分子遺傳標記的方法有哪些

A. DNA分子標記有哪些技術特點

分子標記是繼形態標記、細胞標記和生化標記之後發展起來的一種較為理想的遺傳標記形式,它以蛋白質、核酸分子的突變為基礎,檢測生物遺傳結構與其變異。分子標記技術從本質上講,都是以檢測生物個體在基因或基因型上所產生的變異來反映生物個體之間的差異。每一種分子標記都有其自身的特點和特定的應用范圍,但就一般意義而言,DNA 分子標記與形態標記和生化標記等相比,具有許多獨特的優點: ①不受組織類別、發育階段等影響。植株的任何組織在任何發育時期均可用於分析。②不受環境影響。因為環境隻影響基因表達(轉錄與翻譯) ,而不改變基因結構即DNA 的核苷酸序列。③標記數量多,遍及整個基因組。④多態性高,自然存在許多等位變異。⑤有許多標記表現為共顯性,能夠鑒別純合基因型和雜合基因型, 提供完整的遺傳信息。⑥DNA 分子標記技術簡單、快速、易於自動化。⑦提取的DNA 樣品,在適宜條件下可長期保存,這對於進行追溯性或仲裁性鑒定非常有利。因此,DNA 分子標記可以彌補和克服在形態學鑒定及同工酶、蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題,因而在品種鑒定方面展示了廣闊的應用前景。

1. 1 第1 代分子標記

1.1. 1 RFLP 標記技術。

1980 年Botesin提出的限制性片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作為遺傳標記,開創了直接應用DNA 多態性的新階段,是最早應用的分子標記技術 。RFLP 是檢測DNA 在限制性內切酶酶切後形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位點的分布情況,因此DNA 序列上的微小變化,甚至1 個核苷酸的變化,也能引起限制性內切酶切點的丟失或產生, 導致酶切片段長度的變化。

優點：RFLP 標記的等位基因具有共顯性的特點,結果穩定可靠,重復性好,特別適應於構建遺傳連鎖圖。

缺點：在進行RFLP 分析時,需要該位點的DNA片段做探針,用放射性同位素及核酸雜交技術,既不安全又不易自動化。另外,RFLP 對DNA 多態性檢出的靈敏度不高,RFLP 連鎖圖上還有很多大的空間區。

1.1. 2 RAPD 標記技術。

為了克服RFLP 技術上的缺點,Williams等於1990年建立了隨機擴增多態DNA Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技術,由於其獨特的檢測DNA 多態性的方式使得RAPD 技術很快 滲透於基因研究的各個領域。RAPD 是建立於PCR 基礎之上的分子標記技術,基本原理是利用一個隨機引物(8～10 個鹼基) 通過PCR 反應非定點地擴增DNA 片段,然後用凝膠電泳分離擴增片段來進行DNA 多態性研究。對任一特定引物而言,它在基因組DNA 序列上有其特定的結合位點,一旦基因組在這些區域發生DNA 片段插入、缺失或鹼基突變,就可能導致這些特定結合位點的分布發生變化,從而導致擴增產物的數量和大小發生改變,表現出多態性。

優點：與RFLP 相比,RAPD 技術簡單,檢測速度快,DNA 用量少,實驗設備簡單,不需DNA 探針,設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析,不依賴於種屬特異性和基因組的結構,合成一套引物可以用於不同生物基因組分析,用一個引物就可擴增出許多片段,而且不需要同位素,安全性好。

缺點：當然,RAPD 技術受許多因素影響,實驗的穩定性和重復性差,首先是顯性遺傳,不能識別雜合子位點,這使得遺傳分析相對復雜 ,在基因定位、作連鎖遺傳圖時,會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的准確性屬特異性和基因組的結構,合成一套引物可以用於不同生物基因組分析,用一個引物就可擴增出許多片段,而且不需要同位素,安全性好。當然,RAPD 技術受許多因素影響,實驗的穩定性和重復性差,首先是顯性遺傳,不能識別雜合子位點,這使得遺傳分析相對復雜 ,在基因定位、作連鎖遺傳圖時,會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的准確性下降;其次,RAPD 對反應條件相當敏感,包括模板濃度、Mg2 +濃度,所以實驗的重復性差 。

