Ⅰ 為什麼葯典裡面蘄蛇用特異性PCR法， 而川貝母用PCR-RFLP法
蘄蛇和川貝母各自的特性決定了辨別它們採用的方法。
PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經芹哪常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補嫌胡碼鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。
PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性做裂酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶。此項技術大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短。
Ⅱ .為什麼葯典裡面蘄蛇用特異性PCR法而川貝母用PCR-RFLP法作為辨別方法。是否川
蘄蛇屬於動物，川貝母屬於植物。
使用PCR方法鑒別蘄蛇的真偽，只通過大虧禪簡單的DNA提取、PCR特異性擴增、電泳檢測即可完成對樣品真偽的鑒別。主要用於蘄蛇葯材、空寬蘄蛇水提物、蘄蛇醇提物、極限(高溫、高壓、長時間)條件下蘄蛇提取物、中葯制劑(多種同類提取物)以及極限(高溫、高壓、長時間)條件處理中葯制劑(多種同類提取物)的快速鑒定。
川貝母的鑒別檢驗主要依靠性狀鑒別，但是，有些混淆品的外觀性狀與川貝母十分相似，很難就此作出客觀准確的判斷。自《中華人民共和國葯典》2010年版第一增補本起，川貝母項下收錄了聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法，用於川貝母鑒別。PCR-RFLP法可以成功檢出川貝母中是否摻雜了川貝母以外的成分，且靈滾塵敏度較高，5%的摻偽即能檢出。
Ⅲ 為什麼葯典裡面蘄蛇用特異性 PCR 法，而川貝母用 PCR - RFLP 法作為辨別方法
蘄蛇的生物特性與川貝母的植物特性差別，使它們採用不同的檢測方鬧頃談法。
根據蘄蛇保守序列設計的專一性引物，與其它物種的DNA無交叉反應，因而蘄蛇適合特異性PCR法。貝母屬植物種類液碰繁多，不同基源的貝母葯材大多具有相似的性狀特徵，而同一基源的川貝母也會因產地不同導致性狀存在差別，所以川貝母更適合用乎帆PCR-RFLP法。
Ⅳ 請學生物的同學幫忙介紹一下「PCR」
PCR
一、PCR概述
1、什麼是PCR
聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。 由美國科學家PE（Perkin Elmer珀金-埃爾默）公司遺傳部的Dr. Mullis發明，由於PCR技術在理論和應用上的跨時代意義，因此Mullis獲得了1993年化學諾貝爾獎。
2、PCR技術發展史
PCR原理是由一對引物介導，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進行快速酶促擴增，經過n個熱循環擴增，擴增產物中所含特定基因數是原始模板數的(1+E)n(0＜E＜1,擴增效率＝倍，使得檢測擴增產物中的特定基因成為可能。
聚合酶鏈式反應自從1993年到現在很快經歷了四代產品：
第一代：手動/機械手式水浴基因擴增
如上圖所示，用三個恆溫水浴箱，分別將三個水浴溫度恆定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個裝有PCR標本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴，標本在每個水浴箱中恆溫的時間用秒錶計時。這樣PCR標本就能完成下述形式的熱循環：
94℃ 30S 58℃ 45S 72℃ 60S
40次循環
這種方法的特點是：實驗人員勞動強度大，容易因疲勞引起差錯；而優點是:設備簡單，投資少，與自動化基因擴增儀相比，它無須升降溫過程，實驗時間短，試驗更接近理想PCR反應條件，事實表明實驗效果還是不錯的，但由於標本試管從一個水浴箱往另一個水浴箱移動中要較短暫暴露於空氣中，因此如移動速度不夠快時也會對標本形成溫度干擾，影響結果。本方法的另外一些缺點包括只能局限三個溫階（某些PCR反應需要多於三個溫階）、液體污染以及在低氣壓地區水溫難以燒到94℃變性溫度等。
