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基因晶元製造的基本方法有哪些

發布時間:2023-04-15 17:11:56

A. 基因晶元的制備方法有哪些

基因晶元的原位合成法是基於組合化學的合成慎慶原理[9], 通過一組定位模板來決定基局橋片表面上不同化學單體的偶聯位點和次序, 把腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四種不同鹼基的核苷酸按不同次序化學偶聯在相應的位點, 原位合寬臘握成序列不同的寡核苷酸探針, 形成DNA晶元. 這一技術是由Affymetrix公司的Fodor及其同事最先發明的[1], 他們使用含光敏化學保護基的DNA合成試劑, 用光脫保護法直接在基片上合成寡核苷酸探針, 即光導向原位合成法. 該方法的優點在於精確性高, 缺點是製造光掩蔽劑既費時又昂貴.

B. 基因晶元技術

1 技術的基本步驟
1.1 基因晶元的制備
目前基因晶元的制備主要採用三種方法:即光蝕刻合成法,壓電印刷法,點樣法。
1.1.1 光蝕刻合成法 是最初使用的一種方法談羨,其主要過程是:在固相支持物上偶聯帶有可感光保護基團X的羥基,汞光有選擇地照射到固相支持物,去掉可感光保護基團X,使羥基成為有功能的自由羥基,與加入的帶X的核苷酸偶聯,第一個反應物被嫁接到目標位置上。隨著反應的重復,鏈不斷地延伸,當所需的寡核苷酸鏈合成完後,對反應基板進行無遮板的汞光普照,去除所有X,即可得到所多方面的寡核苷酸陣列。這樣,光照模式和反應物的加入順序決定了合成產物的序列以及在基板上的位置。該法可以合成30個鹼基左右,其優點在於精確性高,缺點是製造可感光保護劑價格較高昂貴。該法由美國的Affymetrix公司首先開發採用,目前該公司已開發成功能同時檢測6500個已知人類基因的DNA晶元。
1.1.2 電壓印刷法 其原理類擬於噴墨列印機,列印機頭上的墨盒有四個,分別裝有四種不同的鹼基,列印機頭在方陣上移動,並將帶有某種鹼基的試劑滴到基板表面,然後固定,經過洗脫和去保護後,就可連上新的核苷酸,使寡核苷酸鏈延伸。該法採用的技術原理與傳統的DNA固相合成相一致。壓電印刷法可以合成40-50個鹼基,此法效率高但工藝不太成熟,目前該法主要由美國的Incyte Pharmaceuticals公司採用。
1.1.3 點樣法 即預先合成寡核苷酸,肽核苷酸或分離得到cDNA,再通過點樣機直接將其點到晶元上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通過含迅拍多孔玻璃合成法。肽核苷酸雖然在制備上比較復雜,但是它與DNA探針相比,由於PNA與DNA結合的復合物更加穩定和特異,因而更加有利於單鹼基錯配基因的檢測。嚴自某一細胞的cDNA必須進行預處理,純化,擴增以及分類,然後再利用機械手把它們准確地固定在基板的相應位置上,為了保證cDNA晶元檢測的准確性,在制備cDNA晶元以前必須提高低表達基因cDNA的豐度,降低高表達基因cDNA的豐度。點樣法的優點在於成本低、速度快,但缺點是構成方陣的寡核苷酸或cDNA片段需事先純化。目前採用該法的公司最多,有英國的Brax Genomics Limited公司,美國的Hyseq,Molecular Dynamics,Nanogen等多家公司。
1.2 樣品的制備
生物樣品成分往往比較復雜,所以在與晶元接觸前,必須對樣品先進行處理。為了提高結果的准確性,來自血液或組織中的DNA/mRNA樣本須先行擴增,然後再被熒光素或同位素標記成為探針。
1.3 雜交
影響雜交的因素很多,但主要是時間,溫度及緩沖液的鹽濃度。如果是表達檢測,需要長歷時,低溫和高鹽條件的較嚴謹性雜交。而如果是突變檢測,需要短歷時,高溫和低鹽條件高嚴謹性雜交。總之,雜交條件的選擇要根據晶元上核酸片段的長短及其本身的用途來定。
1.4 雜交圖譜的檢測和讀出
目前最為常用的是激光共聚焦熒光檢測系統,其原理主要是與晶元發生雜交的探針上的熒光被激發後經過棱鏡剛好能通過共聚集小孔,而能被探測器檢測到,而晶元之外的其它熒光信號則不能被探測器檢測到,檢測到的熒光信號通過計算機處理後就可直接讀出雜交圖譜,此法靈敏度和精確度較高,但是掃描所需時間較長。另一種檢測系統採用CCD攝像原理,它雖然靈敏度和精確度較低,但所需的掃描時間較短,因而更適用於臨床診斷。此外,近年來還發展了多種檢測方法,如質譜法,化學發光法,光導纖維法等多種方法,其中最有前途的是質譜法。
Taton等發明了一種新的晶元檢測操作方案——Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probe,該法使用了Au和Ag兩種金屬離子來標記寡核苷酸探針,另外使用普通的平台掃描儀檢測。他昌銀們通過研究發現使用金屬離子標記探針與基板進行雜交時,其退火溫度曲線與使用傳統的熒游標記探針的完全不同。這種不同使得雜交時其單核苷酸錯配的幾率比傳統的熒游標記探針法低3倍以上。另外這種金屬離子標記探針在與芯雜交時會互相交聯形成一種較大顆粒的網路結構。由於以上兩個原因使用該法進行DNA晶元檢測時其靈敏度比使用熒游標記法高兩個數量級。