1. 1. 3 AFLP 標記技術

擴增片段長度多態技術(AFLP) ,又名限製片段選擇擴增技術(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,於1993 年由荷蘭KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等發明,並已申請專利。AFLP 是近年來迅速發展起來的一種分子標記技術,它將基因組DNA 用成對的限制性內切酶雙酶切後產生的片段用接頭(與酶切位點互補) 連接起來,並通過5′端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量DNA 片段,從而形成指紋圖譜的分子標記技術。AFLP 指紋呈孟德爾式共顯性和顯隱性遺傳。

優點：它兼具RAPD 與RFLP 的優點,有較高的穩定性,用少量的選擇性引物能在較短時間內檢測到大量位點,並且每對引物所檢測到的多個位點都或多或少地隨機分布在多條染色體上,各染色體上AFLP 標記的數目與染色體長度呈正相關( r = 0. 501) ,而一對引物獲得的標記涉及的染色體數與標記數呈正相關( r = 0. 826) 。因此,通過少量效率高的引物組合,可獲得覆蓋整個基因組的AFLP 標記 。目前,AFLP 作為一種高效的指紋技術,已在遺傳育種研究中發揮它的優勢。

缺點：不過也有研究認為,AFLP 對基因組純度和反應條件要求較高,另外用於遺傳作圖時,少數的標記與圖譜緊密度有出入。此外, 在RAPD 和RFLP 技術基礎上建立了SCAR(Sequence characterize damplified regions ,序列特異性擴增區域) 、CAPS(Cleaved ampli2fied polymorphic sequence ,酶切擴增多態序列) 和DAF(DNA am2plified fingerprints ,DNA 擴增指紋) 等標記技術 。這些技術的出現,進一步豐富、完善了第1 代分子標記技術,增加了人們對DNA 多態性的研究手段。

1. 2 第2 代分子標記

1. 2. 1 SSR 標記技術。

在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復序列,如重復單位長度在15～65 個核苷酸的小衛星DNA(Minisatellite DNA) ,重復單位長度在2～6 個核苷酸的微衛星DNA (Microsatellite DNA) 。小衛星和微衛星DNA 分布於整個基因組的不同位點。由於重復單位的大小和序列不同以拷貝數不同,從而構成豐富的長度多態性。Moore 等於1991 年結合PCR 技術創立了SSR (Simple sequence repeat ,簡單重復序列) 標記技術。SSR 也稱微衛星DNA ,是一類由幾個(多為1～5 個) 鹼基組成的基序串聯重復而成的DNA 序列,其中最常見的是雙核苷酸重復,即(CA) n和(TG) n ,每個微衛星DNA 的核心序列結構相同,重復單位數目10～60 個,其高度多態性主要來源於串聯數目的不同。不同遺傳材料重復次數不同,導致了SSR 長度的高度變異性,這一變異性正是SSR 標記產生的基礎。SSR 標記的基本原理:根據微衛星重復序列兩端的特定短序列設計引物,通過PCR 反應擴增微衛星片段。由於核心序列重復數目不同,因而擴增出不同長度的PCR 產物,這是檢測DNA 多態性的一種有效方法。微衛星序列在群體中通常具有很高的多態性,而且一般為共顯性,因此是一類很好的分子標記。目前已利用微衛星標記構建了人類、小鼠、大鼠、水稻、小麥、玉米等物種的染色體遺傳圖譜。

優點：這些微衛星標記已被廣泛應用於基因定位及克隆、疾病診斷、親緣分析或品種鑒定、農作物育種、進化研究等領域。此外,SSR 標記不僅能夠鑒定純合體和雜合體,而且結果更加可靠,方法簡單,省時省力。

1. 2. 2 ISSR 標記技術。

ISSR 即內部簡單重復序列,是一種新興的分子標記技術。1994 年Zietkiewicz 等對SSR 技術進行了發展,建立了加錨微衛星寡核苷酸(Anchored microsatellite oligo nucleotides) 技術 。他們用加錨定的微衛星寡核苷酸作引物,即在SSR 的5′端或3′端加上2～ 4 個隨機選擇的核苷酸,這可引起特定位點退火,從而導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間的基因組節段進行PCR 擴增。這類標記又被稱為ISSR ( Inter2simple

sequence repeat ) 、ASSR(Anchored simple sequence repeats) 或AMP2PCR 。在所用的兩翼引物中,可以一個是ASSR 引物,另一個是隨機引物。如果一個是5′端加錨的ASSR 引物,另一個是隨機引物,則被稱為RAMP 技術[19] 。用於ISSR2PCR 擴增的引物通常為16～18 個鹼基序列,由1～4 個鹼基組成的串聯重復和幾個非重復的錨定鹼基組成,從而保證了引物與基因組DNA 中SSR 的5′或3′末端結合,通過PCR 反應擴增SSR 之間的DNA 片段。

