質粒dna的轉化的方法有哪些

Ⅰ 細菌基因轉移與重組的方式有哪些

細菌基因的轉移與重組的方式有轉化、轉導、溶原性轉換、接合。

1、轉化：受體菌直接攝取供體菌游離的DNA段，從而獲得新的遺傳性狀。

2、轉導：以溫和噬菌體為載體，將供體菌的遺傳物質轉移到受體菌中去，使受體菌獲得新的遺傳性狀。

3、接合：是指細菌通過性菌毛將遺傳物質（主要為質粒）從供體菌轉移給受體菌，使受體菌獲得新的遺傳性狀。

4、溶原性轉換：是由於溫和噬菌體的DNA（前噬菌體）整合到宿主菌的染色體DNA後，使細菌的基因型發生改變，從而獲得新的遺傳性狀。

(1)質粒dna的轉化的方法有哪些擴展閱讀：

細菌基因的轉移與重組屬於細菌變異。細菌從外源取得DNA，並與自身染色體DNA進行重組，引起細菌原有基因組的改變，導致細菌遺傳性狀的改變。

細菌變異現象在臨床上的實際意義:

1、診斷：應注意細菌的變異株，以免誤診，漏診。

2、治療：為提高抗菌葯物療效，防止耐葯菌株的出現與擴散，在治療前應先做葯敏實驗。

3、預防：用人工方法使病原出產生變異，減低毒力，保存免疫原性，制備減霉活疫苗，預防傳染病。

Ⅱ 質粒轉化步驟

質粒的轉化，滿滿干貨
原理：在受體細胞經過化學試劑或者電擊處理等方法處理後，受體細胞的膜通透性發生改變，質粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進入到細菌體內而實現擴增。

感受態細胞：是指細胞自然或者經過誘導處於容易吸收外源DNA的一種生理狀態。在基因工程中，用於轉化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導入外源DNA進行切割）一般通過誘導的方式實現。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。

質粒的轉化主要包含

Ⅰ感受態細胞制備

Ⅱ質粒DNA轉化

Ⅲ質粒DNA的提取

（Ⅰ）感受態細胞制備

1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個單菌落，接種於3ml LB培養基的試管中，37℃振盪培養過夜。

2）將該菌懸液按照1:100轉接到液體培養基中，100ml，37℃振盪擴大培養，2~3h。當培養液開始渾濁時，間段性測試OD600，在數值為0.3-0.5時停止培養。

3）培養好的菌液轉移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。

4）棄掉上清，管口倒置以便培養液棄除干凈。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣溶液30ml，小心懸浮沉澱細胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率）

6）4℃離心10min（4000r/min）。

7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細胞（冰上放置）片刻，感受態細胞製成。

8）可直接用於實驗，4℃保存。也可分裝長期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。

（Ⅱ）質粒DNA的轉化

1）取100ul新鮮制備的感受態細胞，加入質粒1ul DNA混勻,同時設置對照組（未加質粒，未加受體菌，已知具有轉化活性的DNA）。

冷凍的感受態細胞要在冰上解凍，待管中最後一點冰融化後，迅即加入DNA. 解凍感受態細胞溫度高於0℃，會降低轉化效率。

2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動離心管）。冰浴時間短於30min ,可能影響轉化率。然後迅速冰浴2min。

3）向離心管加800ulLB液體培養基，37℃振盪培養1h（150r/min）。37℃生長1小時能夠對於細胞恢復和抗生素抗葯性表達具有最佳效果。

4）取適當（50ul）的復甦細胞培養液，塗布在含抗性的選擇性培養基上，將培養皿放置在37℃恆溫培養箱中，正置30min。等菌液完全被培養基吸收後，倒置培養皿，在37℃恆溫培養箱中，培養12~16h，出現菌落。

5）菌落結果：

① 無菌落

失敗或者培養條件不充分

② 布滿菌落,

呈苔樣，失敗。可能是抗生素濃度不夠或失敗。出現大菌斑，大多是由於黴菌污染所致

③ 布滿菌落

濃度太高，失敗

④ 出現菌落

符合要求

Ⅲ）質粒DNA的提取

質粒DNA的提取，由於其本身分子量小，一般採用鹼裂解法提取。目前已研發出多種質粒提取試劑盒，實驗操作簡單，只需按照產品操作說明操作即可。不過對於其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實驗過程中的一些問題，或者能夠更好的解決問題。

