蛋白生物素化的方法有哪些

A. 五種蛋白質-蛋白質相互作用的方法，簡述其中一個原理。

蛋白質分子的相互作用：一、生物大分子的相互作用：生物大分子發揮生理功能所需的三個條件：分子結構、分子運動和變化以及分子間的相互作用。 1、非共價鍵的左右：離子鍵、氫鍵、范德華力和疏水鍵。信息的傳遞以及利用極大地以來弱的非共價鍵。它們不僅決定著生物的大分子的三維結構，還決定著這些結構如何與其他結構相互作用。 2、作用力特點：分子的結合與解離二、蛋白質-蛋白質相互作用蛋白質之間相互作用的結構模式：通過蛋白質的模體或基元或者結構域而發生作用。三、DNA-蛋白質相互作用：兩者之間相互作用的化學鍵 1、氫鍵：具有識別功能蛋白質的螺旋結構常與DNA的大溝相互作用。 2、疏水鍵：暴露於大溝側源的T-CH3集團是疏水性的，可與疏水氨基酸殘基側鏈相互作用。 3、離子鍵蛋白質也屬於生物大分子，存在氫鍵、范德華力和疏水鍵由於這幾種作用力的存在，使得蛋白質更加穩定。

B. gbs生物活化素

生物素的活化與活化生物素的標記2007-01-12 03:33 1． 生物素的活化
生物素預先活化後，通過噻吩環的戊酸側鏈上羧基與抗體、酶等生物大分子以醯胺鍵偶聯。活化生物素的制備是獲得高敏感度BAS制劑的關鍵環節。常用方法有以下幾種：
1） 生物素N—羥基丁二醯亞胺酯（biotinyl-N-hydroxy-succinnimide，BNHS）的制備：
取生物素1g混懸於12 ml，N,N-二甲基甲醯胺(DMF)，加人0．6g N-羥基丁二醯亞胺(HOSU)和0. 8 g二環己基碳二亞胺(DCC)，置於密閉容器內，室溫下磁力攪拌作用過夜。過濾，濾液經旋轉蒸干。加10mL乙醚洗滌，繼加200 ml異丙醇使其重結晶，獲得白色粉末狀晶體。
BNHS酯鍵中的-C=0基團可與蛋白質分子中賴氨酸的氨基結合，使生物素標記在蛋白分子上，含賴氨酸殘基越多，或蛋白質的等電點在pI 6.0以上，其標記效果越好。因此，BNHS適用於標記抗體及中性和偏鹼性的抗原。
2）長臂活化生物素(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl amido hexanoate，BCNHS)的制備
生物素的分子量僅為244.31，當與抗體或酶結合後應用於免疫試驗時，極易受到大分子蛋白空間位阻效應(steric hindrance)的影響。使用長臂生物素可以減少位阻效應，提高試驗的靈敏度。長臂生物素是在生物素和N-羥基丁二醯亞胺之間添加2分子6－氨基己糖，猶如給生物素分子增添一隻手臂，使其不受位阻效應影響，更易與抗體、酶等生物大分子結合而發揮作用、BCNHS的制備過程分為兩步：先製成長臂生物素，然後再使其活化。
長臂生物素的制備：稱取BNHS 3 41 mg ,6-氨基己糖鹽酸鹽200mg，溶解於5mLDMF，再加入0.152 mL三乙胺(TEA)，室溫攪拌下作用20h。蒸發去除DMF，加l mmol/L NaOH 3mL，繼加甲醇至溶液變清，攪拌2h。蒸發去甲醇，加10mL蒸餾水，攪拌下滴加濃鹽酸酸化至剛果紅指示劑恰好變色。室溫靜置2h後，移放冰箱過夜。收集白色固體物，乾燥後用水重結晶，再經真空乾燥，所得物即為長臂生物素，平均獲得率為64％。熔點為206-215℃。
長臂生物素的活化：稱取長臂生物素357mg溶於DMF10ml 。中，加HOSU 130 mg和適量縮合劑，室溫攪拌下作用48h。過濾，收集濾液蒸發干，加乙醚洗滌後，用無水異丙醇10－15ml重結晶。所得粉末狀固體即為活化長臂生物素，平均獲得率為41％，熔點為156-162℃。
3) 生物素醯肼(biotin hydrazide，BHZ)的制備
BHZ是水合肼(hydrazine hydrate)與生物素的合成物，因在生物素的羧基側鏈上帶有肼基，故能標記帶醛基的蛋白質。
BHZ制備過程：取10生物素和氯化亞碸0.1 ml，在攪拌下緩慢加入冰冷的無水甲醇1ml中。溶解後放置28℃24h，繼經真空乾燥；加無水甲醇lml，待溶解後再次真空乾燥。殘余物溶於0.5mL無水甲醇，並緩慢加入水合肼0.1ml，置28℃24h後用濾紙過濾，沉澱物用乙醚20ml反復淋洗，最後用DMF l0 ml淋洗，移置37℃溫箱內烘乾，放4℃保存備用。
BHZ主要用於標記偏酸性的糖蛋白。如在其側鏈上添加1分子賴氨酸作為連接臂，可使生物素免受位阻作用，更易與親合素結合。
4）肼化生物胞素 (biocytin hydazide ，BCHZ)的制備 生物胞素為ε生物素賴氨酸，是生物素通過C=O基與賴氨酸的ε-氨基連接生成的化合物。BCHZ可與蛋白質的醛基和氨基結合，優於只能與醛基結合的BHZ。
BCUZ制備過程：取生物胞素甲酯100mg溶於甲醇2 ml，加入無水肼0.1 ml，25℃反應48h.濃縮至近乎乾燥時，在H2SO4乾燥裝置中減壓抽干，直至只測出少量的肼。產物溶於l ml蒸餾水中，通過聚苯乙烯型色譜固定相Q去肼。BCHZ可在熱乙醇中結晶。
2．生物素結合物的制備
經過活化的生物素及其衍生物可以和各種蛋白質(包括抗體、葡萄球菌A蛋白、酶、激素等)、多肽、多糖、核酸及核素、熒光素、膠體金等結合；並可藉助交聯劑與細胞、瓊脂糖珠等偶聯。廣泛應用於免疫學、細胞生物學和分子生物學的實驗研究領域，以及作為親和分離制劑，用於相應配基的分離與純化。以下重點介紹生物素化抗體、抗原及酶結合物的制備方法。
1）生物素化抗體制備
(1)BNHS溶液lmg／ml以二甲亞碸(DMSO)制備。
(2)將待偶聯的抗體溶液以0．1m01／LpH9．0NaHCO。配成1—2mg／m1。
(3)將BNHS與待偶聯抗體(如IgG)按1：8混合，室溫攪拌4h。
(4)4℃條件下使上述混合液體以o．05m01兒，pH7．2PBS透析過夜，加等體積甘油
或0．02％NaN：一30℃分裝存放。
生物素化抗體應避免反復凍融，按使用需量分裝小瓶。一旦啟封稀釋使用，勿繼續凍存保留。
2）生物素化辣根過氧化物酶(bio—HRP)制備：
(1)取BNHS(MW454)2．?mg溶於4m1DMF。
(2)以0．1m01兒pH8．4的NaHC02配製5mg／m1的HRP，按BNHS：HRP為1：8
混合(應將BNHS溶液緩慢加至HRP溶液)。置22℃反應4h。；
(3)上述混合液於4℃條件下對0．01m01兒pH7．4PBS透析，48h，中間換液8次以上。
(4)收集透析液加等量甘油混合，或加o．02％NaN，分裝，-20℃存放。