優點：SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的,並且進化變異速度非常快,因而錨定引物的ISSR2PCR 可以檢測基因組許多位點的差異。與SSR2PCR 相比,用於ISSR2PCR 的引物不需要預先的DNA 測序,也正因如此,有些ISSR 引物可能在特定基因組DNA 中沒有配對區域而無擴增產物,通常為顯性標記,呈孟德爾式遺傳,且具有很好的穩定性和多態性。

1. 3 第3 代分子標記

1. 3. 1 SNP 標記技術。

單核苷酸多態性(Single nucleotidepolymorphism ,SNP) 被稱為第3 代DNA 分子標記,是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異,這種差異包括單個鹼基的缺失或插入,更常見的是單個核苷酸的替換,且常發生在嘌呤鹼基(A 與G) 和嘧啶鹼基(C 與T) 之間。SNP 標記可幫助區分兩個個體遺傳物質的差異,被認為是應用前景最好的遺傳標記。目前,已有2 000 多個標記定位於人類染色體上,在擬南芥上也已發展出236 個SNP 標記。在這些SNP 標記中大約有30 %包含限制性位點的多態性。

優點：檢測SNP 的最佳方法是DNA 晶元技術,最新報道的微晶元電泳(Microchip electrophoresis) ,可以高速度地檢測臨床樣品的SNP ,它比毛細管電泳和板電泳的速度可分別提高10 和50倍 。SNP 與第1 代的RFLP 及第2 代的SSR 標記的不同有2 個方面:其一,SNP 不再以DNA 片段的長度變化作為檢測手段,而直接以序列變異作為標記;其二,SNP 標記分析完全摒棄了經典的凝膠電泳,代之以最新的DNA 晶元技術。

1. 3. 2 EST 標記技術。

表達序列標簽( Expressed sequence Tag , EST)是美國國立衛生研究院(National Institutes of Health ,NIH) 的生物學家Venter 於1991 年提出的。隨著人類基因組計劃的開展,EST 技術首先被廣泛應用於尋找人類新基因,繪制人類基因組圖譜,識別基因組序列編碼區等研究領域,之後又被廣泛應用於植物基因組研究。EST 是指在來源於不同組織的cDNA 文庫中隨機挑選克隆、測序,得到部分cDNA 序列,一個EST對應於某一種mRNA 的cDNA 克隆的一段序列,長度一般為150～500 bp ,只含有基因編碼區域。

優點：EST可代表生物體某種組織某一時間的一個表達基因,所以被稱之為「表達序列標鑒」;而EST的數目則顯示出其代表的基因表達的拷貝數,一個基因的表達次數越多,其相應的cDNA 克隆越多,所以通過對cDNA 克隆的測序分析可以了解基因的表達豐度。目前構建cDNA 文庫一般都使用試劑盒,方法成熟,而且飛速發展的DNA 測序技術,也使得進一步降低大規模DNA 序列測定成本成為可能 。