C. 基因晶元技術

「微處理器在本世紀使我們的經濟結構發生了根本改變,給人類帶來了巨大的財富,改變了我們的生活方式。然而,生物晶元給人類帶來的影響可能會更大,它可能從根本上改變醫學行為和我們的生活質量,從而改變世界的面貌 」。

一、生物晶元與基因晶元
生物晶元技術是通過縮微技術,根據分子間特異性地相互作用的原理,將生命科學領域中不連續的分析過程集成於硅晶元或玻璃晶元表面的微型生物化學分析系統,以實現對細胞、蛋白質、基因及其它生物組分的准確、快速、大信息量的檢測。按照晶元上固化的生物材料的不同,可以將生物晶元劃分為基因晶元、蛋白質晶元、細胞晶元和組織晶元。生物晶元技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化、成本低、防污染等特點。按照生物晶元的製作技術,可以將生物晶元劃分為微矩陣和原位合成晶元。鑒於生物晶元技術領域的飛速發展,美國科學促進會將生物晶元評為1998年的十大科技突破之一,認為生物晶元技術將是繼大規模集成電路之後的又一次具有深遠意義的科學技術革命。
目前,最成功的生物晶元形式是以基因序列為分析對象的「微陣列(microarray)」,也被稱為基因晶元(Gene chip)DNA晶元(DNA chip)。按照載體上點的DNA種類的不同,基因晶元可分為寡核苷酸和cDNA兩種晶元。按照基因晶元的用途可分為表達譜晶元、診斷晶元、指紋圖譜晶元、測序晶元、毒理晶元等等。早在八十年代初期,Bains等人就用雜交的方法對固定在支持物上的短DNA片段進行序列測定。基因晶元技術從實驗階段走向工業化是得益於其他技術的引入,如激光共聚焦顯微技術、探針固相原位合成技術與照相平板印刷技術的結合和雙色熒光探針雜交系統的建立。90年代初期人類基因組計劃(Human Genome Project, HGP)和分子生物學相關學科的發展也為基因晶元技術的出現和發展提供了有利條件。1992年,Affymatrix公司Fodor領導的小組運用半導體照相平板技術,對原位合成制備的DNA晶元作了首次報道,這是世界上第一塊基因晶元。1995年,Stanford大學的P.Brown實驗室發明了第一塊以玻璃為載體的基因微矩陣晶元。標志著基因晶元技術進入了廣泛研究和應用的時期。

二、制備基因晶元的必要條件
1、靶基因 用於晶元點樣的是靶基因。靶基因可分為染色體DNA(或基因組DNA)、cDNA(或人閉跡唯工合成DNA)。目前,以cDNA的研究為主,因為cDNA是染色體上編碼蛋白質的DNA序列,有醫療和其他領域的研究價值和商業價值。
2、制備技術 基因晶元的制備綜合了生命科學、化學染料、微電子技術、激光、統計學等領域的前沿技術,主要包括晶元的制備(選擇點樣儀和玻片、靶基因的擴增和固定)、雜交探針的制備(mRNA的抽提、mRNA的逆轉錄、PCR和轎培探針熒游標記)、雜交條件的優化技術(雜交液、雜交條件和洗滌條件的選擇)和數據分析技州悄術。其中,基因晶元的制備主要依賴於微細加工(microfabrication)、自動化(automatism)及化學合成技術。通常比較典型的DNA晶元制備方法有3種:(1)原位合成法(in situ synthesis) 以Affymetrix公司開發的光引導原位合成法為代表(2)合成點樣法 又根據是否與晶元的表面接觸分為化學噴射法和接觸式點塗法,分別以Incyte Pharmaceutical公司和Stanford大學為代表(3)壓電法 通過使用4支分別裝有A、T、G、C核苷的壓電噴頭在晶元上作原位DNA探針合成。