為改進提高本方法的自動化水平，有人設計了機械手裝置，替代上述手工移動標本過程，形成了機械手水浴式基因擴增儀，該改進解決了實驗人員的高強度勞動問題，但又帶來了一個機械手部件大行程頻繁相對運動而引起的高故障。這種類型的基因擴增儀在九十年代中期我國北京、上海有定型的產品銷售，應用也較廣，曾為我國的分子生物學的發展做出過積極貢獻，而後便逐步被自動化程度更高的擴增儀替代，現在很少有單位使用。
第二代：自動化控制型定性基因擴增儀
與上述水浴式擴增儀相比，也有人稱該種擴增儀為乾式基因擴增儀，它是最具代表性的擴增儀，包括後續介紹的第三代、第四代都是以第二代為基礎集成了定量檢測部分。
第三代：終點定量/半定量
第二代的定性PCR只能判斷陰性陽性，而無法評價特定核酸的濃度及定量分析，定量PCR至少能達到定性PCR無法實現的下列功能：
•潛伏期病毒濃度探測
•感染程度
•致病病原體數量變化測定
•抗病毒葯物療效評估
•恢復期病毒載量檢測
自從1996年美國ABI公司發明第一台熒光定量PCR儀以來，PCR技術和應用從定性向定量快速發展.終點定量PCR的優點是設備投資少，對於國內經濟條件還不能購買昂貴實時熒光定量PCR儀的科研單位和醫療機構，利用現有的第二代常規定性PCR儀，在添加一台專用的單孔PCR終點產物熒光定量檢測儀便可開始工作，起到定量的作用。終點定量PCR技術是從定性向實時定量過渡的一個中間產品，而PCR終點產物熒光定量儀進口產品較少，國產儀器較多，如西安天隆的TL988，上海棱光的DA620型等
第四代：實時定量PCR
實時定量QPCR儀＋實時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟體，構成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統。
見下圖：(略)
2、實時熒光定量PCR的優勢：
設備由熒光定量系統和計算機組成，用來監測循環過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發的實時分析軟體以圖表的形式顯示。原始數據被繪製成熒光強度相對於循環數的圖表。原始數據收集後可以開始分析。實時設備的軟體能使收集到的數據進行正常化處理來彌補背景熒光的差異。正常化後可以設定域值水平，這就是分析熒光數據的水平。樣品到達域值水平所經歷的循環數稱為Ct值（限制點的循環數）。域值應設定在使指數期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最准確，可重復性的數據。如果同時擴增的還有標有相應濃度的標准品，線性回歸分析將產生一條標准曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。
3、實時熒光定量PCR技術原理
所謂real-time Q-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。在 real-time 技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。（2）此後熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-time Q-PCR方法在研究工作中的運用。
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，最終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平台期。在傳統的PCR 中，常用凝膠電泳分離並用熒光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在real-time Q-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪製成一條曲 線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而後熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平台期，因此可以在PCR反應處於指數期的某一點 上來檢測PCR產物的量，並且由此來推斷模板最初的含量。