生物活性物質的濃縮方法有哪些

Ⅰ 活性成分總黃酮的提取方法有哪些

總黃酮的提取方法
1、 熔劑法
熱水提取法、鹼性水或鹼性稀醇提取法、有機溶劑提取法 2、
2、微波提取法
微波提取是利用不同結構的物質在微波場中吸收微波能力的差異，使基體物質中的某些區域或提取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使被提取物質從基體或體系中分離，進入介電常數較小，微波吸收能力相對差的提取劑[1]。這種方法的優點是對提取物具有較高的選擇性、提取率高、提取速度快、溶劑用量少、安全、節能、設備簡單[2]。 2.2 超聲波提取法
用超聲波提取法提取黃酮類物質，是目前比較新的方法。原理是利用超聲波在液體中的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外，還利用其次效應，如機械振動、擴散、擊碎等，使其加速被提取成分的擴散、釋放。超聲波提取法具有設備簡單，操作方便，提取時間短，產率高，無需加熱，同時有利於保護熱不穩定成分，省時，節能，提取率高的優點。
3、 超臨界流體萃取法
超臨界流體萃取技術是利用超臨界流體處於臨界溫度和臨界壓力以上，兼有氣體和液體的雙重特點，對物質具有良好的溶解能力，從而作溶劑進行萃取分離。可做超臨界流體的物質很多，一般為低分子量的化合物，如CO2、C2H6、NH3、N2O 等。目前多採用CO2 做萃取劑，因為它具有密度大、溶解能力強、臨界壓力適中、臨界溫度接近常溫、不影響萃取物的生理活性、無毒無味、化學性質穩定、生產過程中容易回收、無環境污染、價格便宜等一系列優點。但單一的CO2作萃取劑只對低極性、親脂性化合物有較強的溶解能力，對大多數極性較強的組分則不起作用，因此，在其中加入夾帶劑，通過影響溶劑的密度和溶質與夾帶劑分子間的作用力來影響溶質在二氧化碳流體中的溶解度和選擇性[15]。超臨界流體萃取技術有許多傳統分離技術不可比擬的優點：過程容易控制、達到平衡的時間短、萃取效率高、無有機溶劑殘留、對熱敏性物質不易破壞等[16]。但它所需要的設備規模較大，技術要求高，投資大，安全操作要求高，難以用於較大 規模的生產。
4、 酶法提取
酶解法適用於被細胞壁包圍的黃酮類物質，利用酶反應的高度專一性，破壞細胞壁，使其中的黃酮類化合物釋放出來。黃劍波等[22]採用纖維素酶輔助法從甜茶中提取黃酮類化合物，黃酮類物質的提取率為91%，提取純度為54%。王悅等[23]對桔皮細胞進行游離酶、固定化酶和常規法提取，黃酮得率分別是1.43%，0.94% 和0.79%，和傳統的方法相比，游離酶法的總黃酮得率提高了81%。
5、雙水相提取法
雙水相提取技術是瑞典Per Albersson首先發現並研究 的一種技術，雙水相萃取法屬於液- 液萃取，當物質進入雙 水相體系後，由於表面性質、電荷作用和各種力的作用，溶 液環境的影響，其在上、下相中的濃度不同，即各成分在兩 相間選擇性分配，從而達到萃取的目的。由於雙水相體系分 相快、使用溫度低、容易操作、無污染、提取率高，因此成 為黃酮化合物富集分離的一種有效方法。張春秀等[24]取一 定量的銀杏葉浸提液，加到PEG1500/ 磷酸鹽體系雙水相 系統中，則黃酮類化合物進入上相PEG，從而將黃酮類化合 物分離，提取率可達98.2%。
6、 半仿生提取法
半仿生提取法是將整體葯物研究法與分子葯物研究法相結合，模擬口服給葯後葯物經胃腸道轉運的環境，為經消化道給葯的中葯制劑設計的一種新的提取工藝。這種提取方法的特點是可以提取和保留更多的有效成分，能縮短生產周期、降低成本。
7、膜分離法
膜分離法主要有超濾、微濾、納濾和反滲透等，其中超濾法是膜分離的代表，它是唯一能用於分子分離的過濾方法，是以多孔性半透膜為分離介質，依靠薄膜兩側壓力差作為推動力來分離溶液中不同分子量的物質。由於大多數黃酮類化合物的分子量在1000 以下，而非有效成分如大多數的多糖、蛋白質等分子量多在50000 以上，因而使用超濾能有效去除蛋白質、多肽、大分子色素、澱粉等，達到除菌、除熱原、提高葯液澄明度以及提高有效成分含量等目的。這種方法操作簡便、不需要加熱、不損壞黃酮類化合物，提取效果好、超濾裝置可反復使用。於濤等[26]研究了銀杏葉中黃酮類化合物的提取過程及工藝，使用超濾技術對粗提的產品進行精製，對影響超濾的工藝條件進行了考察，超濾後產品中黃酮質量分數達到33.99%。
8、 熱壓流體萃取法
熱壓流體萃取法是一種快速、環保、便宜、有效地萃取生物活性物質的方法。Chaorui Chen等[27]採用熱壓流體萃取法從巴西蜂膠中提取了7種黃酮類化合物，結果表明，通過熱壓水萃取的樣品中當存在表面活性劑時萃取物的固體含量更高，當使用熱壓脂溶萃取時，7種黃酮類化合物的含量在脂溶萃取中超過了水溶萃取。KairHartonen等[28]用熱壓水萃取法從白楊中萃取了黃酮類化合物，考察了萃取時間、溫度和壓力等因素的影響，並與超聲波萃取、高速逆流色譜做了比較，結果表明用熱壓水萃取法在150℃萃取35min效 果最好。
2.9 高壓液相提取法
Ying Zhang等[29]通過高壓液相萃取法從魚腥草中萃取了黃酮類化合物，研究了乙醇濃度、流速、溫度和壓強等因素的影響，並與熱浸法和超聲波輔助萃取法進行對比，發現高壓液相萃取法提取效果較好，當使用50% 乙醇，溶劑流速為1.8mL/min，溫度為70℃，壓強為8MPa 時，黃酮類化合物的得率和濃度可以達到3.152% 和23.962%

