rna的提取還有哪些方法

A. RNA的提取方法有哪些

RNAgents總RNA提取系統
1)Promega有哪些系統用於提取總RNA及poly(A)+RNA？
2)RNAgents®總RNA提取系統的工作原理怎樣？
3)RNAgents®總RNA提取系統的一般得率是多少？
4)RNAgents®總RNA提取系統的各組分的功能是什麼？
5)RNAgents®總RNA提取系統中平衡的苯酚：氯仿：異戊醇的配比是多少？
6)對初始材料的用量有什麼限制？
7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？
--------------------------------------------------------------------------------
1)Promega有哪些系統用於提取總RNA及poly(A)+RNA？
Promega用於提取總RNA及poly(A)+RNA的系統包括：
：用RNAgents®總RNA提取系統從組織及培養的細胞中提取總RNA。
：用SV總RNA提取系統從組織，血液及培養的細胞中提取總RNA。
：用PolyATtract®mRNA提取系統從總RNA中提取poly(A)+RNA。
：用PolyTtract®ystem1000從組織及培養的細胞中提取poly(A)+RNA。
：用PolyTtract®Series
9600TMmRNA從少量樣品中快速提取mRNA（cDNA第一條鏈的純化）。
2)RNAgents®提取總RNA提取系統的工作原理怎樣？
RNAgents®總RNA提取系統用溶劑法為基礎，從多種材料中快速，有效地提取總RNA。
簡單而言，有亞硫氫胍及巰基乙醇時，制組織勻漿，可使內源的RNA酶失活，n-月桂肌氨酸將核蛋白復合物變性。用酸平衡的苯酚：氯仿：異戊醇抽提後，RNA脫離DNA及蛋白，從混合液中層析到水相。抽提後，用異丙醇將RNA沉澱濃縮。用RNAgents®總RNA提取系統所得RNA純度好，用途廣，適用於PolyATtract®mRNA提取系統。如RNA中必須完全去除染色體DNA，需用1-2個單位的無RNA酶污染的DNA酶處理。然後用65oC加熱10分鍾，或用苯酚及氯仿抽提使DNA酶失活。
3)RNAgents®總RNA提取系統的一般得率是多少？
得率受多個因素的影響，包括組織來源及培養的細胞數。如提取的RNA量多，可通過光吸收測定（A260讀數）來定量RNA，
1OD=40ugRNA。
RNAgents®總RNA提取系統的一般得率
組織
總RNA得率
Hela細胞
1.6mgRNA/10的8次方個細胞
鼠內臟
2.3mgRNA/g組織
鼠脾
8.3mgRNA/g組織
鼠肺
1.9mgRNA/g組織
鼠腎
3.1mgRNA/g組織
鼠肝
8.1mgRNA/g組織
4)RNAgents®總RNA提取系統的各組分的功能是什麼？
(1)
變性劑:
檸檬酸鈉溶液中含亞硫氫胍，巰基乙醇，n-月桂肌氨酸
。可變性細胞內及核蛋白復合物，釋放RNA。這些試劑還可有效抑制核酸酶。
(2)
苯酚：氯仿：異戊醇（125：24：1）（pH4.7）:酸平衡苯仿可抽提去除雜物。DNA及蛋白沉澱到有機相，RNA留在水相。酸性有機溶劑的抽提可免除用氯化鋰選擇沉澱RNA。用鋰沉澱導致小於5.8sRNA的丟失，並不利於下游操作。
(3)
乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，及沉澱RNA所需。
(4)
異丙醇：沉澱濃縮RNA。
5)RNAgents®總RNA提取系統中平衡的苯酚：氯仿：異戊醇的配比是多少？
苯酚：氯仿：異戊醇的配比是125：24：1，用42mM檸檬酸鈉溶液平衡(pH4.3-4.7)。這一配比可有效去除染色體DNA。殘留染色體DNA會干擾RT-PCR。
6)對初始材料的用量有什麼限制？
最初的設計方案是用作提取比較大量的RNA，RNAgents®總RNA提取系統可從5mg
組織，或5倍10的5次方的細胞中提取RNA。少量RNA提取的步驟可見RNAgents®總RNA提取系統技術手冊TB087。初始材料用量的上限是每次用1g組織。
7)提取RNA用作RT-PCR的方法作了哪些修改？
快速提取RNA用作RT-PCR，可省去在變性溶液中液化和沉澱的步驟。簡化的步驟可在90分鍾內完成。
http://www.promega.com.cn/files/changjian/rnagents.htm