各廠家提供的試劑盒中試劑不盡相同，一般的提取純化試劑盒，主要包括以下試劑：

A. 細胞懸浮試劑: 主要作用是將菌體細胞懸浮起來。菌體懸浮不完全會導致裂解不完全，質粒的提取純度和得率都會下降。通常需要在裡面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常選用Tris-HCl作為體系中pH穩定緩沖液。EDTA，金屬離子螯合劑可以和細菌體內的金屬離子結合而DNase的活性受到抑制。有的會有葡萄糖，可用來增加溶液粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉澱時間。

B. 細胞裂解試劑：主要作用是裂解細胞，通過鹼溶液的作用破壞細胞膜結構，使其雙層膜結構改變，而導致細胞裂解。一般由一定濃度的NaOH和SDS組成。SDS的作用與後期中和過程中清除掉蛋白質等細胞雜質有關系。此步驟中需要注意的是，鹼溶液的作用時間不能太長，也不可劇烈離心管，反之會導致鹼破壞基因組DNA，導致同等大小的基因組DNA被提純，造成污染。

C. 中和試劑：主要作用使中和掉細胞裂解試劑中的鹼性物質，並去除掉其中的蛋白等雜質物質。組份有醋酸鉀和醋酸，或者乙酸鉀和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多餘的鹽離子。DNA被試劑盒中的提取柱吸附之後，需要用wash buffer 洗脫掉多餘的鹽離子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇對後續酶切和測序反應會有影響，因此在後續洗脫DNA前，必須完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脫Buffer: 主要作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。

1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通過重力的作用，使平衡buffer都流出。

2.細胞收獲：對於高拷貝質粒（培養液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培養液,離心去上清；對於低拷貝質粒（培養液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培養液，離心去上清。

3. 細胞懸浮：加0.4mL的細胞懸浮液(containing RNase A)懸浮細胞，並使其混勻。

4. 細胞裂解：加入0.4mL細胞裂解液，通過上下顛倒帶蓋子管子5次使其輕輕混勻，不要渦旋，之後在室溫下放置5min.

5. 中和：加入0.4mL的中和試劑，立即混合均勻。當大的細胞顆粒被處理後，可能會進行更劇烈的搖動。但是，不要渦旋！~12,000xg離心混合物10min. 如果是採用的4°離心，上清液需要恢復到室溫，再加入到柱子中。

6. 裝柱：吸取步驟5中的上清液到平衡柱中。讓混合液通過重力的作用流出，棄掉流出液。

7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脫柱子量次。每次清洗讓清洗液通過重力的作用流出，棄掉流出液

8. 質粒DNA洗脫：加入0.9mL的Elution Buffer。讓Elution Buffer通過重力的作用流出。不要強行弄出裡面的液體。

9. 質粒DNA沉澱：加入0.63mL異丙醇去析出，混勻，~12,000xg at/4°C離心30min。小心的去掉上清，之後風干10分鍾

10. DNA純化：將管子中的DNA溶解到TE buffer中。將這些溶液轉移到新管中。

重組質粒鑒定的方法：

① 雙酶切後跑電泳；直接DNA電泳可判斷整個DNA重組質粒是否正確。② PCR(插入片段在2kb以下時)，然後電泳。

③ 送公司測序（最為准確的鑒定方式）。

影響轉化效率的因素：

① 細胞狀態和細胞密度: 培養菌最好選用傳代次數少，且保存於-70℃或者-20℃。不要使用經過多次轉接或者保存於4℃環境中培養菌。細胞生長密度以剛進入對數其為最好，可通過檢測培養液的OD600值來判斷，密度過高或者不足，都會影響轉化效率。通常DH5α菌株在OD600的值為0.5左右，細胞密度在5*107個/ml左右比較合適。密度過高或者不足均會影響轉化效率。

② 質粒的質量和濃度：轉化的質粒DNA中，超螺旋狀態的質粒，轉化效率最好。在一定濃度范圍內，轉化的效率與添加質粒的濃度成正比。不過在添加的質粒的量和體積過大的時候，轉化效率也會降低。質粒的分子量越大，通常來說轉化率也會降低。