Ⅱ 什麼物質和5'AMP混合難於萃取分離但通過多次萃取又能分離

現代生物制葯工藝學上課講義（2）

第二章 生物制葯工藝技術基礎
第一節 生物材料與生物活性物質
一、生物材料的來源
供生產生物葯物的生物資源主要有動物、植物、微生物的組織、器官、細胞與代謝產物。應用動植物細胞培養與微生物發酵技術也是獲得生物制葯原料的重要途徑。基因工程技術與細胞工程技術和酶工程技術更是開發生物制葯資源的新途徑。
（一）動物臟器
（1）胰臟 （激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）
（2）腦 （腦磷脂、肌醇磷脂、神經磷脂、神經肽等）

（3）胃粘膜（胃蛋白酶、膠原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）
（4）肝臟（維生素、磷脂類、膽固醇）
（5）脾臟（免疫器官）
（6）小腸（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃腸道激素）
（7）腦垂體（各種激素）
（8) 心臟（細胞色素C、輔酶Q10）
其它等
（二）血液、分泌物和其它代謝物
血液製品：人血制劑、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纖維蛋白原，免疫球蛋白、人血漿、干擾素、白介素等。
尿液、膽汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料，尿激酶，表皮生長因子、HCG

（三）海洋生物
（1）海藻
（2）腔腸動物 海葵毒素
（3）節肢動物 甲殼素
（4) 軟體動物 多糖、多肽、毒素
（5）棘皮動物 海星、海膽、海參 海參素抗癌
（6）魚類 魚油、多種激素、毒素，硫酸軟骨素
（7）爬行動物 龜 滋陰養腎 抗腫瘤
（8）海洋哺乳動物 鯨魚魚肝油
（四）植物
生物鹼、強心甙、黃酮、皂甙、揮發油、樹脂、鞣質等。

（五）微生物
1.細菌
常用細菌發酵法生產乳酸、醋酸、丙酮、丁醇。主要有：
（1）氨基酸
利用微生物酶可轉化對應的α酮酸或羥基酸作用產生氨基酸。
（2）有機酸 檸檬酸、蘋果酸、乳酸
（3）糖類 利用細菌可製取葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。
（4）核苷酸類 用細菌可生產5『－AMP，5』－肌苷酸
（5）維生素 VB1,VB2，VB6, Vc
（6）酶 澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶、彈性蛋白酶

2.放線菌
放線菌是最重要的抗生素產生菌，已有1000多種抗生素約2/3產自放線菌。
（1）氨基酸 發酵法
（2）核苷酸 5-脫氧肌苷酸
（3）維生素
（4) 酶
3.真菌
（1)酶
（2）有機酸
（3）氨基酸
（4）核酸及有關物質
（5）維生素
（6)促生素
（7）多糖

4.酵母菌
（1）維生素
（2）蛋白質與多肽
（3）核酸

（六）開發生物新資源
（1）動植物細胞的大規模培養
（2）應用基因工程技術建立工程菌或工程細胞

二、生物活性物質的存在方式
（一）生物活性物質的存在方式與其生物功能
根據生物活性物質的生物功能推斷其存在部分和分布方式。生物活性物質分為胞內與胞外兩種存在部位。
（二）生物分子間的作用力

三、生物活性物質的存在特點
（一）生物材料組成的復雜性
（二）生物活性物質存在地特點
生物活性物質在生物材料中含量較低，雜質含量很高，而且生理活性愈高，含量愈低。
生物材料中的生化組成數量大，種類多，分離純化比較困難。