B. 如何選擇正確的RNA提取方法

1. 使用正確的細胞或組織儲存條件
在樣品用液氮瞬間凍結之後，應該儲存在-80°C，千萬不能解凍。即使是置於含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會導致RNA的降解和損失。瞬間凍結的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然後置於裂解液中進行勻漿。
RNAfixer使樣品儲存更為便利。儲存在RNAfixer中的細胞或組織可在室溫下穩定保存長達1個星期，在4°C可穩定保存長達1個月，或永久保存在-20°C。
2. 消除環境RNase的污染
為了得到完整的、高品質RNA，在整個RNA制備過程中，當RNA離開強蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護時，避免引入新的RNase污染就非常關鍵。由於RNase幾乎是無所不在，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣東西都是無RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制膠設備，都必須用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑 來處理過，去除各種溶液或者反應緩沖液中可能存在的RNase污染，可以用RNAsafe。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應經常更換。
3.迅速滅活內源的RNA酶，以防止RNA降解。
以下3個方法均可有效使內源RNA酶失活：
1）、用含離液（如胍鹽）的細胞裂解液收獲樣品，並立即勻漿。
2）、用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結，以確保瞬間令RNA酶失活。
3）、立即將樣品置於RNAfixer無液氮RNA樣品儲存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑，能立即穩定並保護完整、未凍結的組織和細胞樣品中的RNA。關鍵要點是組織樣品切片一定要夠薄（<0.5 cm），這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。
4. 選擇合適破壁方法
細胞或組織的徹底勻漿對RNA提取來說，是一個很關鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類型來選擇。大部分培養的細胞可以置於細胞裂解液中，通過簡單的渦旋震盪來勻漿；而動物組織、植物組織、酵母和細菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說細菌（特別是革蘭氏陽性菌）的細胞壁，就需要溶菌酶消化來實現徹底的細胞裂解和RNA的最大回收，酵母提取時加入破壁酶幫助破壁，再用TRIpure或RNApure進行提取。
5. RNA提取少走彎路——不同材料如何選擇最適RNA提取試劑
現有眾多的RNA分離方法也許令人難以取捨。目前最簡單也是最安全的方法是柱式分離，如RNApure 因為操作簡單，時間短，純度高而受到大家的喜愛，RNApure不需要DNA酶消化DNA，節省了時間，避免RNA的降解，從而提高了產量；相對非柱式分離（如TRIzol），去除蛋白及其他雜質干凈，提高了純度，對於細胞、組織、一般植物均非常適合。植物RNA的提取比較難抉擇，植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質、次生代謝物含量的影響，一般用TRIzol提取純度不高，而且很多植物用TRIzol提取不出來。
這時候可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等）和通用植物RNA提取試劑盒（適合絕大多數植物提取，包括：各種中草葯、植物種子、蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹、杉樹、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍、牽牛花等）；非常值得一提的是血液（包括血清、血漿、腦脊液、各種拭子或其他液體含量高的樣本）RNA的提取用TRIzol和紅細胞裂解的方法效果都不好，因為紅細胞裂解液不含有RNA酶的抑製成分，這個過程RNA很容易降解，推薦使用TRIpure LS (RP1101)或者血液總RNA提取試劑盒（RP4001），該方法適用於表達譜晶元實驗中RNA的提取。
6. 低濃度RNA的沉澱
純化得到的RNA可能需要通過沉澱來濃縮，以滿足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉澱（加0.1體積的5M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鍾以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以採用共沉澱（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當RNA用於RT-PCR分析時，線性的丙烯醯胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉澱劑，因為它們都不含DNA污染，糖原含量高會抑制PCR反應，應注意控制濃度，核酸助沉劑對PCR無影響，成為病毒核酸提取的首選。酵母RNA和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結果。沉澱後，注意避免RNA沉澱過分乾燥，因為這可能導致很難重新溶解。
7. 提取好的RNA如何儲存
如果只是短期儲存，重懸的RNA應放置於-20°C；如果是長期儲存的話，就應該放置於-80°C。儲存RNA時，可以加入少量的RNA酶抑制劑（RP5601），避免RNA的降解，RNA可以直接做下游實驗。如果要長期保存RNA，可以加入RNAlong。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會避免反復凍融損傷RNA，並預防偶然的RNase污染。