三、基因晶元技術簡介
基因晶元技術主要包括四個主要步驟:晶元制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測和結果分析。
1、晶元制備-目前制備晶元主要以玻璃片或矽片為載體,採用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。晶元的制備除了用到微加工工藝外,還需要使用機器人技術。以便能快速、准確地將探針放置到晶元上的指定位置。
2、樣品制備-生物樣品往往是復雜的生物分子混合體,除少數特殊樣品外,一般不能直接與晶元反應,有時樣品的量很小。所以,必須將樣品進行提取、擴增,獲取其中的蛋白質或DNA、RNA,然後用熒游標記,以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。
3、雜交反應-雜交反應是熒游標記的樣品與晶元上的探針進行的反應產生一系列信息的過程。選擇合適的反應條件能使生物分子間反應處於最佳狀況中,減少生物分子之間的錯配率。
4、信號檢測和結果分析-雜交反應後的晶元上各個反應點的熒光位置、熒光強弱經過晶元掃描儀和相關軟體可以分析圖像,將熒光轉換成數據,即可以獲得有關生物信息。 基因晶元技術發展的最終目標是將從樣品制備、雜交反應到信號檢測的整個分析過程集成化以獲得微型全分析系統(micro total analytical system)或稱縮微晶元實驗室(laboratory on a chip)。使用縮微晶元實驗室,就可以在一個封閉的系統內以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結果的全套操作。

四、基因晶元的應用及其商業價值
目前,基因晶元技術應用領域主要有基因表達譜分析、新基因發現、基因突變及多態性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預測、葯物篩選、基因測序等。另外基因晶元在農業、食品監督、環境保護、司法鑒定等方面都將作出重大貢獻。 基因晶元的飛速發展引起世界各國的廣泛關注和重視。
鑒於基因晶元的巨大潛力和誘人的前景,基因晶元已成為各國學術界和工業界研究和開發的熱點。尤其在美國,正處於人類基因組計劃以來的第二次浪潮之中,美國總統柯林頓在1998年1月的國情咨文中指出:「在未來的12年內,基因晶元將為我們一生的疾病預防指點迷津」。1998年6月29日美國宣布正式啟動基因晶元計劃,聯合私人投資機構投入了20億美元以上的研究經費。世界各國也開始加大投入,以基因晶元為核心的相關產業正在全球崛起,目前美國已有8家生物晶元公司股票上市,平均每年股票上漲75%,專家今統計:全球目前生物晶元工業產值為10億美元左右,預計今後5年之內,生物晶元的市場銷售可達到200億美元以上。美國財富雜志載文:在20世紀科技史上有兩件事影響深遠,一是微電子晶元,它是計算機和許多家電的心臟,它改變了我們的經濟和文化生活,並已進入每一個家庭;另一件事就是生物晶元它將改變生命科學的研究方式,革新醫學診斷和治療,極大地提高人口素質和健康水平。鑒於生物晶元技術具有巨大理論意義和實際價值,基因晶元研究在國內也有了很快的發展,例如,復旦大學、中科院上海冶金所、清華大學、聯合基因有限公司、軍事醫學科學院、中科院上海細胞所等單位已在生物晶元技術方面取得了較大突破,相信不久將有我國生產的生物晶元產品投放市場。
總之,以基因晶元為代表的生物晶元技術的深入研究和廣泛應用,將對21世紀人類生活和健康產生極其深遠的影響。