四、生物材料的准備
生物材料的製造主要包括以下工藝過程：
1)生物材料的選取與預處理；
2)從生物材料中提取有效活性物質；
3)有效成分的分離，純化
4)後處理及制劑

（一）生物材料的選取
1.有效成分的含量
（1）生物品種
根據目的物的分布，選擇富含有效成分的生物品種是選材的關鍵。（催乳素，哺乳動物）

（2）合適的組織器官 （胃蛋白酶，胃）
（3）生物的生長期
生物的生長期對生理活性物質含量影響很大。
2.雜質情況
難於分離的雜質會增加工藝的復雜性，嚴重影響收率、質量和經濟效益。
3.來源
應選用來源豐富的材料，盡量不與其他產品爭原料，最好能一物多用，綜合利用。
胰臟 制備彈性蛋白酶和激肽釋放酶，胰島素與胰酶等。

（二）生物材料的採集與保存
生理活性物質易失活與降解，採集時必須保持材料的新鮮。防止腐敗、變質與微生物污染。如胰臟採摘後要立即速凍，防止胰島素活力下降。
保存生物材料的主要方法有速凍、凍干、有機溶劑脫水，製成丙酮粉，或浸存於丙酮與甘油中等。
（三）動物細胞的培養與保存
（四）微生物菌種的選育與保存
1.菌種的分離
微生物種類繁多，易於培養，是工業化生產各種生物葯物的主要材料。
（1）含菌樣品的收集
根據微生物的生態特點，從自然界取樣，分離所需要菌種，如到堆積和腐爛纖維素的地方去取樣分離纖維素酶產生菌。

到溫泉附近取樣分離高溫蛋白酶產生菌。
一般可以從土壤中分離所需微生物，取樣時先將表土颳去2~3cm，在同一條件下選好2~5點土樣混在一起包好，表明采樣地點及日期備用。
（2）富集培養
收集到的樣品若含所需要的菌較多，可直接分離。如含所需要的菌很少，就需要經過富集培養，使所需要的菌大量生長，以利於篩選。再配合控制溫度，pH或營養成分即可達到目的。有時用能分解的底物作為生長和誘導產生所須成分的培養基成分，以使所需要的菌種得到快速生長，有利於進一步分離。
（3）菌種純化
在自然條件下，各種類型的菌混雜在一起生活，所以要進行分離，以獲得純種。菌種純化的方法一般採用稀釋分離或劃線分離法。

2.菌種的篩選
（1）篩選對象的選擇
篩選前，先要考慮哪些微生物是篩選的對象。如有報道，則根據文獻收集可能性最大的的微生物進行篩選。
（2）培養方式的確定
微生物的培養方式，有固體培養與液體培養。
3.菌株的選育
從自然界直接分離得到的菌種，都不能立即適應實際生產需要。只有通過誘變，選育才能使產量成倍，成百倍地提高。選育方法基本上可以分成兩類：隨機選擇突變體；根據代謝的調節機制選擇各種突變體。
（1）隨機選擇法
一般程序是採用誘變劑誘變處理微生物，增殖培養，經過稀釋塗布，隨機選擇部分或全部單菌落，逐個測定它們的生物活性。最後挑選出產量或其它性能比親代菌株優秀的突變株。
（2）根據代謝的調節機理選擇高產突變體
根據代謝的調節機理選擇高產突變體。(抗性基因)
4.菌種的保藏
（1）菌種的退化與防止
生產菌種本來在自然環境下生長，所以在人工培養條件下，任何菌株通過一系列的轉接傳代都可能發生退化。
退化—一般把菌株的生活力，產孢子能力的衰退和特殊產物產量的下降，成為退化。
菌種退化現象：①單位容積中發酵液的活性物質含量；②瓊脂平皿上的單菌落形態；③不同培養時期菌體細胞的形態和主要遺傳特徵。如形成孢子能力；④發酵過程pH變動情況；⑤發酵液的氣味、色澤。

菌種退化防止措施：①防止基因突變，基因突變是菌種退化的一個主要原因，低溫保藏法可以減少突變得產生。②採用雙重缺陷型 採用雙營養缺陷標志可間接而有效地防止突變。③制定科學管理制度 製作平行菌種斜面；④分離單菌落；認真進行單菌落分離工作，再多做平行的菌種斜面；⑤選擇培養條件 選擇有利於高產菌株而不利於低產菌株的培養條件。
（2）常用的菌種保藏方法
斜面保存法—將菌種轉接到新鮮的瓊脂斜面上，待生長良好後，於4℃保存。根據具體情況，間隔一定時間後轉接。
礦油法—在菌種斜面上覆蓋礦物油以隔絕空氣防止蒸發。
索氏法—將小試管斜面的菌種放在大試管內，大試管內裝幾粒氫氧化鉀，管口加橡皮套，然後用石蠟包封。

