寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學交叉反應，目前主要採用病毒核酸檢測。
開展蚊媒寨卡病毒檢測時，對捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進行病毒核酸檢測。
開展寨卡病毒實驗室檢測時，應同時考慮登革病毒和基孔肯亞病毒感染可能。登革病毒和基孔肯亞病毒實驗室檢測應按照相應的技術指南開展。
（一）臨床標本檢測。
1．病原學檢測
病原學檢測主要適用於急性期血液標本，一般認為發病7天內檢測陽性率高。
（1）核酸檢測：採用熒光定量RT-PCR方法，是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段。
（2）病毒分離：將標本接種於蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞（BHK21、Vero）進行分離培養，出現病變以後，用檢測核酸的方法鑒定病毒。也可使用乳鼠腦內接種進行病毒分離。
2．血清學檢測
（1）血清特異性IgM抗體：發病3天後可檢出病毒特異性IgM抗體，但發病7天後檢出率高。可採用ELISA、免疫熒光等方法檢測。IgM抗體陽性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強的交叉反應，易於產生假陽性。
（2）中和抗體：採用空斑減少中和試驗方法檢測。患者恢復期血清中和抗體陽轉或滴度較急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染，可以確診。
（二）媒介標本檢測。
1．標本處理
將分類後的伊蚊成蚊或幼蟲，按照採集地點，每10～20隻為一份進行研磨處理。
2．病毒核酸檢測
用RT-PCR的方法進行寨卡病毒核酸檢測
3．病毒分離
病毒核酸陽性的標本進行病毒分離。
㈡ 豬圓環病毒2型與豬附紅細胞體混合感染的診斷與防治
豬圓環病毒2型與豬附紅細胞體混合感染的診斷與防治
稅光偉 韓旭 張成偉 洪洋 魏攀 指導老師：趙光偉
西南大學榮昌校區動物醫學系，榮昌 402460
摘要:隨著我國養豬業集約化程度的提高，生豬和種豬跨地域運輸越來越頻繁，使得豬群傳染病的發生越來越復雜。在很多豬場，都同時存在多種病原的混合感染。2009年1月四川隆昌某豬場送檢病豬3頭。該場中部分豬只陸續發生高熱、皮膚發紺、呼吸困難等症狀，病程一般持續5～7天，發病豬一般以死亡為轉歸。不同年齡段的豬群中均有不同程度的發生，臨床表現基本相似。通過臨床症狀和病理剖檢，疑似豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬圓環病毒2型（PCV-2）、豬附紅細胞體（E.suis）混合感染。據此筆者在西南大學榮昌校區動物疾病快速診斷中心做了確診實驗。
關鍵詞:圓環病毒2型 附紅細胞體 混合感染 綜合防治
Diagnosis and Treatment
of Porcine circovirus type 2 mixed infection Eperythrozoon
Shui Guang Wei
Southwest China Normal University of Rongchang campus veterienary medicine department, Rongchang 402460, China
Abstract: Along with our country pig-breeding instry intensification degree's enhancement, the live pig and the kind of pig cross region transportation is getting more and more frequent, causes the pig group infectious disease's occurrence to be getting more and more complex. In many pig farms, simultaneously has many kinds of causes of disease the mixed infections. In January, 2009 Sichuan Longchang one pig farm deliver examines the sickness pig 3 heads. This partial pigs only one after another have symptoms and so on high fever, skin cyanosis, scant of breath, the course continue generally for 5~7 days, the morbidity pig take die generally as the extension turn over. In the disparity in age section's pig group has the varying degree occurrence, clinical manifestation basic similar. Split through the clinical symptoms and the pathology examine, I doubt that the sickness pigs mixed infection with PRRSV virus、PCV-2 virus 2 and E.suis. According to this,We decide to finish it in the southwest university of Rongchang campus animal disease fast diagnostic center.