為了便於對所檢測樣本進行比較，在real-time Q-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號 （baseline），熒光域值的預設設置是3～15個循環的熒光信號的標准偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用於定義 樣本的域值循環數（Ct）。Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的 對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標准品可作出標准曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標准曲線上計算出該樣 品的起始拷貝數。
4、實時熒光定量PCR技術在醫療方面的應用
⑴ 病原體檢測：目前，採用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。
如：結核菌基因診斷的意義主要表現在：
a.區分TB與其它分枝桿菌；
b.檢測TB耐葯基因；
c.提高TB的陽性檢出率。
⑵ 產前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。
⑶ 葯物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些葯物的療效關系。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。如PCR技術在HBV檢測中的應用及意義：
a.了解乙肝病毒在體內存在的數量。
b.是否復制。
c.是否傳染，傳染性有多強。
d.是否有必要服葯。
e.肝功能異常改變是否由病毒引起。
f.判斷病人是適合用哪類抗病毒葯物。
g.判斷葯物治療的療效。
⑷ 腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以准確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發現，熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發揮更大的作用。
(5)在優生優育中的應用:
近年來經濟發展迅猛，人民生活水平逐年提高，對自身及家人特別是下一代的身體健康愈來愈重視。另外，由於國內計劃生育工作逐步走向深化，獨生子女比較多，孩子的身體素質更成為長輩們關注的焦點。因此，怎樣提高新生兒質量改善人類遺傳素質，即優生優育已顯得非常重要。①避免有嚴重遺傳性疾病和先天性疾病的個體出生。②增進體力、智力優秀個體的繁衍。其中避免有嚴重遺傳性疾病及先天性疾病個體出生是優生優育最基本的內容。從臨床優生學角度分析具體工作包括在母親妊娠期間對母親及胎兒進行遺傳學檢查盡量排除常見的遺傳性疾病個體的出生，另外在妊娠期檢查母親是否患有某些易引起胎兒畸形的傳染性疾病如弓型蟲、風疹病毒、衣原體等感染。以往對遺傳性疾病的檢測主要使用染色體分析法，而臨床絕大部分遺傳性疾病是基因病而不是染色體病，染色體發析法不能檢出的。若使用PCR基因擴增法聯合單鏈構型多態性分析（sscp）、限制性片段長度多態性分析（RFCP）等位基因特異性寡核某酸（Aso）點雜交或差異PCR可以很方便地檢出單個基因的突變而且其准確性可達95%以上，因此使這一問題得到了較好的解決。常見的易致胎兒畸形的感染性疾病原體主要有單皰病毒（HSVⅡ）、風疹病毒（RV）、人巨細胞病毒（HCMV）、弓形體（TOX）及沙眼衣原體（CT）。以往這些病原體感染診斷比較困難，主要靠培養法進行確診，而培養法費時，代價昂貴，而且受到采樣、樣本保存及用葯等因素的影響，基本不能在臨床中推廣。PCR基因擴增法因其高敏感性、高特異性非常適合這些疾病診斷及療效跟蹤，是最值得推薦的檢驗方法。