干硅膠法—試管內裝硅膠約半滿，180℃加熱滅菌1.5小時，置密封乾燥器內冷卻，接種菌液約1ml，塞好棉花，放入預置有色硅膠的大瓶中，蠟封瓶口，於低溫處保存。
砂土管法—取普通黃沙，洗凈過60目篩，曬干，另取普通圓土研碎，過篩，曬干。兩者以6:4混合。分裝於安醅瓶或小試管中，然後在60℃乾熱滅菌2小時，連續滅菌三次後即可使用。裝管時可吸取少許孢子懸浮液加入，待乾燥後抽真空封口或用棉花塞緊後蠟封，低溫保藏。
冷凍乾燥法：將菌種懸浮於脫脂消毒牛奶中，快速冷凍，真空乾燥。
甘油冷凍保存法：將對數期菌體懸浮於新鮮培養基中，加入15%消毒甘油，混勻速凍，凍存於－70~－80℃.

（五）組織與細胞的破碎
組織與細胞的破碎方法有物理法、化學法與生物法。
1.物理法
（1）磨切法
工業上常用的有絞肉機，刨胰機，球磨機、磨粉機。實驗室常用的有勻漿機，研缽，高速組織搗碎機。
（2）壓力法
有壓榨法、高壓法和減壓法，滲透壓法。
（3）超聲波法
（4）反復凍融法
2.化學法
用稀酸、稀鹼、濃鹽、有機溶劑或表面活性劑處理細胞，可破壞細胞結構釋放出內容物。

3.生物法
（1）組織自溶法
利用組織中自身溶解酶的作用改變、破壞細胞結構，釋放出目的物稱為組織自溶法。
(2) 酶解法
用外來酶處理生物材料，如用溶菌酶處理某些細菌，蝸牛酶等
（3）噬菌體法
用噬菌體感染細胞、裂解細胞，釋放出內容物。
（六）細胞器的分離
為獲得結合在細胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到細胞器再進一步分離有效成分。方法是勻漿破碎細胞，差速離心。

第二節 生物活性物質的提取
提取是利用制備目的物的溶解特性，將目的物與細胞的固形物成分或其它結合成分分離，使其由固相轉入液相或從細胞生理狀態轉入特定溶液環境的過程。
一、物質性質與提取
（一）物質的性質與提取方法的選擇
要取得好的提取效果，最重要的是要針對生物材料和目的物的性質選擇合適的溶劑系統與提取條件。
生物材料及其目的物與提取有關的一些性狀包括溶解性質、分子量、等電點、存在方式、穩定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要雜質種類及溶解性質，有關酶的特徵等。其中最主要的是目的物與主要雜質在溶解度方面的差異以及它們的穩定性。操作者可根據文獻資料及本人的試驗摸索獲得的有關信息，在提取過程中增加目的物的溶出度，盡可能減少雜質的溶出度。

（二）活性物質的保護措施
（1）採用緩沖鹽系統
在生物葯物制備中，常用的緩沖鹽有磷酸緩沖鹽，檸檬酸緩沖鹽，Tris緩沖液，醋酸緩沖鹽，碳酸緩沖鹽，硼酸緩沖鹽和巴比妥緩沖鹽等。
（2）添加保護劑
防止某些生理活性物質的活性基團及酶的活性中心受到破壞，如巰基是許多活性蛋白質和酶催化活性基團，極易被氧化，故提取時，常添加某些還原劑如半胱氨酸，－巰基乙醇。對易受重金屬影響的，可添加EDTA。
（3）抑制水解酶的作用

二、物質的性質與溶解度
（一）物質溶解度的一般規律
相似相溶
（二）水在生化物質提取中的作用
水是提取生化物質的常用溶劑。水分子的存在可使其它生物分子之間的氫鍵減弱，而與水分子形成氫鍵，水分子還能使溶質分子的離子鍵解離，這就是所謂的水合作用。水合作用促使蛋白質、核酸、多糖等生物大分子與水形成了水合分子或水合離子從而促使它們溶解於水或水溶液中。
三、提取效率

（4）其它保護措施（冷、熱、酸、鹼）

四、影響提取的因素
（一）溫度
多數物質的溶解度隨提取溫度的升高而增加。另外較高的溫度可以降低物料的粘度，有利於分子擴散和機械攪拌，所以對耐熱成分的提取可以用加熱的方法。對不耐熱的生物活性物質的提取，一般在0~10℃進行提取。
(二)酸鹼度
多數生化物質在中性條件下較穩定，pH值一般應控制在4～9范圍內，為了增加目的物的溶解度，往往要避免目的物的等電點附近進行提取。
巧妙地選擇溶劑系統的pH值不但直接影響目的物與雜質溶解度，還可以抑制有害酶類的水解破壞作用，防止降解，提高收率。