Key word: Porcine circovirus type 2 Eperythrozoon Mixed infection Integrated Control
1 材料與方法
1．1Bio-Rad PCR儀、菲恰爾（GL-16A）離心機、JUNYI紫外燈（JY04S-3C）、蘇靜安泰超凈工作台、Pipet.Lite微量可調移液器等。所有實驗均在西南大學榮昌校區動物疾病快速診斷中心進行。
1．2豬圓環病毒（PCV）核酸擴增檢測試劑盒、豬藍耳病病毒（PRRSV）核酸擴增檢測試劑盒均購自北京索奧生物技術有限公司。
2 臨床症狀
2．1病豬體溫41～42℃，稽留熱、精神沉鬱、皮毛粗亂、心跳和呼吸加快、雙側性震顫，耳部、腹下、腹股溝、四肢出現不規則的紫斑，指壓不褪色，有較濃的眼屎、眼結膜蒼白、厭食或不食、呼吸困難、後軀無力、行走搖擺，病豬初期便秘，呈糞球狀，小便深黃色，發病後期下痢和便秘交替出現。
3 病料採集
對瀕死期的或剛剛死亡的豬進行仔細剖檢，無菌操作下分別採集心血、肝、脾、腎等病料，供實驗室檢測用。
4 細菌學檢查
4．1血液壓片 取抗凝血或鮮血一滴，加3－4倍生理鹽水稀釋，蓋上蓋玻片，1000倍油鏡下觀察，可見大多數紅細胞邊緣呈鋸齒狀、星芒狀或不規則狀，並有微微顫動，即可診斷為附紅細胞體感染陽性。判定標准:在油鏡下檢查20個視野，有25個以下附紅細胞體的為感染+，有25－50個附紅細胞體的為感染++，有50－70及70以上個附紅細胞體的為感染+++。
4．2組織塗片 將無菌採取的肝、脾、腎及淋巴結塗片，革蘭氏染色鏡檢。
5 PRRSV和PCV－2的PCR檢測
5．1核酸提取 病料RNA和DNA的提取分別用Trizol reagents(RNA提取液)和核酸提取液B（DNA）提取，按照說明書提供的方法進行。首先將血清稀釋，取100ul釋出血清加入500ul Trizol reagents（RNA提取液）充分震盪，混勻後室溫放置5min。加入100ul氯仿，用力振盪15s，室溫靜置10min，4℃13，000 rpm離心5min。小心將上層水相轉移到干凈的離心管，加入等體積的異丙醇，充分混勻，13，000 rpm離心5min。棄上清，加入75％DEPC 乙醇，充分混勻，13，000 rpm離心5min，小心吸去大部分乙醇。將提取管口敞口在室溫空氣中乾燥5min，待乙醇揮發干凈，用20ul DEPC H2O溶解沉澱。
5．2逆轉錄 根據標本數取逆轉錄反應管，取2ul上述獲得的RNA並加入7ul PRRSV－SM RT MIX引物進行逆轉錄。PRRSV 逆轉錄的反應體系為25ul，反應條件為：30℃5min，42℃45 min後98℃5min滅活轉錄酶。PCV－2 PCR檢測則省去RNA提取與逆轉錄步驟，直接進行相應的擴增。
5．3擴增PCR PRRSV PCR擴增的反應體系為25ul。PRRSV PCR擴增反應條件為：94℃變性2min,93℃→2min，93℃ 30 s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35個循環；PCV-2 PCR擴增反應條件為：93℃→2min，後93℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 30s,共35個循環。
5．4電泳檢測 取15ul PCR擴增產物直接用加樣槍點樣於2％瓊脂糖凝膠膠孔中，以5 v/cm電壓，1 x TAE中電泳20min後，紫外燈下觀察結果。用DL2000 Marker作為參照。PRRSV和PCV－2的陽性擴增帶分別為396bp和143bp。
6 結果
6．1剖檢變化 瀕死期病豬的典型表現為：病豬屍體消瘦，不同程度的貧血和黃疸，體表皮膚、粘膜黃染，血液稀薄呈水樣；皮下水腫，呈黃白色；體表和腸系膜淋巴結充血、出血和水腫；淋巴結腫大4～5倍，切面外翻，尤以腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、氣管和支氣管淋巴結明顯，切面多汁呈黃色；肺部的病變主要是腫脹、間質增寬，有散在的橡皮樣硬塊；肝臟變性且有輕微黃疸、腫大，呈黃棕色；脾臟腫大；腎臟水腫，顏色呈灰白色，覆蓋有小出血點。部分病豬心肌變軟，心包積液。