1、PCR基因擴增法在遺傳性疾病產前診斷中的應用，遺傳病是由於遺傳物變化而引起的機體某一功能或缺陷或異常所致的疾病，其根本變化在於遺傳物質。其類型包括單基因遺傳病，染色體遺傳病及多基因遺傳病。遺傳病診斷除詢問病史，一般物理診斷，普通實驗室檢查及了解症狀、體征外有特殊性。過去常應用系譜分析，染色體及性染色色質檢驗作為遺傳病診斷的主要依據，再輔以相關的酶學分析從而作出診斷。隨著分子生物不的迅速發展及其在遺傳性病診斷中的廣泛應用，基因診斷技術誕生，基因診斷技術為遺傳病的臨床診斷起了很大的促進作用。聚合酶鏈反應（PCR）技術是基因診斷主要技術之一。這種快速、靈敏的基因體外擴增技術與多種分子生物學手段相配合可以檢出大部分已知的基因突變、基因缺失、染色體錯位等，PCR技術日益成為遺傳病診斷的最有效、最可靠的方法之一。以下舉幾個在國內有普遍意義的例子。
（一）、PCR檢測地中海貧血；地中海貧血（Thalassemia）是一種遺傳性慢性溶血性貧血病，是世界上最常見且發病北最高的一種單基因遺傳病。在兩廣、貴州、四川等地發病率較高，在廣西等地高達15%。地中海貧血是由於基因突變造成珠蛋白的不平衡，使結構正常的肽鏈合成量減少甚至沒有合成表現為溶血性貧血。接受累基因種類分為α、β、γ等，其中以 α、β地貧為最常見，危害了最大。珠蛋白基因簇位於人6號染色短臂上，有兩個重復基因基因位於α1、α2、兩個α基因及其旁側序列有很大的同源性，易出現染色體不等交換，導致α基因缺失－α地貧。α地貧基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同時缺失及非缺失型地貧。可以應用PCR技術擴增α1、α2基因從而檢測這些基因是否缺失、突變等，從而對α型地中海貧血作出診斷。β地中海貧血基因缺陷主要表現為基因序列中單一核苷酸的突變，或少數鹼基的缺失、插入，使正常β珠蛋白肽鏈合成減注或缺失。應用位點特異性寡核苷探針（Aso）進行PCR產物斑點雜交即可對其作出診斷。
（二）、苯丙酮尿症，苯西酮尿證（PKU）是一種常染色體隱性遺傳病，患者因苯丙酸羥化酶轉化為酷氨酸，使苯氨酸及其代謝物在體內大量蓄積，出現腦組損傷及不可逆性智力發育障礙。PKU患者出生時正常，新生兒一經確診為PKU停止母乳喂養採用低苯丙氨酸欽食療法8—10年，可使患者智力水平發展維持正常。由於低苯丙氨酸欽食非常昂貴，一般家庭難以承受，因此，施行產前診斷，防止患兒出生是最好的選擇。PAH只在肝細胞中表達，不能用血細胞，成纖維細胞、羊水、絨毛細胞進行酶活性分析，只能進行基因診斷。PKU的基因變化並非全部PAH基因的缺失，而是以點突變為主要表現形式，而且其突變位點很多。必須使用PCR擴增結合，ASO，SSCP或使用擴增片段長度多態性分析（AmpFLA）進行檢測，這些技術都較復雜，檢驗人員須經專業培訓。
（三）、血友病，血友病是一組最為常見的遺傳性凝血障礙，根據因子缺陷的不同分為甲、乙兩型，（Ⅷ、Ⅸ因子缺陷），也有復合型血友病，但不常見。甲型血友病發病率為1/10000，Ⅷ因子基因位於G6PD基因附近，全長186Kb，大范圍的基因重排（缺失、插入、重復）導致甲型血友病的病例很少，僅為Ⅷ因子缺陷的5%，大部分病人表現為單個或少數鹼基的突變。由於Ⅷ因子基因長度為186Kb，突變位點多，而且新生突變頻率高，從臨床角度講不能對每一個突變都檢測，可對最為常見的幾種突變類型進行檢測，主要的檢測手段是PCR結合RELP分析。乙型血友病發病率占血友病的20%，其基因變化及檢測方法與甲型血友病類似。
（四）、性別發育異常，區別雄性及雌性的物質基礎是性染色體，哺乳動物胚胎發育中，雌性表型不需要任何調節，而雄性表型則由多因素決定，位於Y染色體上的指導雄性性別分ss化的基因命名為睾丸決定因子（TDF）。現代研究表明，SRY（Sex-determining region of Y chromosome）基因是TDF基因，位於Y染以體短臂末端。SRY區缺失易導致46XY核型個體發育成女性。進行基因檢測可以檢出SRY基因組的易位及缺失，從而診斷性別發育異常，這一探索性別異常的研究非常熱門。另外還有一種46XY核型異常的病人即睾丸女性化，這是用於雄激素受體（androgen receptor,AR）基因缺欠，使雄激素的靶基因對雄激素不應答就答或不全而引起的，根據病情的不同有不同的表型，AR缺陷有很高的新生突變頻率，表現為無家族史的散發病。AR基因長90Kb，位於X染色體上，AR基因異常大部分為個別基因鹼基的突變，可以通過PCR結合ASO或SSCP檢出。