（三）鹽濃度
鹽溶作用
鹽析作用

五、提取方法
（一）用酸、鹼、鹽水溶液提取
（二）表面活性劑提取
表面活性劑分子兼有親水與疏水基團，分布於油水界面時，有分散、乳化和增溶作用。表面活性劑分陰離子型、陽離子型與非離子型。離子型表面活性劑作用強，但是易引起蛋白質等生物大分子的變性，非離子表面活性劑變性作用小，適合於用水、鹽系統無法提取的提取的蛋白質或酶的提取。

（三）有機溶劑提取
1.固－液提取
丙酮從動物腦中提取膽固醇，
溶劑分級提取：如先用丙酮，再用乙醇，最後用乙醚提取。石油醚，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，甲醇。
丙酮粉
2.液－液萃取
液－液萃取是利用溶質在兩個互不混溶的溶劑中溶解度的差異，將溶質從一個溶劑相向另一個溶劑相轉移的操作。分配系數和溶劑用量
溶劑萃取的注意事項：
（1）pH
在萃取操作中正確選擇pH值很重要。因為在水溶液中某些酸、鹼物質會解離，在萃取時改變了分配系數，直接影響提取效率。

（2）鹽析
加入中性鹽如硫酸銨，氯化鈉等可以使一些生化物質的溶解度減少，這種現象成為鹽析。在提取液中加入中性鹽，可以促使生化物質轉入有機相從而提高萃取率。
（3）溫度
一般在室溫下或低溫下進行萃取操作。
（4）乳化
在液液萃取時，常發生乳化作用，使有機溶劑與水相分層困難。去乳化的常用方法有：過濾與離心，輕輕攪動，改變兩相的比例；加熱，加電解質，加吸附劑。
液液萃取時溶劑的選擇：
（1）選用的溶劑必須具有較高的選擇性，各種溶質在所選的溶劑之間分配系數差異愈大愈好。
（2）選用的溶劑，在萃取後，溶質與溶劑要容易分離與回收。

(3)兩種溶劑的密度相差不大時容易形成乳化，不利於萃取液的分離。
（4）要選用無毒，不易燃燒的價廉易的溶劑。
第三節 生物活性物質的濃縮與乾燥
一、生物活性物質的濃縮
（一）鹽析濃縮
硫酸銨沉澱蛋白質
（二）有機溶劑沉澱濃縮
在生物大分子的水溶液中，逐漸加入乙醇，丙酮等有機溶劑，可以使生化物質的溶解度明顯降低，從溶液中沉澱出來。
（三）用葡聚糖凝膠（Sephadex）濃縮
（四）用聚乙二醇透析濃縮

（五）超濾濃縮
（六）真空減壓濃縮與薄膜濃縮
真空減壓濃縮在葯物生產中使用較為普遍，具有生產規模較大，蒸發溫度較低，蒸發速度較快等優點。
薄膜濃縮器的加速蒸發的原理是增加汽化表面積。使液體形成薄膜而蒸發，成膜的液體具有較大的表面積，熱傳播快而均勻，沒有液體靜壓的影響，能較好地防止物料的過熱現象。
二、乾燥
乾燥的目的：提高葯物或葯劑的穩定性，以利於保存和運輸；達到規格標准；便於進一步處理。
表面水，毛細管中的水，細胞內的水

（一）減壓乾燥
（二）噴霧乾燥
（三）冷凍乾燥
第四節 生化物質的分離純化方法
一、生物制葯中分離制備方法的特點
生物制葯中分離、制備方法有以下特點：
（1）生物材料組成非常復雜。一種生物材料常含成千上萬成分，各種化合物的形狀、大小、分子量和理化性質都各不相同。沒有固定操作方法。
（2）有些化合物在生物材料中含量極微，只達萬分之一，甚至百萬分之一。因此，分離操作步驟多，不易獲得高收率。
（3）生物活性物質離開生物體後，易變性，破壞，分離進程必須十分小心的保護這些化合物的生理活性。（難點）

（4）生物制葯的分離方法幾乎都在溶液中進行，各種參數（溫度，pH，離子強度）對溶液中各種組分的綜合影響常常無法固定，以致許多實驗設計理論性不強。
（5）為了保護目的物的生理活性及結構上的完整性，生物制葯中的分離方法多採用溫和的逐級分離方法。親和層析分離具有分離的專一性，高效性。
（6）生物產品最後均一性的證明與化學純度的概念不完全相同，因生物分子對環境反應十分敏感，結構與功能關系比較復雜。
二、生物制葯中分離制備方法的基本原理
生物大分子分離純化的主要原因：
（1）根據分子形狀和大小不同進行分離。如差速離心與超離心、膜分離（透析，電滲析）與超濾，凝膠過濾法。
（2）根據分子電離性質的差異性進行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。