C. 病毒RNA的提取方法主要有哪幾種

方法很多（我從小木蟲粘貼了一份很全的流程），主流的有三種。
一、提禽流感病毒的詳細步驟，可參考（我提過N次做定量PCR都沒問題）：
1.取200ul樣品數+陰性對照+陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管
2.加600ul異硫氰酸胍，然後加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻
3.13000rpm離心15min
4.在第3步離心快結束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預冷的異丙醇
5.取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉移到第4步准備的管中，顛倒混勻
6.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
7.加600ul 75％乙醇，顛倒數次以洗滌殘存異丙醇
7.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
8.4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫乾燥2－3min（不可過分乾燥，防止下一步RNA不溶解）
9.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓後的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存備用（最好2小時內使用，以免RNA降解）
二、用TRIzol LS提取
應用TRIzol LS提取病毒RNA
所提取物為血清、血液、細胞培養液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無RNA酶的。
1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混勻，室溫放置10min。
1.2 加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震盪離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現象），室溫放置10min （由於氯仿沸點低、易揮發，振盪時離心管可能爆開，小心）。
1.3 離心 4℃、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）。
1.4 加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。
1.5 離心 4℃、13000r/min、15min，（這時乍一看會發現管子里好像沒有東西，再仔細看看，會發現靠近管底的壁上有一星點的白色沉澱物，就是它了）用槍小心吸去所有上清。
1.6 1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃、8000r/min、10min，（這時又會發現管子沒東西了，不要擔心，有的，但是因為量太少看不見罷了）用槍小心吸去所有上清，在超凈台中乾燥5min。
1.7 加入適量DEPC處理水。（如果材料來源豐富的話，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著點用，則自己看著辦了，盡量不要加太多的水）。
1.8 建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇後凍存於－70℃，可保存一年；若加入DEPC水後則只能在－20℃保存1個月左右。
三、Trizol法提禽流感病毒protocol
Trizol法適用於人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。
1、 取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻；
2、 室溫放置5分鍾，然後以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖盪離心管15秒；
3、 取上層水相於一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鍾，12000g離心10分鍾；
4、 棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鍾；
5、 重復第4步；
6、 小心棄去上清液，然後室溫乾燥5-10分鍾，注意不要乾燥過分，否則會降低RNA的溶解度；
7、 然後將RNA溶於水中，放置10分鍾。
[注意]
1、 整個操作要帶口罩及一次性手套，並盡可能在低溫下操作。
2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年
真核生物的基因組是DNA，為什麼不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之後，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質。
所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA裡面會含有非編碼區。要表達真核生物的基因並表達出相應的蛋白，只能通過提取其mRNA並RT-PCR這條頗費周折的途徑。
1．RNA的提取
RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然後經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉澱，洗滌，晾乾，最後溶解。但是由於RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。
1．1 分離高質量RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly(A)+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。
1．2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶
在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。
1．3 常用的RNA酶抑制劑
*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
*異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
*氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。
1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准備的工作
*盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區，離心機、移液器、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔，並定期進行除菌。
*操作過程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，並經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。
*盡量使用一次性的塑料製品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。
*關於一次性塑料製品，建議使用廠家供應的出廠前已經滅菌的tips和tubes等。多數廠家供應的無菌塑料製品很少有RNase污染，買來後可直接用於RNA操作。用DEPC等處理的塑料製品，往往由於二次污染而帶有RNase，從而導致實驗失敗。
*所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。
*配製溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應採用未開封的新瓶裝試劑。
*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。
*配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。
1．5 RNA提取的一般步驟
RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉澱RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA
破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布於上層，與蛋白層分開。
沉澱RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。
洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之後可以晾乾或者烤乾乙醇，但是不能過於乾燥，否則不易溶解。
融解RNA一般使用TE。
保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對於長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大於4kb的轉錄本對於痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲醯胺中，存於-70℃。用於保存RNA的甲醯胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源於胰臟的RNA至少可以在甲醯胺中保存一年。當准備使用RNA時，可以使用下列方法沉澱RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鍾。
1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法
TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的的水樣層後，RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的方式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉澱出蛋白。共純化DNA對於樣品間標准化RNA的產量十分有用。
TRIZOL是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚後立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩定保存12個月。盡管如此，為達到最佳效果，建議保存在2-8°C的環境下。
2．RT-PCR
RT-PCR是指將逆轉錄(Reverse Transcription；RT)反應和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。