（五）、脆—X綜合征，脆—X綜合片（fragile-X Syndrome,Frax）是發病率最高的一種X-連鎖的智力低下綜合征（X-linked mental retardation XLMR）。因這種綜合征與X染色體上的脆位點連鎖而得名。大多數FRAX男性智商（IQ）低於50，並有隨著年齡增長而下降的趨勢。用人工酵母染色體（artificial yeast chromosome,YAC）克隆技術分離獲得覆蓋X-脆位點區域的YAC克隆，在這一克隆中獲得一個能在人腦中表達的基因命名為FMR-1（fragile X mentai retardation-1）,FMR-1的5『端有一個CGG（精）三核苷酸串（CGG）n,正常人群中（CGG）n中存在多態性，重復序列為6-46個，當重復超過52個時，此區域的分裂呈不穩定，導致重復序列大幅度增加，無臨床表現的攜帶者插入片段長度小於500bg，有臨床表現者，長度都大於600BP而且伴有甲基化。人們將500bp作為前突變與全突變的分界線。對Frax的診斷以前用細胞遺傳學的方法檢測脆位點，實驗條件嚴格，成功率不高。現在採用分子遺傳學方法即可診出前突變及全突變。用PCR擴增CGG重復序列，檢測擴增產物的長度。突變基因的擴增片段增大，體細胞異質性時出現多條長度不等的擴增帶甚至拖尾成一片，或者因為擴充的全突變插入片段過長超出PCR擴增能力而結果無擴增現象。
2、PCR基因擴增法在「Torsch」診斷中的應用，在妊娠早期（1-3個月），有些病原微生物的感染易導致胎兒畸形，這些病原體中最常見的有弓體（TOX）、風疹病毒（RV）、單純皰疹病毒（HSV）、沙眼衣原體（CT）、及巨細胞（HCMV），對這幾種病原體的檢測根據其英文詞首簡稱為Torsch試驗。
（一）、弓形體的PCR檢測，弓形體有廣泛的自然疫原性，人體多為隱性感染，抵抗力低時可以有臨床表現。弓形體的診斷較困難，血清學方法敏感性較高但有交叉性出現假陽性而且無法確定近期感染、遠期感染或一過性感染。確診的方法是活組織檢查或動物接各，這些方法陽性率太低不能推廣。PCR檢測可以檢出樣本中1-2個病原體而且准確性高，是目前對弓形體檢測最優秀的方法。作為優生優育檢查應於妊娠前或妊娠早期取全血樣本，可以用EDTA或肝素抗凝，以EDTA抗凝效果最好，檢測外周血白細胞中是否有TOX存在。對於不孕，多次自然流產或養小動物的產期婦女，作弓形蟲檢測有更重要的臨床意義。
（二）、風疹病毒感染：風疹病毒（RV）是一種單股正極性RNA病毒，人是風診病毒的唯一宿主。RV感染可以引起胎兒的畸形，影響胎兒免疫系統的發育，因此RV檢測在優生優育工作中顯得非常重要。RV檢測可以用直接培養法及IgM抗體測試法。培養法費時很長而且常受到其它病毒的干擾，IgM測定法結果了不太准確，PCR法敏感性及特異性都很高而且簡便快速，是RV感染最優秀的測試方法之一。風疹病毒侵入體內後在上呼吸道增殖而出現症狀，面部出現丘疹，迅速遍及全身。樣本採用妊娠母親的咽部拭子、血清、產婦的絨毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒，PCR擴增較復雜，應注意樣本的採集時機，操作的准確性。
（三）、單純皰診病毒，單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）是一種DNA病毒，可引起多器官的炎症，可通過性接觸傳播。HSVⅡ感染復發率高，80%的感染者於12個月內復發。HSV感染後經機體免疫系統清除，少數病人終生攜帶，體弱時復發。PCR法檢測HSV敏感性高而且可以直接對HSVⅠ/Ⅱ型進行分型鑒定。
（四）、沙眼衣原體，沙眼衣原體（CT）不僅能引起沙眼而且能引起生死器感染，是一種性傳播性疾病。與淋病（NG），梅毒等經典性傳播性疾病不同，CT易經其它接觸途徑傳播，少數地區對妊娠期婦女普查結果表明此人群中發病率高達20%-30%。在歐美等國家CT的感染已超過淋病而居性傳播性疾病之首。衣原體感染常呈無症性或非特異性症狀的隱性感染，不容易診斷。以往用培養法進行確診，費時且敏感性、准確性都不足。PCR用於CT檢測時應注意不同檢測目的的取材不同，對於性傳播性疾病診斷應取生殖道分泌物（查脫落細胞），而對於早期妊娠病人應查其全血樣本，在妊娠後期或臨產時再查陰道分泌物以便指導生育時產道清理。
