疾病鑒定有哪些方法

❶ 花卉病毒類似病害的診斷和鑒定方法有哪些

植原體、螺原體等無壁菌門的原核生物造成的植物病害與植物病毒產生的症狀相似，無病症表現，因此，它們又叫病毒類似病害。花卉上比較常見的是植原體病害，因此我們介紹一下植原體病害的診斷和鑒定。

1 超薄切片，電鏡下觀察植原體

方法如植物病毒的超薄切片和電鏡觀察。

2 抗生素治療診斷

用四環素、土黴素和金黴素等對受病植株進行葉面噴施和灌根，植原體對這幾種抗生素敏感，病害症狀可以得到緩解。而植物病毒對抗生素不敏感，如果施用，對病害無效。

3 植原體PCR檢測

根據植原體的共同保守序列，用植原體16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2進行植原體直接PCR擴增，可擴增到植原體的特異擴增帶。

還可以將直接PCR產物分別稀釋40倍後，引物換為R16R2/R16F2進行巢式PCR擴增，可得到與引物設計相符的植原體的特異擴增帶，說明為植原體病害。

這里以仙人掌植原體叢枝病的PCR檢測為例，介紹植原體的PCR檢測技術。

實驗操作如下：

Ⅰ.總核酸提取

（1）取0.3g植株幼嫩組織，用液氮冷凍後充分研磨成粉狀。

（2）移入含有0.6ml預熱到60℃的CTAB DNA提取緩沖液中，在60℃水浴中溫浴30min。

（3）加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），抽提30min。

（4）12000r/min離心8min，取上清液，重復（3）、（4）步直至蛋白質除盡。

（5）加入氯仿∶異戊醇（24∶1），抽提30min，12000r/min離心8min，取上清液。

（6）加入等體積預冷的異丙醇及1/10體積的醋酸鈉（3mol/L，pH5.2），混勻，-20℃保持至少30min，14000r/min離心10min，使核酸沉澱。

（7）用70%乙醇洗滌2次後，.真空乾燥。

（8）沉澱溶解於100μl TE緩沖液中。

（9）取10μl DNA經0.7%瓊脂糖凝膠電泳後觀察結果，計算DNA濃度。其餘於-20℃冰箱中保存備用。

Ⅱ.PCR擴增

參照Lee所報道的植原體16S rRNA基因通用引物對R16mF2/R16mRl序列和R16F2/R16R2序列合成引物，引物序列如下：

R16mF2：5′-CATGCAAGTCGAACGGA-3′

R16mRl：5′-CTTAACCCCAATCATCGAC-3′

R16F2：5′-ACGACTGCTGCTAAGACTGG-3′

R16R2：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3′

引物溶解於適量滅菌水中至終濃度為10μmol/L。

直接PCR（Direct-PCR）：

（1）取一PCR薄壁管，依次加入下列試劑

10×PCR反應緩沖液 5μl

5mmol/L MgCl2 4μl

2.5mmol/L dNTP 4μl

R16mF2（或R16F2） 3μl

R16mRl（或R16R2） 3μl

4U/μl 1TaqDNA聚合酶 1μl

模板 2μl

加入雙蒸水至終體積為50μl，混勻並加入30μl石蠟油。

（2）PCR擴增。反應循環為95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，35個循環後於72℃保溫10min，4℃冰箱中保存。

（3）取5μl PCR產物於1%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增結果。

巢式PCR（Nested-PCR）：

將用引物對R16mF2/R16mRl擴增的直接PCR產物按1∶40比例稀釋後，作為反應模板，引物對換為R16F2/R16R2，退火溫度升高至60℃，其餘反應條件同直接PCR。

Ⅲ.結果

用植原體16S rRNA基因通用引物R16mRl/R16mF2進行植原體直接PCR擴增，可擴增到一條約1.5kb的特異擴增帶（圖1）。通過實驗，用泡桐叢枝作為植原體的陽性對照，檢測出YNOl樣品（仙人掌品種珊瑚枝叢枝）和YNO2（仙人掌品種堆羅漢叢枝）為植原體病害。其他YNO3（仙人掌品種豬耳掌叢枝）、YNO4（仙人掌品種金獅子叢枝病）、YNO5（仙人掌品種青海波叢枝）不是植原體病害，可能為品種的特性。

圖1 直接PCR擴增結果

❷ 病毒鑒定常用方法有哪些

寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學交叉反應，目前主要採用病毒核酸檢測。
開展蚊媒寨卡病毒檢測時，對捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進行病毒核酸檢測。
開展寨卡病毒實驗室檢測時，應同時考慮登革病毒和基孔肯亞病毒感染可能。登革病毒和基孔肯亞病毒實驗室檢測應按照相應的技術指南開展。
（一）臨床標本檢測。
1．病原學檢測
病原學檢測主要適用於急性期血液標本，一般認為發病7天內檢測陽性率高。
（1）核酸檢測：採用熒光定量RT-PCR方法，是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段。
（2）病毒分離：將標本接種於蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞（BHK21、Vero）進行分離培養，出現病變以後，用檢測核酸的方法鑒定病毒。也可使用乳鼠腦內接種進行病毒分離。
2．血清學檢測
（1）血清特異性IgM抗體：發病3天後可檢出病毒特異性IgM抗體，但發病7天後檢出率高。可採用ELISA、免疫熒光等方法檢測。IgM抗體陽性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強的交叉反應，易於產生假陽性。
（2）中和抗體：採用空斑減少中和試驗方法檢測。患者恢復期血清中和抗體陽轉或滴度較急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染，可以確診。
（二）媒介標本檢測。
1．標本處理
將分類後的伊蚊成蚊或幼蟲，按照採集地點，每10～20隻為一份進行研磨處理。
2．病毒核酸檢測
用RT-PCR的方法進行寨卡病毒核酸檢測
3．病毒分離
病毒核酸陽性的標本進行病毒分離。