6．2細菌學檢查結果
6．2．1血液壓片 1000倍油鏡下觀察，可見大多數紅細胞邊緣呈鋸齒狀、星芒狀或不規則狀,診斷為附紅細胞體感染陽性，標記為：+++,結果見圖2。
6．2．3組織塗片 革蘭氏染色鏡檢，未見細菌。
6．3電泳檢測結果：豬圓環病毒（PCV－2）為陽性；藍耳病病毒（PRRSV）檢測為陰性。結果見圖1。
圖1 PCV-2和PRRSV PCR檢測結果 圖2 血液壓片油鏡觀察
M：DL2000 Marker；1：PCV-2 PCR產物；2：PRRSV PCR產物
7 防治措施
7．1該病目前尚無疫苗預防，改進飼養管理，對發病嚴重的病豬立即淘汰，發病輕微的豬進行隔離治療。用2％ ～3％的燒鹼對豬舍進行徹底消毒，保持豬舍飼養用具的清潔衛生；切斷附紅細胞體病的傳播途徑。給予全價飼料增加機體的抗病能力，減少不良應激的發生。改進飼養管理，減少應激是控制繼發感染的關鍵。特別是仔豬斷奶後的3～4周是預防該病最關鍵最有效的時期，要降低飼養密度，盡量減少豬群的應激因素，做好豬瘟、豬偽狂犬病、豬細小病毒病、豬藍耳病疫苗的接種工作，做好豬群平時葯物預防工作，母豬在產前1周和產後1周在飼料中可添加土黴素等抗菌葯物，仔豬在斷奶前1周至斷奶後1個月在飼料中可添加強力黴素等抗菌葯，同時也拌料一些有預防作用的中葯，如清溫敗毒散進行預防，以減少該病在豬群中流行。
7．2豬圓環病毒是豬的免疫抑制性疾病，引起和繼發感染的疾病已成為世界養豬業的大敵。目前仍無有效防治措施，採取的方法是控制繼發感染，特別要加強斷奶仔豬的營養和管理，採取葯物預防，降低豬群死亡率，減少經濟損失。
7．3對症治療
7．3．1治療圓環病毒病目前尚無特效的治療葯物，應早發現，早確診，早治療。對發病不嚴重的豬只，選用新型的抗病毒劑如干擾素、白細胞介導素、免疫球蛋白、轉移因子等進行治療；同時採用黃芪多糖注射液並配合Vb1、Vb12、Vc肌肉注射，增強豬自身免疫力；另外，也要採用抗菌葯物，控制繼發感染，如氟苯尼考、阿米卡星、鹽酸林可壯觀黴素等配合治療，盡量少用磺胺類葯物和地塞米松進行治療。
7．3．2目前對豬附紅細胞體病療效較好的葯物有長效土黴素，四環素，貝尼爾等，按說明劑量肌注24h後，可見臨床症狀改善，連用3～5d。另外，對陽性豬群的貧血豬，可應用鐵制劑(右旋糖酐鐵)、土黴素、Vb12、VC等對症治療。
8 小結與討論
8．1此次疫病根據流行病學、臨床症狀和剖檢變化及實驗室診斷，最後確診為豬圓環病毒2型與附紅細胞體混合感染。
8．2豬圓環病毒病是由豬圓環病毒感染所引起的以免疫抑制為特徵的一類病毒性傳染病。PCV-2感染新生仔豬及斷奶仔豬，使仔豬發生先天性震顫和斷奶後全身消耗性綜合征，是一種慢性消耗性疾病，導致斷奶仔豬生長緩慢、發育障礙、機體免疫力下降、易繼發其他疾病(附紅細胞體病、弓形體病、豬瘟等)而加重病情。要抓住關鍵時期，減少應激，仔豬斷奶後3～4周，是預防圓環病毒的最關鍵時期，最有效的方法和措施是盡可能減少斷奶仔豬的應激。經分析，豬長途販運，使動物機體產生一定的應激反應，加上抵抗力下降，特別是感染附紅體和弓形體病後，進一步降低機體的免疫力，當遇到傳染性疾病流行時，特別是遇到豬圓環病毒感染侵襲，就會造成病豬死亡率增高。
8．3豬附紅細胞體病是由豬附紅細胞體引起豬的一種血液病，蚊蟲是重要的傳播媒介，尤其在多雨季節蚊蟲易孳生，加上豬群感染圓環病毒，機體抵抗力下降，而發生豬附紅細胞體病。防治該病應消滅蚊蟲，切斷傳播途徑，加強器械的消毒，提高管理水平。從現在的季節來看，正是春季，氣溫時高時低，忽熱忽冷，春季又是病菌活動頻繁季節，所以加快了疫病流行。另外，老鼠可傳播多種疾病，若鼠害控制不力，則易引起疾病的發生，因此，必須控制鼠害。
8．4為了減少疾病的發生，規模化養豬場必須堅持自繁自養，做到全進全出，加強平時消毒工作，這樣盡可能地避免或減少疫病的傳入和流行。
8．5附紅細胞體病的死亡率很低，但與豬圓環病毒混合感染後，死亡率就會顯著上升，可達60％以上，這也是造成病豬死亡率增高的重要原因。採用綜合措施後，該豬場的病情基本穩定，得到了有效控制，到2月下旬逐漸恢復正常。
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