（五）、人巨細胞（HCMV），HCMV感染十分普遍，除少數原發性感染發生原發性單核細胞增多症外，極大多數為隱性感染。HCMV可以長期潛伏在體內，當機體免疫功能低下時，病毒會激活而造成嚴重疾病在妊娠期如果孕婦感染HCMV可以引起早產、畸形、死胎及新生兒巨細胞包涵體病等。HCMV屬皰疹病毒科，可以從唾液、尿、宮頸分泌物及乳汁排出。HCMV「金標准」的診斷試驗是用單層成纖維細胞作病毒培養，其它的實驗檢查有血清學的檢測及包涵體檢測。PCR是HCMV檢測的一種新方法，用於檢測的樣本有血，生殖道分泌物拭子等，用於優生優育檢測時應取血樣本。對於早期妊娠病人若有HCMV感染應再檢測羊水，或其它妊娠物，對病人認真及進跟蹤檢查，綜合判斷並採取相應的醫療措施。
PCR應用於優生優育有很大的優越性，使這一技術的推廣應用剛剛起步，應注意操作的准確性，盡量避免誤診。對感染性疾病首先應取孕婦血樣檢測，有可疑時或血中檢出病原體核酸時應盡早作羊水等妊娠物檢查。不管是否懷疑胎兒有嚴重遺傳病傾和中或有感染引起的畸形風險，對胎兒的去留應尊重胎兒父母親的意見。
5、實時熒光定量PCR技術在研究方面的部分應用
一、 新葯開發研究，人用葯物及其他葯物
針對一些感染性疾病的葯物，如各種病毒病、細菌病等，在新葯的開發過程中，快速了解葯物對疾病進程的影響可以為新葯開發節約大量的人力、時間和資金，與以前所用的Elisa等方法相比，實時熒光定量PCR技術可以快速、准確、定量、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，因此有利用分析葯物的作用效果，為比較不同的配方的療效、用葯量、用葯時間等等提供快速、定量的評價。
此方法除了用於人用葯物以外，還可以用於畜用葯物，甚至其他經濟動物及植物的葯物研究等，因此其在葯物研究方面的應用范圍是很廣的。
二、 超早期感染用葯物及療法的研究與開發
實時熒光定量PCR方法測定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人體內產生抗體，同時，由於其靈敏度與Elisa相比不可同日而語，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低時就可以測定。因此就出現了一個新的領域，即在病毒或細菌含量很低時如何用葯，用什麼葯以及用葯量等進行研究，為將疾病消滅在超早期作出貢獻。
三、 葯物療效研究，人用葯物及其他葯物
對於一些已經上市的新葯或是應用了很長時間的老葯，其用葯的效果以及用葯量及用葯時間都可以進行進一步的研究，為更加合理化的應用這些葯物為人類造福進行進一步的研究。以前所用的方法由於不能准確定量，靈敏度也不夠，因此有很多需要研究的內容沒有完成。這一方面需要研究內容很多，意義也很大。
四、 新的愈後指標的研究
對於感染性疾病，在葯物作用至一定程度後，就認為可以停葯了，但是應該在什麼停葯，現在大都沒有一個明確的指標，現在所用的指標由於受到檢測方法的靈敏度及准確性限制，這一指標未必合理，因此有必要對治癒的指標以及指標與復發率以及疾病轉化為其他疾病之間的關系等進行進一步的研究，從而為葯物或療法徹底治癒疾病打下堅實的理論基礎。
五、 新診斷及檢驗試劑的開發
現有的很多診斷及檢驗方法都不能同時滿足快速、靈敏、定量的要求如現有培養法、Elisa法等等，而熒光定量PCR方法以則可以做到這一點，從而可為臨床疾病、商檢、糧油檢驗、食品檢驗、血液檢驗等等開發新的試劑，從而提高檢驗的靈敏度、速度及准確性等；這類試劑的種類是非常多的，所開發的試劑的社會效益及經濟效益都是很巨大的。
六、 血液檢驗漏檢率
由於實時熒光定量PCR方法比Elisa靈敏很多，因此，血站或血液研究所一般用來研究Elisa方法的漏檢率，即分析Elisa方法測定為陰性的血樣，再用實時熒光定量PCR方法來復檢。復檢時，一般24個Elisa陰性的血樣混合成一個樣本進行檢測。上海用此方法在用於血液製品的血液中發現一例HIV，後經測定供血者，證實病人的確是HIV陽性。北京市紅十字血液中心正在測定北京血站中5萬份Elisa陰性血樣的漏檢率。由於不同地區所用的Elisa試劑、方法、批號等都不相同，因此不同地區都有必要進行這一工作。
由於熒光定量PCR方法的快速、靈敏、定量的特點，其在研究及開發方面的應用是不勝枚舉的，如研究個人基因型與葯物療效之間的關系等；研究人員也可以根據自己研究項目開發其新的用途。
二、TL988實時熒光定量PCR檢測系統產品介紹
1、如何選擇一款適合自己的PCR儀