（3）根據分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉澱法，及有機溶劑分級沉澱法。
（4）根據物質吸附性質的不同進行分離。如選擇性吸附法與吸附層析法。
（5）根據配體特異性進行分離—親和層析法。
三、分離純化的基本程序和實驗設計
生物體內某一組分，特別是未知結構的組分的分離制備設計大致上分為五個基本階段。
（1）確定製備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法。
（2）制備物理化性質穩定性的預備試驗。
（3）材料處理及抽提方法的選擇。
（4）分離純化方法的摸索。
（5）產物均一性測定。

提取是分離純化目的物的第一步，所選的溶劑應對目的物具有最大的溶解度，並盡量減少雜質進入提取液。
分離純化是生化制備的核心操作。分離策略：
1.分離純化早期使用方法的選擇
分離純化的早期，由於提取液中的成分復雜，目的物濃度較稀，與目的物理化性質相似的雜質多，所以不宜選擇分辨能力較高的純化方法。早期分離純化用萃取，沉澱，吸附等一些分辨力低的方法較為有利，這些方法負荷能力大，分離量多兼有分離提純和濃縮的作用，為進一步分離純化創造良好的基礎。
一個特異性方法的分辨力愈高，便意味著提純步驟愈簡化，收率愈高。
2.各種分離純化方法的使用程序

生化物質的分離都是在液相中進行，故分離方法主要依據物質的分配系數，分子量大小，離子電荷性質及數量和外加環境條件的差別等因素為基礎。而每一種方法又都是在特定條件下發揮作用。因此，在相同或相似條件下連續使用同一種分離方法就不太適宜。
在安排純化方法順序時，還要考慮到有利於減少工序，提高效率。（鹽析－吸附，吸附－鹽析）
對於一未知物通過各種方法的交叉應用，有助於進一步了解目的物的性質。
3.分離後期的保護性措施
在分離操作的後期必須注意避免產品的損失，主要損失途徑是器皿的吸附，操作過程樣品液體的殘留，空氣氧化和某些事先無法了解的因素。

四、分離純化方法步驟優劣的綜合評價
每一個分離純化步驟的好壞，除了從分辨能力和重現性兩方面考慮，還要注意方法本身的回收率，特別是制備某些含量很少的物質時，回收率的高低十分重要。
對每一步驟方法的優劣，體現在所得產品重量與活性平衡關繫上。例如酶的分離純化，每一步驟產物重量與活性關系，通過測定酶的比活力及溶液中蛋白質濃度的比例。
五、制備物均一性的鑒定
均一性是指所獲得的制備物只有一種完全相同的成分。（純度鑒定）
生物分子純度的鑒定方法很多，常用的有溶解度法、化學組成分析法，電泳法，免疫學方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質譜法。

第五節 生物制葯中試放大工藝設計
一、生物制葯中試放大工藝特點
中試放大是由小試轉入工業化生產的過渡性研究工作，對小試工藝能否成功地進入規模生產至關重要。這些研究工作都是圍繞如何提高收率，改進操作，提高質量，形成批量生產等方面進行。中試放大，驗證實驗室工藝路線的可行性以及在實驗室階段難以解決或尚未發現的問題。
在考查工藝條件的研究階段中，必須注意和解決：
（1）原輔材料規格的過渡試驗
在小試時，一般採用的原輔材料（如原料，試劑，溶劑，純化載體）規格較高，目的是為了排除原料中所含雜質的不良影響，從而保證實驗結果的准確性。但是當工藝路線確定之後，在進一步考察工藝條件時，應盡量改用大規模生產時容易得到的原輔材料。過渡試驗

2.設備選型與材質質量試驗
在小試階段，大部分實驗是在小型玻璃儀器中進行，但在工業生產中，物料要接觸到各種設備材料，如微生物發酵罐，細胞培養罐，固定化生物反應器，多種層析材料以及產品後處理的過濾濃縮、結晶、乾燥設備等。
3.反應條件限度試驗
反應條件限度試驗可以找到最適宜的工藝條件（如培養基種類，反應溫度，壓力，pH等），一般均有一個許可范圍。有些反應對工藝條件要求很嚴，超過一定限度後，就會造成重大損失。進行工藝條件限度試驗，全面掌握反應規律。
4.原輔材料、中間體及產品質量分析方法研究
5.下游工藝的研究
盡量簡化下游工藝操作，採用新工藝，新技術，新設備等。

二、中試放大方法與內容
中試放大的方法有經驗放大法，相似放大法和數學模型放大法。經驗放大法主要憑借經驗通過逐級放大（實驗裝置，中間裝置，中型裝置和大型裝置）來摸索反應器的特徵。
中試放大程序可採用步步為營或一竿子到底策略。
中試放大的研究內容主要有：
（1）工藝路線與各步反應方法的最後確定
（2）設備材質與型號的選擇
（3）反應器的規模選擇及反應攪拌器型式與攪拌速度的考查。
（4）生產反應條件的研究
（5）工藝流程與操作方法的確定