B. 在人類基因組中有哪些遺傳標記用它們能為科研和應用做什麼服務

遺傳標記包括形態學標記、細胞學標記、生物化學標記、免疫學標記 和分子標記五種類型。

形態學標記
形態標記是指肉眼可見的或儀器測量動物的外部特徵 (如毛色、體型、外形、皮膚結構等)，以這種形態性狀、生理性狀及生態地理分布等待征為遺傳標記，研究物種間的關系、分類和鑒定。形態學標記研究物種是基於個體性狀描述，得到的結論往往不夠完善，且數量性狀很難剔除環境的影響，需生物統計學知識進行嚴密的分析。但是用直觀的標記研究質量性狀的遺傳顯得更簡單、更方便。目前此法仍是一種有效手段並發揮著重要作用。
細胞學標記
細胞遺傳標記是指對處理過的動物個體染色體數目和形態進行分析，主要包括：染色體核型和帶型及缺失、重復、易位、倒位等。一個物種的核型特徵即染色體數目、形態及行為的穩定是相對的，故可作為一種遺傳標記來測定基因所在的染色體及在染色體上的相對位置，染色體是遺傳物質的載體，是基因的攜帶者，染色體變異必然會導致生物體發生遺傳變異，是遺傳變異的重要來源。通過比較動物與其近緣祖先的染色體數目和結構，追溯動物的起源和演化，檢測動物的遺傳特性，為動物育種提供較好的方法。
生物化學標記
生化遺傳標記是以動物體內的某些生化性狀為遺傳標記，主要指血型、血清蛋白及同工酶。 20世紀60年代以來，蛋白電泳技術作為檢測遺傳特性的一種主要方法得到了廣泛的應用。蛋白電泳所檢測的主要是血漿和血細胞中可溶性蛋白和同工酶中氨基酸的變化，通過對一系列蛋白和同工酶的檢測，就可為動物品種內的遺傳變異和品種間的親緣關系提供有用的信息川。但是，蛋白和同工酶都是基因的表達產物，非遺傳物質本身，它們的表現易受環境和發育狀況的影響；這些因素決定了蛋白電泳具有一定的局限性，但是蛋白電泳技術操作簡便、快速及檢測費用相對較低，日前仍是遺傳特性研究中應用較多的方法之一。生化遺傳標記經濟、方便，且多態性比形態學標記和細胞遺傳標記豐富。已被廣泛應用於物種起源與分類研究和動物育種中。

免疫學標記
免疫學標記是以動物的免疫學特徵為遺傳標記，主要指：紅細胞抗原、白細胞抗原、胸腺細胞抗原等。早在1900年，Ehrlich和Morgenroth指出山羊紅細胞表面存在抗原，並證明這些抗原具有個體差異；20世紀80年代初，人們轉向白細胞抗原的研究，即主要組織相容性復合體(MHC)， MHC的重要特性與疾病及生理性狀具有重要關系。根據動物個體淋巴細胞抗原特異性，研究品種間、個體間、抗病力強弱的差異及親子關系等。

分子標記

分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是 DNA 水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記——形態標記、同工酶標記、細胞標記相比，DNA 分子標記具有的優越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性的農藝性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的 DNA 都可用於標記分析；分子標記揭示來自 DNA 的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，現在 DNA 分子標記技術已有數十種，廣泛應用於作物遺傳育種、基因組作圖、基因定位、植物親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。

態學標記、細胞學標記、生化標記、免疫學標記等一直被廣泛應用，然而這些標記都無法直接反映遺傳物質的特徵，僅是遺傳物質的間接反映，且易受環境的影響，因此具有很大的局限性。DNA作為遺傳物質的載體，是研究動物遺傳特性的一個重要指標。20世紀80年代以來，隨著分子生物學技術和分子遺傳學的迅速發展，分子克隆及DNA重組技術的日趨完善，研究者對基因結構和功能研究的進一步深入，在分子水平上尋找DNA的多態性，以此為標記進行各種遺傳分析。DNA分子標記直接反映DNA水平上的遺傳變異，能穩定遺傳，信息量大，可靠性高，消除了環境影響。DNA水平的遺傳標記自產生以來得到廣泛應用。通過對DNA的研究，對於單基因病，採用「定位克隆」和「定位候選克隆」的全新思路，導致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發現，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎。對於心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經精神類疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點。基因診斷、基因治療和基於基因組知識的治療、基於基因組信息的疾病預防、疾病易感基因的識別、風險人群生活方式、環境因子的干預都是DNA為我們的醫學事業所做出的貢獻。

C. 寄生蟲分類鑒定的分子遺傳標記有哪些

寄生蟲分類鑒定的分子遺傳標記有哪些
遺傳標記Genetic Marker指可追蹤染色體、染色體某一節段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特徵，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。
遺傳標記包括形態學標記(morphological marker)、細胞學標記(cytological marker)、生物化學標記(biochemical marker)、免疫學標記(Immune Genetic Markers)和分子標記(molecular marker)五種類型。