回顧分子生物學的發展歷程，PCR技術的發明和普及無疑是最重要的篇章之一。而PCR技術在近20年的不斷發展創新中，最受矚目當屬熒光實時定量PCR技術(real-time quantitative PCR, or qPCR)。定量PCR技術真正實現了PCR從定性到定量的飛躍，通過對PCR過程的實時監控，專一、靈敏快速、可重復地精確定量起始模版濃度，已經在科研和臨床診斷領域得到了越來越廣泛的應用。我公司從熒光定量PCR的原理入手，詳細介紹熒光定量PCR儀的類型和技術，為定量PCR儀的選擇提供詳細參考。
定量PCR儀主要由兩部分組成，一個是PCR系統，一個是熒光檢測系統。從前面的原理介紹不難看出選擇定量PCR儀的關鍵--由於定量PCR必需藉助樣本和標准品之間的對比來實現定量的，對於定量PCR系統來說，重要的參數除了傳統PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在於樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數級放大。至於熒光檢測系統，多色多通道檢測是當今的主流趨勢--儀器的激發通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬；多通道指可同時檢測一個樣品中的多種熒光，儀器就可以同時檢測單管內多模版或者內標+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強大。熒光檢測系統主要包括激發光源和檢測器。激發光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發光二極體LED光源，前者可配多色濾光鏡實現不同激發波長，而單色發光二極體LED價格低、能耗少、壽命長，不過因為是單色，需要不同的LED才能更好地實現不同激發波長。監測系統有超低溫CCD成像系統和PMT光電倍增管，前者可以一次對多點成像，後者靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，需要通過逐個掃描實現多樣品檢測，對於大量樣品來說需要較長的時間。定量PCR儀需要考慮的另外一個因素是軟體設計，這一點目前較新型號的儀器都有不錯的配套軟體可以滿足常規使用。--隨著定量PCR技術在臨床診斷、疾病
Ⅳ 利用基因工程技術進行葯物的研製與開發時，目的基因的鑒定方法有哪些其原理是什麼
目的序列與載體DNA正確連接的效率、重組導入細胞的效率都不是百分之百的，因而最後生長繁殖出來的細胞並不同都帶有目的序列。一般一個載體只攜帶某一段外源DNA，一個細胞只接受一個重組DNA分子。最後培養出來的細胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重組體（recombinant）。將目的重組體篩選出來就等於獲得了目的序列的克隆，所以篩選(dcreening)是基因克隆的重要步驟。在構建載體，選擇宿主細胞、設計分子克隆方案時都必須仔細考慮篩選的問題。以下就常用技術的基本原理加以介紹。
一、根據重組載體的標志作篩選
最常見的載體攜帶的標志是抗葯性標志，如抗氨芐青黴素（anpr）、抗四環素(terr)、抗卡那黴素(kanr)等。當培養基中含有抗生素時，只有攜帶相應抗葯性基因載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受載體DNA的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列是插入在載體的抗葯性基因中間使這抗葯性基因失活，這個抗葯性標志就會消失。例如質粒pBR322含有anpr、和terr兩個抗葯基因，若將目的序列插入terr基因序列中，轉化大腸桿菌，讓細菌放在含氨芐青黴素或四環素培養基中，凡未接受質粒DNA的細胞都不能生長；凡在含氨芐青黴素和四環素中都能生長的細菌是含有質粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青黴素中能生長、而在四環素中不能生長的細菌就很可能是含有目的序列的重組質粒。 載體含有lacZ』的藍白篩選法，近年更被廣泛應用。例如將目的序列插入前面述及的質粒pUC19的多克隆位點，轉化大腸桿菌，放入含氨芐青黴素、IPTG、X-gal的培養基中培養，凡能生長並呈白色的菌落，其細菌中就很可能含有插入目的序列的重組質粒，這樣就很容易獲得目的序列的克隆。 根據重組載體的標志來篩選，可以篩選去大量的非目的重組體，但還只是粗篩，例如細菌可能發生變異而引起抗葯性的改變，卻並不代表目的序列的插入，所以需要做進一步細致的篩選。