③試劑的質量：轉化過程中所用的試劑，如氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率。

④防止雜菌和DNA污染：實驗需要在無菌條件下進行，所用的儀器和試劑均需要滅菌處理，並防止在實驗過程中引入其他污染。

⑤培養過程的條件：培養瓶中培養基的量關乎到菌體生長過程中的能量代謝。通常來說厭氧環境做出來的感受態的轉化效率較低。建議500ml三角瓶液體培養基量不超過100ml, 250ml三角瓶液體培養基量不超過50ml. 培養基的pH值要適宜，接種前一般pH值在6.8-7.2，等培養結束後可以再測一下pH值最好在6.5以上（不低於6.0），表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好。培養基中的各種離子和溫度，也對形成好的感受態有關系。

幾種擴增常用感受態細胞：

① 普通骨架載體cDNA產品

DH5α：常用於質粒克隆，可用於藍白斑篩選

TOP10：適用於高效的DNA克隆和質粒擴增，能夠保證高拷貝質粒的穩定遺傳。

TG1: 生長速度快，常用於噬菌體的制備，同時也可用於普通質粒的構建。

CopyCutter：適用於有毒克隆。

② 慢病毒載體質粒：

Stbl3: 是慢病毒載體系統推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率

Stable（NEB）：可用於逆轉錄病毒/慢病毒載體系統擴增。

Ⅲ 質粒的轉換的方法有哪些質粒轉化後如何篩選

轉化的方法：最常用的是感受態法，包括熱激和電轉化等，轉染不是轉化，這是不同的概念。

轉化後，可以根據質粒上帶有的某種特殊基因的表達來鑒定菌落，最常用的有：抗葯性基因的表達，比如質粒帶有氨苄抗性基因，能在AMP平板上長的一般可以初步判斷為轉化成功的菌；還有就是顯色篩選，比如質粒上的LacZ基因表達，間接促使添加了X-gal的培養基變藍，綠色熒光蛋白基因表達後菌落發熒光等。

Ⅳ dna轉化有哪些方式合有何優點

DNA轉化的范圍較廣，但以植物細胞中的轉化為主，現將其方式及優點闡述如下：

1、農桿菌介導基因轉化：

• 轉化原理:農桿菌是普遍存在於土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，並誘導產生冠癭瘤或發狀根。根癌農桿菌和發根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中,並且可以通過減速分裂穩定的遺傳給後代，這一特性成為農桿菌介導法植物轉基因的理論基礎。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然後通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。

• 特點：操作簡便、成本低、轉化率高，廣泛應用於雙子葉植物的遺傳轉化。

2、基因槍轉化：

• 轉化原理：利用火葯爆炸或高壓氣體加速，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然後通過細胞和組織培養技術，再生出植株，選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株。

• 特點：基因槍轉化率差異很大，相對於農桿菌介導的轉化率要低得多，而且基因槍轉化成本高，嵌合體比率大，遺傳穩定性差。它的一個主要優點是不受受體植物范圍的限制，而且其載體質粒的構建也相對簡單。

3、花粉管通道法：

• 轉化原理：在授粉後向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，並進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為帶轉基因的新個體。

• 特點：不依賴組織培養人工再生植株，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規育種工作者易於掌握。

Ⅳ 什麼是DNA直接轉化法

通過生物學、物理學和化學等方法使外源裸露DNA進入受體細胞，並在受體細胞內穩定維持和表達的過程稱為轉化。如果外源DNA分子是病毒（噬菌體）的DNA或cDNA，那麼把此過程也稱為轉染。（1）直接轉化法：有的微生物細胞在不加任何處理的情況下就能直接攝取外源DNA，只要外源DNA與這樣的細胞混合，在適宜的條件下懸浮培養，就能完成外源DNA的轉化。

（2）化合物誘導轉化法：用二價陽離子（如Mgsuperscript2+superscript、Casuperscript2+superscript、Mnsuperscript2+superscript）處理某些受體細胞，可以使其成為感受態細胞，即處於能攝取外源DNA分子的生理狀態的細胞。採用這種轉化方法，1μg質粒DNA可以獲得5×10superscript6superscript7×10superscript7superscript個被轉化的菌落（轉化子），這是實驗室中常用於微生物的一種轉化方法。