（6）物料衡算
（7）安全生產與三廢防治措施研究
（8）原輔材料，中間體的物理性質和化工常數的測定
（9）原輔材料、中間體質量標準的制定。
（10）消耗定額，原料成本，操作工時與生產周期計算。

生產工藝規程的制訂

Ⅲ 如何提取得到具有生物學活性的RNA

提取得到具有生物學活性的RNA的方法：

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然後用酚和酚-氯萃取，高速離心後取上清，所得DNA大小為100-150kb

2、甲醯胺解聚法：破碎細胞同上，然後用高濃度甲醯胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪於乙醇上，然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。

在過去的十年中

RNA-Seq技術迅速發展，並成為了在轉錄組水平上分析差異基因表達/mRNA可變剪切的不可缺少的工具。隨著下一代測序技術的發展，RNA-Seq技術應用范圍變得更加廣泛：在RNA生物學領域，RNA-Seq可以應用於單細胞基因表達/蛋白質表達/RNA結構的分析；空間轉錄組的概念也逐漸興起。

Ⅳ 濃縮DNA方法有哪些(至少三種)

鄙視樓上的答非所問！
三種方法：
1，沉澱後復溶；
2，吸附後洗滌；
3，凍干

Ⅳ 生物活性物質主要有哪些提取方法

植物的活性物質的提取多採用：溶劑法、水蒸汽蒸餾法、超臨界二氧化碳提取分離法、萃取法。分離多用硅膠柱色譜法。動物的生理活性物質提取分離比較復雜，方法多種：如鹽析法、電泳法、高速離心法、受體識別法等。

Ⅵ 微生物活性物質分離純化步驟或流程圖、急!!!!!!!!!!!

你可以考慮以下幾方面：
1）初步確定你的發酵液中的活性成份的性質，HPLC顯示都是極性非常強只是說明它的水溶性很好，不足以判斷它的性質；你可以查閱質料，看一下相關的菌種產生的活性物質的種類，然後設計相關的實驗來進行初步驗證，比如抗生素能產生抑菌圈，蛋白酶能水解蛋白質底物形成透明圈等相關實驗；
2）根據活性成分的性質來設計分離純化的方法；
3）發酵液的預處理，首先要過濾除去菌體等發酵液中不能溶解的雜質，如果產生色素的話最後先去除色素，以免干擾後面的分離過程；同時要根據活性成分成分的性質對活性成分進行一定的濃縮處理，再根據你要用的柱子來進行必要的處理，比如透析出鹽等，同時要注意在預處理的過程中盡量保持活性成分的活性。

離心去菌體後，你可以先用各種有機溶劑如甲醇、氯仿等進行萃取，檢查萃取液與沉澱物質的活性，確定你的活性成分的大致性質；也可以先用鹽析的方法，用硫酸氨等進行鹽析，測試活性。這些工作完了以後，可以過開放柱進行初步的純化，收集活性物組分。有必要的話，上低壓色譜柱或是高壓色譜。收集活性峰，一般經過高效液相色譜後，就比較純了。
如果活性物質極性很強，那你就需要換一根可以分離極性物質的柱子，好像C18或是凝膠柱。

發酵液的預處理和固液分離
根據活性物質的許可范圍，可以採取酸化、加熱、過濾、絮凝、離心等。

提取(分離濃縮)
經常採用的方法有化學萃取、樹脂吸附、沉澱等。

精製(純化)
常採用的方法有結晶、脫色、色譜層析等。
此外在提取步驟中應用的沉澱、吸附等方法也可用於樣品的純化。

提取方法的選擇
1.產品的基本理化性能，如化學結構、化合物的溶解度、極性、pK值、官能團反映等。
2.化合物的穩定性，如耐受的pH范圍、耐受的溫度條件、光照、氧化等。
此外，在分離純化過程中值得提及的是，盡可能地避免二次污染。如分離純化過程中使用的水要求去離子，有機溶劑要求高純級，使用的樹脂應該經過預處理除去其中殘留的雜質等。