二、核酸雜交法
利用標記的核酸做探針與轉化細胞的DNA進行分子雜交，可以直接篩選和鑒定目的序列克隆。常用的方法是將轉化後生長的菌落復印到硝酸纖維膜上，用鹼裂菌，菌落釋放的DNA就吸附在膜上，再與標記的核酸探針溫育雜交，核酸探針就結合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脫。核酸探針可以用放射性核素標記，結合了放射性核酸探針的菌落集團可用放射性自顯影（auroradiography）法指示出來，核酸探針也可以用非放射性物質標記，通常是經顏色呈現指示位置，這樣就可以將含有目的序列的菌落挑選出來。
三、PCR法
PCR技術的出現給克隆的篩選增加了一個新手段。如果已知目的序列的長度和兩端的序列，則可以設計合成一對引物，以轉化細胞所得的DNA為模板進行擴增，若能得到預期長度的PCR產物，則該轉化細胞就可能含有目的的序列。
四、免疫學方
利用特定抗體與目的基因表達產物特異性結合的作用進行篩選。此法不是直接篩選目的基因，而是通過與基因表達產物的反應指示含有目的基因的轉化細胞，因而要求實驗設計要使目的基因進入受體細胞後能夠表達出其編碼產物。抗體可用特定的酶常用過氧化物酶、鹼性磷酸酶等標記，結合酶標抗體處，酶可催化特定的底物分解而呈現顏色，從而指示出含有目的的基因的細胞集落位置。免疫學方法特異性強、靈敏度高，適用於從大量轉化細胞集合體中篩選很少幾個含目的基因的細胞克隆。
五、DNA限制性內切酶圖譜分析
這是在上述篩選後的進一步分析。目的序列插入載體會使載體DNA限制性酶圖譜（restriction map）發生變化，例如一個長600bp的目的序列利用它兩端的EooR I和SalI切後的粘末端連接插入pUC19的多克隆點，則重組質粒就增大為3.3kb，用Eoor I和SalI雙酶切後會出現600bp和-2.7kb兩個DNA片段，提取轉化細菌的質粒DNA作酶切後做電泳觀察其酶切圖譜，就能分析得結果；如插入的目的序列中有其它限制性內切酶位點，也能在酶切電泳圖譜上觀察到。這就可以進一步鑒定重組體是不是所要的目的克隆。
六、核苷酸序列測定
所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列測定來最後鑒定。已知序列的核酸克隆要經序列測定確證所獲得的克隆準確無誤；未知序列的核酸克隆要測定序列才能確知其結構、推測其功能，用進一步的研究。因此核酸序列測定是分子克隆中必不可少的鑒定步驟。核酸序列測定的原理和方法在實驗教材中有詳細的敘述。
Ⅵ pcr的特異性檢測和敏感性檢測要怎麼做
pcr靈敏度檢測
1.1 樣本准備：以4次方國家一級或者二級標准品為基礎樣本，用陰性血清進行倍比稀釋，稀釋後的樣本濃度分別為1000IU/ml、500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、100IU/ml、50IU/ml、25IU/ml，每份樣本使用1000μl進行檢測。1.2 用質檢合格核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進行檢測，每個濃度每批次試劑盒做5個復管，分析各濃度標本的檢出率（即陽性率）。以標本濃度值對數為橫坐標，對應的檢出率為縱坐標描點，用Origin的Sigmoidal Fit 的方法擬合成曲線，根據軟體給出的曲線公式計算出當檢出率為95%時所對應的濃度，此濃度即為本試劑盒對HBV標本的分析靈敏度。
pcr特異性檢測
2.1 參考樣本選擇：選擇與目的片段相近或者感染方式相似的其他病毒或者細菌高載量樣本，同時應滿足臨床或者其他方法確認目的片段為陰性，做5個副管擴增並且全部為陰性。以乙肝為例：選擇高載量HCV、CMV、EBV、HSV2的陽性標本各1個（乙肝表面抗原為陰性）,分別檢測乙肝表面抗原及乙肝核酸量。每個測5次，全部陰性或者在參考范圍以下為特異性良好。
希望能夠幫到你，有其他需要可以隨時交流！