蛋白質n端測序方法有哪些

1. 蛋白質多肽鏈N端測定的方法及基本原理

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈藉助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).
2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。
3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然後用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。
二硫鍵的切割與保護（元素後數字為下標）
a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
b、還原＋氧化 不可逆
[ 巰基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 ＋ HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。
巰基（-SH）的保護4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，並計算出氨基酸成分的分子比（如右圖）
5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端
多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。
6 多肽鏈斷裂成多個肽段。可採用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，並將其分離開來。
7 測定每個肽段的氨基酸順序
8 確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。
9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
一般採用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理後，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然後同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。

2. 常用於蛋白質多肽鏈N端.C端測定的方法有幾種

(1)N-末端測定
A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB)：1945年Sanger提出此方法,是他的重要貢獻之一.
DNP-氨基酸用有機溶劑抽提後,通過層析位置可鑒定它是何種氨基酸.Sanger用此方法測定了胰島素的N末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸.
B.氰酸鹽法：1963年Stank及Smyth介紹了一種測定N末端的新方法,步驟如下：
由於乙內醯脲氨基酸不帶電荷,因此可用離子交換層析法將它與游離氨基酸分開,分離所得的乙內醯脲氨基酸再被鹽酸水解,重新生成游離的氨基酸,鑒別此氨基酸即可了解N-末端是何種氨基酸.
C.二甲基氨基萘磺醯氯法：1956年Hartley等報告了一種測定N-末端的靈敏方法,採用1-二甲基氨基萘-5-磺醯氯,簡稱丹磺醯氯.它與游離氨基末端作用,方法類似於Sanger的DNFB法,產物是磺醯胺衍生物.
丹磺醯鏈酸具有強烈的黃色熒光.此法優點為靈敏性較高(比FDNB法提高100倍,樣品量小於1毫微克分子)及丹磺醯氨基酸穩定性較高(對酸水解穩定性較DNP氨基酸高),可用紙電泳或聚醯胺薄膜層析鑒定.
(2)C-末端分析
A.肼解法：這是測定C-末端最常用的方法.將多肽溶於無水肼中,100℃下進行反應,結果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放,而其餘肽鏈部分與肼生成氨基酸肼.
這樣羧基末端氨基酸可以採用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進行分析.如果羧基末端氨基酸側鏈是帶有醯胺如天冬醯胺和谷氨醯胺,則肼解時不能產生游離的羧基末端氨基酸.此外肼解時注意避免任何少量的水解,以免釋出的氨基酸混淆末端分析.
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸.根據酶解的專一性不同,可區分為羧肽酶A、B和C.應用羧肽酶測定末端時,需要事先進行酶的動力學實驗,以便選擇合適的酶濃度及反應時間,使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸.

3. 蛋白質N端測序的測定蛋白質N端序列的方法

目前對蛋白N端測序主要分類兩大類，其一為非質譜技術，例如經典的Edman降解法、利用反轉錄RT-PCR得到對應蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列；其二為質譜技術。各自都有其使用的長處和制約之處，目前，市面上採用的，依然是基於經典的Edman降解法原理，利用美國ABI公司Procise491蛋白序列測序系統進行蛋白N-端測序。