D. 分子標記方法

分子標記
在農業基礎與應用研究領域，分子標記技術已開始應用於作物種質資源和育種的研究，特別是在構建分子遺傳圖譜和標記目的性狀基因方面取得了很大的進展。

形態標記（morphologica markers）即植物的外部特徵特性，如株高、穗長、粒色、千粒重等。此種形態標記簡單直觀，但是形態標記數少、多態性差、易受環境條件影響。在小麥抗葉銹病基因標記方面，SINGH[5]曾利用形態標記發現慢葉銹基因Lr34和小麥葉片尖部壞死基因緊密連鎖。

細胞標記（cytological markers）主要是染色體核型（染色體鼠數目、大小、隨體、著絲點位置等)和帶型(C帶、N帶、G帶等)，這類標記的缺點是數目有限。目前，還未發現用其進行小麥抗葉銹基因的標記。

生化標記(biochemical markers)主要包括同工酶和儲藏蛋白。生化標記具有經濟方便的優點，但其標記數有限。DAVlD[6]等曾利用生化標記內肽酶同工酶EP-Dld作為遺傳標記對以Thatcher為背景的小麥抗葉銹病近等基因系進行連鎖分析，發現EP-Dld與Lr19緊密連鎖，重組值為(0.01士0.09)個作圖單位。WINZELER[7]等利用含Lr19的小麥抗葉銹病近等基因系，發現生化標記內肽酶同工酶EP-Dl的無效等位基因EP-Dlc可以作為與 Lr19緊密連鎖的生化標記，遺傳距離為(0.33士0.33)cM。

分子標記與形態標記、細胞標記、生化標記相比較，有以下幾方面的優點:①在植物體的多個組織及生育階段均可檢測到，不受時空限制。②數量多，遍及整個基因組。③有許多標記表現為共顯性，能夠鑒別基因型純合與否，提供完整的基因型。在標記小麥抗葉銹病基因方面，分子標記可以在更深層次上揭示小麥抗銹遺傳機制。通過找到與抗銹基因緊密連鎖的分子標記，不但能在遺傳背景不同的育種材料中特異性的檢測目的基因，而且可以在任一生育階段同時對多個抗性基因進行篩選，這為了解抗源和抗病品種中所含有的抗性基因提供了更為迅速、穩定、可靠的方法。

目前，用於標記小麥抗葉銹病基因的分子標記主要有以下幾種:

2.l RFLP技術在小麥抗葉銹病基因標記中的應用

RFLP(restriction fragment length polymorphism)作為遺傳分析的工具開始於1974年，80年代開始應用於植物。其基本原理是物種的基因組DNA在限制性內切酶的作用下，產生相當多的、大小不等的DNA片段，用放射性同位素標記的DNA做探針把與被標記DNA相關的片段檢測出來，從而構建出多態性圖譜;它所代表的是基因組 DNA在限制性內切酶消化後產生的片段在長度上的差異。RFLP技術被廣泛應用於小麥遺傳圖譜的構建標記和定位小麥的目的基因。

在小麥抗葉銹病基因的RFLP標記方面，SCHACHERMAYR等[8]將一編碼受體蛋白激酶的Lrkl0基因的3.9Kb的HindⅢ片段用 PstⅠ分成六個亞片段，將這些亞片段作為RFLP標記，尋找到了特異的Lrk10片段可作為與小麥抗葉銹病基因Lr10緊密連鎖的分子標記，將這一亞片段與已知抗性基因的單基因系進行Southern雜交，發現這一3.9Kb的HindⅢ片段僅存在於攜帶抗葉銹病基因Lr10的近等基因系中。進一步將此 RFLP標記Krkl0-6轉變為STS標記STSLrkl0一6，發現一282bp的片段僅存在於攜帶Lr10的品種中，F2群體分離進一步證明此 282bp的片段與Lr10緊密連鎖。SCHACHERMAYR等[9]利用近等基因系找到了與抗葉銹病基因Lr24緊密連鎖的RFLP和RAPD的標記。在供試的115個RFLP探針中，其中6個與Lr24緊密連鎖，從360個隨機RAPD引物中，找到了11個能夠揭示多態性的引物，其中一個與 Lr24緊密連鎖，並將該RAPD產物克隆、測序將其轉化為更為穩定可靠的STS標記，為分子標記輔助育種打下了良好的基礎。FEUILLET等[10] 利用小麥抗葉銹病近等基因系Lr1/6*Thatcher和Thatcher及感病品種Frisal，通過F2群體分離，將37個RFLP中的16個定位在了第五部分同源群，而且能在Lr1/6*Thatcher和Frisal之間揭示多態性，I1個RFLP探針能在近等基因系間揭示多態性，F2群體分離分析發現，其中3個與抗性基因連鎖，其中一定位在染色體5D上的探針pTAG621證明與Lr1緊密連鎖，並將這一RFLP標記轉化為了更為可靠的STS 標記。