（3）接合轉化法：接合轉化是通過供體細胞同受體細胞間的直接接觸而傳遞外源DNA的方法。該轉化系統一般需要三種不同類型的質粒，即接合質粒、輔助質粒和運載質粒（載體）。這三種質粒共存於同一宿主細胞，與受體細胞混合，通過宿主細胞與受體細胞的直接接觸，使運載質粒進入受體細胞，並在其中能穩定維持。現在常把接合質粒和輔助質粒同處於一宿主細胞（輔助細胞），再與單獨含有運載質粒的宿主細胞（供體細胞）和被轉化的受體細胞混合，使運載質粒進入受體細胞，並在其中能穩定維持。也有把接合質粒和運載質粒同處於一宿主細胞，再與單獨含有輔助質粒的宿主細胞和被轉化的受體細胞混合進行轉化的。由於整個接合轉化過程涉及到3種有關的細菌菌株，因此稱為三親本接合轉化法，此方法主要用於微生物細胞的基因轉化。

（4）激光微束穿孔轉化法：此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束（laser：microbeam）聚焦成微米級的微束照射受體細胞，利用其熱損傷效應可導致細胞膜的可逆性穿孔。根據這一原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然後用激光光源替代熒光光源進行照射，導致細胞膜穿孔，處於細胞周圍的外源DNA分子隨之進入細胞。這種方法操作簡便快捷，基因轉移效率高，無宿主限制，可適用於各種植物細胞、組織、器官的轉化操作，並且由於激光微束直徑小於細胞器，可對線粒體和葉綠體等細胞器進行基因操作，但該方法因儀器昂貴，轉化率較低，故有待於進一步研究和完善。

（5）超聲波處理轉化法：由於超聲波頻率高、波長短，因而在傳播過程中具有定向性好、能量大、穿透力強等特徵。超聲波法轉化（ultrasonic：transformation）法就是利用低聲強脈沖超聲波的生物學效應擊穿細胞膜造成通道，從而使外源DNA進入細胞。此轉化途徑可以避免脈沖高壓對細胞的損傷作用，有利於原生質體的存活。超聲波處理轉化法的轉化率較高，並且利用超聲波處理可以避免使用電穿孔轉化時高電壓脈沖對細胞的損傷，有利於細胞存活，目前主要用於微生物細胞的基因轉化。此外，該法具有操作簡便、設備便宜、不受宿主范圍限制等優點。

（6）脂質體介導轉化法：脂質體（liposome）法是根據生物膜的結構和功能特徵，用磷脂等脂類化學物質合成的雙層膜囊將DNA或RNA包裹成球狀，導入原生質體或細胞，以實現遺傳轉化的目的。脂質體法有兩種具體方法：其一是脂質體融合法（liposome：fusion），先將脂質體與原生質體共培養，使脂質體與原生質體膜融合，而後通過原生質體的吞噬作用把脂質體內的外源DNA或RNA分子高效地轉入到植物的原生質體內，最後通過原生質體培養技術，再生出新的植株；其二是脂質體注射法（liposome：injection），通過顯微注射把含有外源遺傳完整的脂質體注射到植物細胞以獲得轉化。

（7）電擊法：電擊法（eletroporation）也稱電穿孔法，其原理是利用高壓電脈沖作用在原生質體上「電激穿孔」，形成可逆的瞬間通道，從而促進外源目的基因的攝入。隨著技術的改進，並與化學法結合，目前該法的轉化率可高達1.2%。

（8）磷酸鈣轉染法：磷酸鈣轉染法的依據是有的動物細胞能捕獲黏附在細胞表面的DNA—磷酸鈣沉澱物，使DNA轉入細胞。基本操作過程為：將待轉染的外源DNA同CaClsubscript2subscript混合製成CaClsubscript2subscript·DNA溶液，逐滴加入到不斷攪拌的Hepers—磷酸鈣溶液中，形成DNA—磷酸鈣共沉澱復合物，然後用吸管將沉澱復合物黏附在哺乳動物單層培養細胞的表面上，保溫幾小時後，用新鮮培養液洗凈細胞，再用新鮮培養基繼續培養，直至外源基因表達。