Hplc純化時可試試調節pH值，適當降低乙腈或甲醇的量

Ⅶ 抗原濃縮的名詞解釋是什麼 急急急

抗原的濃縮
濃縮是低濃度溶液通過除去溶劑(包括水)變為高濃度溶液的過程，在制備生物大分子及各種生化產品時，常在提取後和結晶前進行濃縮，有時也貫穿在整個制備過程中。沉澱(包括鹽析和有機溶劑沉澱)，廣義上來說也是一種濃縮方法，經過沉澱再溶解，濃度可大大提高，但有時提取液很稀，體積又很大或結晶前除去少量溶劑，則常用其他方法濃縮。
1．蒸發法液體在任何溫度下都在蒸發，蒸發是溶液表面的溶劑分子獲得動能脫離液面逸向空間的過程。當溶液受熱，液體中溶劑分子動能增加，蒸發過程加快。蒸發的快慢和溫度、蒸發面積、液體表面積、液面蒸汽分子密度，即蒸汽壓大小有關。各種液體在一定溫度下都具有一定飽和蒸氣壓，當液面上的溶劑蒸氣分子密度很小，經常處於不飽和的低壓狀態，液相與氣相的溶劑分子為了維持其分子密度的動態平衡狀態，溶液中的溶劑分子就必須不斷地氣化逸出空間，以維持其一定的飽和蒸氣壓力。因此，根據上述原理，蒸氣濃縮裝置常按照加熱、擴大液體表面積、低壓和加速空氣流動等因素而設計的。
2．冰凍法冰凍法也是生物大分子及其他有機化合物濃縮的一種有效方法。生物大分子在冰凍時，水分結成凍，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中。操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融解點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液，用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
吸收法 是一種通過吸收劑直接吸收溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。使用的吸收劑必須與溶液不起化學反應，對生物大分子不起吸附作用，易與溶液分開，吸收劑除去溶劑後能重復使用。實驗室中最常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝膠等。使用凝膠時，首先選擇凝膠粒度大小恰好溶劑及低分子物質能滲入凝膠內，而生物大分子卻完全排除於凝膠之外的，然後將洗凈和乾燥的凝膠直接投入待濃縮的稀溶液中，凝膠親水性強，在水中溶脹時，溶劑及小分子被吸收到凝膠內，生物大分子留下剩餘的溶液中，離心或過濾除去凝膠顆粒，即得已濃縮的生物大分子溶液。凝膠溶脹時吸收水分及小分子物質可同時起到濃縮及分離純化兩種作用，對生物大分子結構和生物活性都沒有影響。是近年來生物化學及分子生物學日益廣泛使用的濃縮和分離方法之一。
使用聚乙二醇等其他吸收劑時，需先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，扎緊袋口，外加聚乙二醇復蓋，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被溶劑飽和後，可更換新的，直到濃縮至所需的濃度為止。用完一次以後的聚乙二醇經過加熱除去溶劑便可再次使用。
4．超濾法超濾法是使用一種特製的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法。當溶液在一定壓力下(外源氮氣壓或真空泵壓)通過膜時，溶液和小分子透過，大分子受阻保留於原來溶液中，其原理如圖2—2所示。這一近年發展起來的新方法是適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持生物大分子生理活性、回收率高等優點。除去濃縮、脫鹽外，並可應用生物大分子的分離純化，是目前民展較快且為人們所採用的生化技術之一。
圖2-2超濾法示意圖
通過超濾法，蛋白質和酶的稀溶液一般可濃縮到10%～15%濃度，回收率高達90%。超濾法應用關鍵在於膜選擇。不同類型的規格的膜、水的流速(在規定壓力下以ml/cm2/h或分表示)、分子量截止值(即大體上能被膜保留分子最小分子量數值)等參數均不同，必須根據工作的需要來選用。此外，超濾裝置形式、溶質成分及性質、溶液濃度及粘度都對超濾的效果有一定影響。
製品濃縮到一定程度，即可貯存，如有必要可採用低溫乾燥(冰干)的方法除去製品中溶劑，使之成乾粉。
製品的貯存可分干態貯存和液狀貯存。但不論是何種方法貯存，都要避免長期暴露在空氣中，防止微生物的污染。溫度對生物活性物質的活性影響很大，在絕大多數情況下應採取低溫保存。
干態儲藏：乾燥的製品一般比較穩定，如製品含水量很低，在低溫情況下，生物大分子活性可在數個月甚至數年沒有顯著變化。儲藏方法也很簡單，只將乾燥後的樣品置於乾燥器內(內裝有乾燥劑)密封，保持0～4℃冰箱中即可。有時為了取樣方便和避免取樣時樣品吸水和污染，可先將樣品分裝成許多小瓶中，每次用時，只取一小瓶。
液態儲藏：液態儲藏的優點是使樣品減去乾燥這一步驟，生物大分子的生理活性和結構破壞較少，缺點是需要較嚴格的防腐措施，儲藏時間不能太長。如樣品量大時封裝運輸不方便，實驗室常採取少量安瓿封存方法。液態儲藏注意事項如下：
樣品不能太稀，必須濃縮至一定濃度後才能封裝儲藏，樣品太稀時容易引起生物大分子變性作用。
一般需加入防腐劑和穩定劑，常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質和酶常用的穩定劑有蔗糖、甘油等，如酶也加入底物和輔酶以提高其穩定性，此外鈣、鋅、硼酸等鹽溶液對某些酶也具有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標准緩沖液中。