AUTRIQUE[11]等利用4種含不同抗性基因的小麥近等基因系，根據抗性基因在其染色體上所處的位置選擇克隆，同時，從大麥的RFLP連鎖圖譜和D一基因組RFLP圖譜中，挑選了其它的克隆。通過雜交的方法來尋找多態性分子標記。結果發現，定位在染色體7DL和3DL上的8個分子標記，與抗性基因Lr19和Lr24共分離;來自Aegilops umbellulata的Lr9，被定位在染色體6B上，一克隆XksuD27與Lr9共分離，以及與Lr32緊密連鎖的兩個RFLP標記，遺傳距離分別為(3.3土2.6)cM和(6.9土3.6)cM。

2.2 小麥抗葉銹病基因的RAPD標記

NAIK等[12]利用含Lr28的抗葉銹病近等基因系，從80個隨機引物中找到了一個能在供體親本和輪回親本中揭示多態性的RAPD標記OPJ一 O1。將此387bp的多態性產物克隆、測序，將其設計成更為穩定的STS標記，利用BSA法，對F3群體進行分析，發現387bp的特異性產物只出現在抗性群體中，而在感病群體中表現缺失。證明了RAPD標記OPJ一O1和STS 標記均與Lr28緊密連鎖。SIELDLER等[13]利用400個隨機引物和14個DNA探針篩選近等基因系Lr9的多態性，並通過F2群體進行遺傳連鎖分析。結果表明2個RAPD標記和一個RFLP標記可以區分抗感品系,且與Lr9緊密連鎖。WILLIAM等[14]利用RAPD技術，從400個隨機引物中，找到了3個能在抗病群體和感病群體中揭示多態性的引物0PG-05、0P1-16和OPR-03，將其克隆轉化成探針後，對重組群體進行 Southern雜交，確定其中前兩個探針與持久抗葉銹病基因相關的數量性狀位點(QTL)緊密連鎖，其中定位在7BL上的QTL與抗葉銹病基因Lr34 部分同源。SCHACHERMAYR等[15]從395個隨機引物中篩選出了3個與小麥抗葉銹病基因Lr9連鎖的RAPD標記，將其特異性產物克隆、測序，然後轉化成更為穩定的STS標記，F2、F3分離群體檢測發現，所有的3個RAPD標記0PA-07、0PJ-l3、OPR-15和一RFLP標記 cMWG684與Lr9緊密連鎖。另一RFLP標記PSR546也與Lr9緊密連鎖，並與上述四個

DNA標記緊密連鎖，遺傳距離為(8士2.4)cM，此標記被定位在小麥染色體長臂6BL上。DEDRYVER等[16]利用含Lr24的小麥抗葉銹病近等基因系，在125個隨機引物中，只有引物OP-H5能在抗病親本RL6064中擴

增出一700bp的特異性的條帶，而在感病親本Thatcher中沒有。F2群體分離證明，該標記與Lr24完全連鎖。將其轉變成穩定、可靠的SCAR標記，為分子標記輔助育種提供了有力的工具。

3 其它分子標記

雖然RFLP和RAPD是兩種比較普遍的分子標記，但RFLP在小麥中檢測的多態性較低，僅為20%--38%。RAPD是方便經濟的分子標記，但是重復性和穩定性較差。其它的分子標記，如SSR、ISSR和AFLP的綜合信息量大，在作物特別是小麥遺傳資源的研究上有著廣闊的應用前景。