2．1 RT-PCR的原理
RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用於對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易於操作。
RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然後取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一隻管中順次進行。
2．2 RT-PCR的步驟
⑴在冰浴離心管裡面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；
⑵70度水浴5分鍾，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；
⑶加入5×反應液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP 2uL（這些應該先配好，然後分再裝到每一管），混勻；
⑷37度水浴5分鍾，加入1uL AMV-RT反轉錄酶，混勻；
⑸37度水浴1小時（此步是反轉錄過程）；
⑹70度10分鍾結束反應（此處是滅活酶活性，避免對後續實驗產生干擾），產物置冰上進行下一步PCR實驗，餘下的-70度保存。
2．3 RT-PCR的引物設計
RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺點：
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。
* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。
* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。
* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。
目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時並不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。
引物的穩定性依賴於儲存條件。應將乾粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大於10μM濃度溶於TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。乾粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
2．4 引物退火溫度
引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對於設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低於估算的Tm 5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由於在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然後再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2．5 提高逆轉錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助於RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對於多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然後迅速置於冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性後也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高於60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鍾。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，並加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助於防止較低溫度時所發生的分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。
2．6 促進逆轉錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定並解開RNA二級結構，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油並在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。
在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，並不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。
使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶：逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA，不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，並降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。RNaseH-的MMLV逆轉錄酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全長。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。RT-PCR產物的大小受限於逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。RNaseH-的逆轉錄酶可以顯著提高長RT-PCR產物的產量，同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高於正常的37-42℃的溫度下進行。
2．7 RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對於某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了或AMV合成的cDNA所產生的信號。對於多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。
2．8 小量RNA檢測方法的提高
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助於增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨後的沉澱。對於小於50mg的組織或106個培養細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。
2．9 一步法同兩步法RT-PCR的比較
兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測多個mRNA時比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優點。一步法RT-PCR在處理大量樣品時易於操作，有助於減少殘余污染，因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，最低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增。對於成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。
2．10 增加RT-PCR特異性
第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。
隨機引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火，產生短的，部分長度的cDNA。這種方法經常用於獲取5'末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA，需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數真核細胞mRNA 3'端所發現的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用於多數RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因為其熱穩定性較好，適用於較高的保溫溫度。
基因特異性引物（GSP）對於逆轉錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用於設計PCR引物的規則同樣適用於逆轉錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對於部分擴增對象，為了成功進行RT-PCR，需要設計多於一個反義引物，因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合。建議在20μl的第一鏈合成反應體系中使用1pmol反義GSP。
2．11 提高逆轉錄保溫溫度
為了充分利用GSP特異性的全部優點，應該使用有較高熱穩定性的逆轉錄酶。熱穩定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那麼如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄，GSP所帶有的特異性就沒有完全利用。然而某些特別的逆轉錄酶可以在50℃或更高進行反應，這就會消除較低溫度時產生的非特異性產物。為獲得最大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度。這有助於防止低溫時分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉換。
2．12 減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產生於基因組DNA的產物，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鍾以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發生的依賴於鎂離子的RNA水解。
為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源於cDNA的PCR產物會比來源於沾染的基因組DNA的產物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源於基因組。