C. 生物素-親合素系統的BAS系統的應用

BAS-ELISA是在常規ELISA原理的基礎上，結合生物素(B)與親和素(A)間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統。生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。這樣，結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應，既起到了多級放大作用，又由於酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。
BAS用於檢測的基本方法可分為三大類。
第一類是標記親和素連接生物化大分子反應體系，稱BA法，或標記親和素生物素法(LAB)。

第二類以親和素兩端分別連接生物素化大分子反應體系和標記生物素，稱為橋聯親和素-生物素法(BRAB)。
第三類是將親和素與酶標生物素共溫形成親和素-生物素-過氧化物酶復合物，再與生物素化的抗抗體接觸時，將抗原-抗體反應體系與ABC標記體系連成一體，稱為ABC法。這一方法可以將微量抗原的信號放大成千上萬倍，以便於檢測。 親和層析是將具有特殊結構的親和分子製成固相吸附劑放置在層析柱中，當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質由於不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質分開，然後選用適當的洗脫液， 改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。
生物素-親和素系統可以與親和層析的方法結合，大大提高純化蛋白質的純度，或者為已知配體尋找受體。步驟是首先將生物素共價結合到配體蛋白上，再將生物素化後的配體蛋白加入含有受體蛋白的混合物，然後將此混合物通過預先固定了親和素的層析柱，這時配體受體復合物就通過生物素-親和素系統停留在層析柱上，最後通過選擇性洗脫獲得此受體配體蛋白復合物或者僅有受體。這一方法被廣泛運用於葯物研發行業，當人們發現某種葯物分子具有療效但是又不清楚它具體作用於哪種蛋白質時，可以將其生物素化然後把靶蛋白從成千上萬種蛋白質中「抓」出來。
生物素-親和素系統還可以用相似的方法分離DNA.方法是在DNA探針的一端掛上生物素，然後用其獲得目的DNA片段，再利用固定化的親和素回收這些DNA。
傳統的基因探針是由帶放射性的磷酸鹼基合成的，我們可以用被生物素標記的磷酸鹼基合成基因探針，避免了實驗過程中放射性物質可能造成的傷害。

D. 蛋白質的純化方法有那些呢具體步驟是什麼

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：

（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

E. 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種各自的作用原理是什麼

分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離。

常見的分離提純蛋白質的方法有：
1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質從溶液中沉澱析出，稱為鹽析。常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等。鹽析時，溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好。凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白質沉澱。2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷，因此在電場中可以移動。電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小。3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質，可將大分子物質與小分子物質分離開。4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離。主要有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等，其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量。5、分子篩：又稱凝膠過濾法，蛋白質溶液加於柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質進入孔內，因而在柱中滯留時間較長，大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出，因此不同大小的蛋白質得以分離。6、超速離心：利用物質密度的不同，經超速離心後，分布於不同的液層而分離。超速離心也可用來測定蛋白質的分子量，蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比。

F. 蛋白質純化有哪些方法，如何應用

常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等
離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液pH。pH小於pI時蛋白質帶正電，pH大於pI時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。
親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中Ni可以與His標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。
電泳：SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，
與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。
疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。