脂質體法：中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，藉助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體則不同，DNA並沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。脂質體法始於1987年，此法的出現使得轉染效率、轉染的穩定性和可重復性大大提高。陽離子脂質體細胞毒性相對較高，對不同的細胞可能會干擾細胞的代謝。

非脂質體的脂質：新一代的脂質體技術，其與DNA結合形成膠束結構而非簡單的雙層膜結構，使DNA的傳遞更有效且細胞毒性明顯降低。

活化的樹狀聚合物：該聚合物的高度樹狀分枝形成球形結構，藉助每個球體無數活化的氨基末端凝聚在DNA上形成較為緻密的結構，並吸附在細胞膜上，經內吞進入細胞。活化的氨基可以調節胞內溶酶體pH值，抑制降解活性，使DNA穩定存在。轉染效率高，毒性低，可重復性好。血清的存在能顯著提高轉染效率。

病毒介導的感染：感染需要將目的基因克隆到特定的病毒體系中，經過包裝細胞的包裝得到改造後的病毒，再進行感染。優點是轉染效率特別高，尤其是難以轉染的原代細胞、活體細胞。

㈣ 轉染的分類

包括：
1.DEAE-葡聚糖法
DEAE-葡聚糖是最早應用哺乳動物細胞轉染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負電的核酸結合後接近細胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉染成功地應用於瞬時表達的研究，但用於穩定轉染卻不是十分可靠。
2.磷酸鈣法
磷酸鈣法是磷酸鈣共沉澱轉染法，因為試劑易取得，價格便宜而被廣泛用於瞬時轉染和穩定轉染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然後加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉澱，最後把含有沉澱的混懸液加到培養的細胞上，通過細胞胞膜的內吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細胞內的核酸酶活性而保護外源DNA免受降解.
3.人工脂質體法。
人工脂質體法採用陽離子脂質體，具有較高的轉染效率，不但可以轉染其他化學方法不易轉染的細胞系，而且還能轉染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質。此外，脂質體體外轉染同時適用於瞬時表達和穩定表達，與以往不同的是脂質體還可以介導DNA和RNA轉入動物和人的體內用於基因治療。LipoFiterTM脂質體轉染試劑()是一種適合於把質粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白復合物轉染到培養的真核細胞中的高效陽離子脂質體轉染試劑。它可以和帶負電荷的核酸結合後形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內吞成為內體進入細胞質，隨後DNA復合物被釋放進入細胞核內，至於DNA是如何穿過核膜的，其機理目前還不十分清楚。 外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法、脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由於電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期准備較復雜、而且可能對於細胞有較大影響；所以現在對於很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多採用脂質體法。
利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對於效率的提高有巨大的作用。 （1）材料
293T細胞、MyoD表達質粒和EGFP表達質粒、DMEM培養基、鏈黴素/青黴素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑（TransFast）
（2）器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計數板、渦旋振盪器、恆溫水浴箱、台式離心機、35mm培養皿、轉染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD 細胞傳代
(1)試驗准備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養皿，離心管。
(2)棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鍾（37。C，5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。
(4)加入1ml的含血清培養基終止反應。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。
(6)將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養液重懸細胞，細胞計數後選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。
(8)將合適體積完全培養液加入離心管中，混勻細胞後輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。
(9)將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染。
細胞轉染
1）轉染試劑的准備
A.將400ul去核酸酶水加入管中，震盪10秒鍾，溶解脂狀物。
B.震盪後將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震盪。
2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震盪後在加入合適體積的轉染試劑，再次震盪。
5）將混合液在室溫放置10—15分鍾。
6)吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。
7）加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。
8）到時後，根據細胞種類決定是否移除混合液，之後加入完全培養基繼續培養24－48小時。
第二次細胞傳代
1） 在轉染後24小時，觀察實驗結果並記錄綠色熒光蛋白表達情況。
2） 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新放入培養皿中。
3） 在正常條件下培養24小時後按照染色要求條件固定。