4. 蛋白質N端和C端的測定方法是什麼基本原理是什麼

n端測序的原理
蛋白質和多肽n-端測序技術是以edman化學降解法為基礎的，edman化學降解，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質和多肽的n-端殘基的偶聯，苯氨基硫甲醯酞（ptc-肽）環化裂解，和噻唑呤酮苯氨（atz）轉化為苯異硫尿氨基酸（pth-氨基酸）三個主要的化學步驟，每個循環從蛋白質與多肽裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的游離的氨基酸進行下一個edman降解，最後通過轉移的pth-氨基酸鑒定實現蛋白質序列的測定。
蛋白質c端測序3種方法：化學法、羧肽酶法、及串聯質譜法
其中後兩者最近普遍應用的辦法。
羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據酶解的專一性不同，可區分為羧肽酶a、b和c。應用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時...n端測序的原理
蛋白質和多肽n-端測序技術是以edman化學降解法為基礎的，edman化學降解，其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質和多肽的n-端殘基的偶聯，苯氨基硫甲醯酞（ptc-肽）環化裂解，和噻唑呤酮苯氨（atz）轉化為苯異硫尿氨基酸（pth-氨基酸）三個主要的化學步驟，每個循環從蛋白質與多肽裂解一個氨基酸殘基，同時暴露出新的游離的氨基酸進行下一個edman降解，最後通過轉移的pth-氨基酸鑒定實現蛋白質序列的測定。
蛋白質c端測序3種方法：化學法、羧肽酶法、及串聯質譜法
其中後兩者最近普遍應用的辦法。
羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據酶解的專一性不同，可區分為羧肽酶a、b和c。應用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時間，使釋放出的氨基酸主要是c末端氨基酸。
串聯質譜法
串聯質譜法原理：即在質譜中獲得蛋白質肽段的碎片。肽段在質譜中的碎裂有一定規律，通常最容易斷裂的是肽鍵位置，得到分別命名為b離子和y離子，得到這些離子的m/z的圖譜，分析圖譜得到的蛋白質的c端序列。

5. 蛋白質一級結構測定中,鑒定N-末端的常用方法

1 二硝基氟苯法（Sanger法)
2 苯異硫腈法（Edman法）
3 二甲基氨基萘磺醯胺法（DNS法）
4 氨肽酶法

6. 常用於蛋白質多肽鏈N端.C端測定的方法有幾種

(1)N-末端測定 A.二硝基氟苯(FDNBDNFB)：1945Sanger提重要貢獻DNP-氨基酸用機溶劑抽提通層析位置鑒定何種氨基酸Sanger用測定胰島素N末端別甘氨酸及苯丙氨酸B.氰酸鹽：1963Stank及Smyth介紹種測定N末端新步驟：由於乙內醯脲氨基酸帶電荷用離交換層析與游離氨基酸離所乙內醯脲氨基酸再鹽酸水解重新游離氨基酸鑒別氨基酸即解N-末端何種氨基酸C.二甲基氨基萘磺醯氯：1956Hartley等報告種測定N-末端靈敏採用1-二甲基氨基萘-5-磺醯氯簡稱丹磺醯氯與游離氨基末端作用類似於SangerDNFB產物磺醯胺衍物丹磺醯鏈酸具強烈黃色熒光優點靈敏性較高(比FDNB提高100倍品量於1毫微克)及丹磺醯氨基酸穩定性較高(酸水解穩定性較DNP氨基酸高)用紙電泳或聚醯胺薄膜層析鑒定(2)C-末端析A.肼解：測定C-末端用肽溶於水肼100℃進行反應結羧基末端氨基酸游離氨基酸狀釋放其餘肽鏈部與肼氨基酸肼羧基末端氨基酸採用抽提或離交換層析其進行析羧基末端氨基酸側鏈帶醯胺冬醯胺谷氨醯胺則肼解能產游離羧基末端氨基酸外肼解注意避免任何少量水解免釋氨基酸混淆末端析B.羧肽酶水解：羧肽酶專性水解羧基末端氨基酸根據酶解專性同區羧肽酶A、BC應用羧肽酶測定末端需要事先進行酶力實驗便選擇合適酶濃度及反應間使釋放氨基酸主要C末端氨基酸

7. 蛋白質N端和C端的測定方法是什麼基本原理是什麼

蛋白質N端和C端的測定方法是什麼？基本原理是什麼
二硝基氟苯法(FDNB法) 2、二甲基氨基萘磺醯氯法(DNS-Cl法) 3、異硫氰酸笨酯法(Edman法) C-末端分析1、肼解法 2、還原法