D. 植物RNA提取方法有哪些

植物提取物的提取方法
目前提取植物提取物常用的方法有溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法和酶提取法，而超臨界流體萃取法、微波輔助提取法等則作為新的提取技術被廣泛使用。
溶劑提取法
溶劑提取法是用溶劑從固體原料中提取有效成分，所用的溶劑必須具備與所提取的溶質互溶的特性。將植物材料粉碎後，放入適合的容器內，加入數倍量溶劑，可採用浸漬、滲漉、煎煮、迴流和連續提取法進行提取。巴科的丹參提取物就是用溶劑提取法提取的，精油類物質就是用溶劑提取法。
在溶劑提取法的提取工藝過程中，溶劑的濃度、料液比、提取溫度、提取的時間會直接影響有效成分的提取率。Cristina Juan等人通過溶劑萃取法提取大米中的赭麴黴素A，用熒光探測法和液相色譜法確定OTA的含量，研究表明在最適宜的料液比、提取溫度和提取時間的情況下，提取物OTA含量最高為4.17ng/g。Monte D. Holt等採用溶劑萃取法從生的和熟的小麥種提取烷基間苯二酚，實驗表明採用溶劑萃取法能夠節約提取時間。
超聲波提取法
超聲波提取是利用超聲波產生的強烈振動和空化效應加速植物細胞內物質的釋放、擴散並溶解進入溶劑中，同時可以保持被提取物質的結構和生物活性不發生變化。超聲波提取原理主要為物理過程，是近年來逐漸受到重視的一個較新的提取方法。對多數成分來說，超聲波提取方法較常規的溶劑提取能大幅地縮短提取時問，消耗溶劑少，浸出率高，因此具有較高的提取效率。
在超聲波法提取工藝過程中，溶劑的選擇和濃度、料液比、提取溫度、提取的時間會直接影響提取率。Ling Zhou等人利用超聲波提取法提取五味子，主要研究了超聲提取率的影響因素，實驗研究得出，提取率隨著溫度的升高而升高，隨著功率的增大而增大。Hong Van Le等利用超聲波提取櫻桃中的維生素E和酚類化合物，主要比較了超聲提取法和酶提取法在提取時間、提取率上的差異，實驗結果表明超聲波提取法時間上比酶提取縮短了6倍，超聲波提取的提取率是酶提取的2～3倍。鍾愛國等利用超聲波萃取鮮竹葉中葉綠素的方法，用分光光度計來定量測定所萃取的葉綠素的含量。結果表明：與常用的有機溶劑提取法相比，超聲波萃取法不僅萃取率高、速度快、效率高，而且是室溫提取，無需加熱，節約能源。

E. RNA的提取方法步驟及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一種總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速裂解細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進行提取組織或細胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在勻質化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細胞及溶解細胞成分。加入氯仿離心後，裂解液分層成水相和有機相。RNA存在於水相中。

水相轉移後，RNA通過異丙醇沉澱回收。移去水相後，用乙醇可從中間相沉澱得到DNA，加入異丙醇沉澱可從有機相得到蛋白質。

(5)rna的提取還有哪些方法擴展閱讀

與DNA不同，RNA一般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結構，但是很多RNA也需要通過鹼基配對原則形成一定的二級結構乃至三級結構來行使生物學功能。

RNA的鹼基配對規則基本和DNA相同，不過除了A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。

在細胞中，根據結構功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA（轉運RNA），rRNA（核糖體RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白質的模板，內容按照細胞核中的DNA所轉錄；tRNA是mRNA上鹼基序列（即遺傳密碼子）的識別者和氨基酸的轉運者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質合成的工作場所。

F. 常用的RNA分離方法有哪些

常見的RNA提取方法有苯酚法、陰離子去污劑法、LiCl一尿素法、改良的Gomez法、異硫氫酸胍法、CTAB法、熱硼酸法及改良熱硼酸法、TRIZOL試劑快速提取法。 RNA提取時，就變性劑的選擇來說，CTAB（CTAB法）比異硫氰酸胍（RIZOL試劑法）和SDS

G. RNA提取方法

1．提取
稱取鮮酵母 159或乾酵母粉 2.5g，倒入 100ml三角瓶中，加 NaCl 2.5g，水25ml，攪拌均勻，置於沸水浴中提取lh。
2．分離
將上述提取液用自來水冷卻後，裝入大離心管內，以4000r／min離心10min，使提取液與菌體殘渣等分離。
3．沉澱RNA
將離心得到的上清液傾於50ml燒杯內，並置入放有冰塊的250ml燒杯中冷卻．待冷至10℃以下時，用6mol／L HCI 小心地調節pH值至2.0～2.5（注意嚴格控制pH）。調好後繼續於冰水中靜置10min，使沉澱充分，顆粒變大。
4．洗滌和抽濾
上述懸浮液以 4000r／min離心 10min，得到 RNA沉澱。將沉澱物放在 10ml小燒杯內，用95％的乙醇 5～10ml充分攪拌洗滌，然後在布氏漏鬥上用射水泵抽氣過濾，再用 95％乙醇5～10ml淋洗 3次。
5．乾燥
從布氏漏鬥上取下沉澱物，放在6cm表面皿上，鋪成薄層，置於80℃烘箱內乾燥。將乾燥後的RNA製品稱重，存放於乾燥器內。