D. DNA晶元技術的原理

生物晶元技術是通過縮微技術,根據分子間特異性地相互作用的原理,將生命科學領域中不連續的分析過程集成於硅晶元或玻璃晶元表面的微型生物化學分析系統,以實現對細胞、蛋白質、基因及其它生物組分的准確、快速、大信息量的檢測。按照晶元上固化的生物材料的不同,可以將生物晶元劃分為基因晶元、蛋白質晶元、細胞晶元和組織晶元。生物晶元技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化、成本低、防污染等特點。按照生物晶元的製作技術,可以將生物晶元劃分為微矩陣和原位合成晶元。鑒於生物晶元技術領域的飛速發展,美國科學促進會將生物晶元評為1998年的十大科技突破之一,認為生物晶元技術將是繼大規模集成電路之後的又一次具有深遠意義的科學技術革命。
目前,最成功的生物晶元形式是以基因序列為分析對象的「微陣(microarray)」,也被稱為基因晶元(Genechip)DNA晶元(DNAchip)。按照載體上點的DNA種類的不同,基因晶元可分為寡核苷酸和cDNA兩種晶元。按照基因晶元的用途可分為表達譜晶元、診斷晶元、指紋圖譜晶元、測序晶元、毒理晶元等等。早在八十年代初期,Bains等人就用雜交的方法對固定在支持物上的短DNA片段進行序列測定。基因晶元技術從實驗階段走向工業化是得益於其他技術的引入,如激光共聚焦顯微技術、探針固相原位合成技術與照相平板印刷技術的結合和雙色熒光探針雜交系統的建立。90年代初期人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)和分子生物學相關學科的發展也為基因晶元技術的出現和發展提供了有利條件。1992年,Affymatrix公司Fodor領導的小組運用半導體照相平板技術,對原位合成制備的DNA晶元作了首次報道,這是世界上第一塊基因晶元。1995年,Stanford大學的P.Brown實驗室發明了第一塊以玻璃為載體的基因微矩陣晶元。標志著基因晶元技術進入了廣泛研究和應用的時期。 1、靶基因用於晶元點樣的是靶基因。靶基因可分為染色體DNA(或基因組DNA)、cDNA(或人工合成DNA)。以廳和cDNA的研究為主,因為cDNA是染色體上編碼蛋白質的DNA序列,有醫療和其他領域的研究價值和商業價值。 2、制備技術基因晶元的制備綜合了生命科學、化學染料、微電子技術、激光、統計學等領域的前沿技術,主要包括晶元的制備(選擇點樣儀和玻片、靶基因的擴增和固定)、雜交探針的制備(mRNA的抽提、mRNA的逆轉錄、PCR和探針熒游標記)、雜交條件的優化技術(雜交液、雜交條件和洗滌條件的選擇)和數據分析技術。其中,基扮顫盯因晶元的制備主要依賴於微細加工(microfabrication)、自動化(automatism)及化學合成技術。通常比較典型的DNA晶元制備方法有3種:(1)原位合成法(insitusynthesis)以Affymetrix公司開發的光引導原位合成法為代表(2)合洞耐成點樣法又根據是否與晶元的表面接觸分為化學噴射法和接觸式點塗法,分別以IncytePharmaceutical公司和Stanford大學為代表(3)壓電法通過使用4支分別裝有A、T、G、C核苷的壓電噴頭在晶元上作原位DNA探針合成。

E. DNA微陣列的DNA微陣類型

基因晶元的製作方式基本可分為以下幾型: 由美國斯坦福大學開發的cDNA array的製作方法,將預先合成好的核酸探針布放於玻片載體上。 優點:設計較長的探針長度可增加專一性。 缺點:晶元密度較光罩法低,並須有良好的保存設計。
這種方法又可分為點製法與印製法。
點製法是小規模生產或實驗室自製的低密度晶元,以機械手臂上帶有毛細作用的細微刻痕的鋼針,將核酸探針溶液點放於玻片或聚酯纖維膜上。成本低廉,適合探針數少或制御拍造需求量不大的狀況。
印製法是從噴墨列印機的方式變化而來,用加鎮咐羨熱氣泡的方式將核酸探針印於玻片上。使用製作良好的噴頭可同時實現高密度、長探針的基因晶元;例如PhalanxJet。 在96孔或384孔標准PCR盤或384孔微流體盤中,預先合成好即時PCR引子與探針,將檢體注入後以定量PCR方式進行反應與偵測分析。分析量比傳統晶元少,屬於低密度陣列,但兼具准確定量與定性;並且設備與技術門檻低,一般分子生物實驗室即可自行操作。 新的中密度qPCr array:OpenArray是Applied Biosystems(應用生命系統公司,隸屬於Life Technologies集團)產品,在玻片大小的疏水性基板中分為數十個矩陣區域;矩陣內為親水性表面的微孔,有一組預先合成好的引子與探針。現簡核有的規格是每片玻片有12*4 (48)個矩陣區域,每個區域為8*8 (64)孔。預計2012年有新的12K晶元與專用機台上市。

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