4 分子標記輔助選擇

目前，分子標記技術已開始應用於育種實踐，並表現出其獨特的優越性。尋找與重要的農藝性狀緊密連鎖的分子標記，是進行分子標記輔助選擇(又稱分子育種)和通過作圖克隆基因的基礎。分子標記輔助選擇(Molecular-assisted-selection簡稱MAS)是生物技術與傳統遺傳育種相結合而形成的，它可以減少傳統的回交育種過程中很難消除的連鎖累贅，還可以把不同抗葉銹病基因聚合到同一優良品種中，實現同效基因的累加作用，獲得持久抗性。在獲得穩定的分子標記的基礎上，通過染色體步行(Chromosome walking)等方法分離克隆該基因。

由於分子標記育種技術目前尚不成熟和完善，因此還不能作為一種育種方法單獨使用。我國傳統育種經驗豐富，因此，應注意將分子標記這一先進技術與育種家的豐富經驗相結合，使分子標記輔助選擇發揮其更大的作用。

E. 基因的遺傳標記主要有哪幾種類型

遺傳標記主要有4種類型，即形態標記（morphological：markers）、細胞學標記（cytological：markers）、生化標記（biochemical：markers）和分子標記（molecular：markers）四種類型。

在植物遺傳育種研究中可被利用的遺傳標記應具備以下幾個條件：①多態性高；②遺傳穩定，表現共顯性；③對農藝性狀影響小；④能檢測整個基因組；⑤經濟方便，容易觀察記載。

F. 標記輔助選擇的尋找方法

（二）尋找分子遺傳標記的主要方法
DNA標記主要分為兩類型：Ⅰ型標記物，主要是一些單基因，用於比較各品種同源位點的相對距離及連鎖和線性相關性；Ⅱ型標記物，主要是多態性高、信息含量豐富的DNA片段，其中最常用的是微衛星標記。分子標記的種類越來越多，主要種類有限制性片段長度多態笥（RFLP）、隨機擴增多態DNA（RAPD）、擴增片段長度多態性（AFLP）、微衛星（Microsatellites）等。目前，世界關於豬的研究中共有標記2505個，含微衛星標記1391個；Ⅰ型標記873個，Ⅱ型標記1632個。
尋找分子遺傳標記的主要方法有候選基因法和基因組掃描法。
1. 候選基因法作為某個性狀的候選基因通常是一些已知其生物學功能和核酸序列的基因，它們參與性狀的生長發育過程。這些基因可能是結構基因、調節基因或是在生化代謝途徑中影響性狀表達的基因。候選基因法研究要遵循一定的步驟，如候選基因的選擇引物設計，基因特定片段的擴增，多態位點的尋找等。候選基因法是利用那些被認為對於一個性狀有直接生理功能的基因，去尋找QTL；此外，在其他物種發現的控制一些性狀的基因可作為豬的候選基因進行研究。如心臟脂肪酸結合蛋白（H-FABP）基因，影響豬的背膘厚和肌內脂肪含量（Gerbens等，1999；2000；2001）；黑素皮質激素受體4（MC4R）基因與豬的採食量、背膘厚及生長速度顯著相關（Kim等，1999；2000）。
2. 基因組掃描法 豬的19對染色體上儲存了全部的遺傳信息。通過建立參考家系，如梅山×歐美豬種、野公豬×大白豬，並且利用它們的雜交後代通過遺傳標記去尋找QTL。最有效的設計是F2代分離群進行基因型分析，圖4-2就是一個進行單遺傳標記和連鎖QTL分析的簡單示意圖。在F1代中遺傳標記及其連鎖QTL的等位基因為雜合子。F2代分離群中，每個座位的三種可能基因型的比率應為1：2：1，這時比較標記基因型的平均性能，就可以分析連鎖QTL的存在。
Anderson等（1994），報道了用野公豬×大白豬建立的參考群的研究結果，利用遺傳圖譜中105個DNA標記，對分離群F2代200頭豬進行連鎖分析的研究中發現：第4號染色體存在控制豬生長率和背膘的座位，平均基因效應分別為24g/d和5mm，相當於F2代群體總表型變異的12%和18%。在兩個極端純合子基因型個體間，日增重可以相差50g以上，這造成了豬在上市時體重相差10kg。
（三）MAS育種
在豬育種選擇中，對遺傳力較低（如繁殖性狀）、度量費用昂貴（如抗病性）、表型值在發育早期難以測定（如瘦肉率）或限性表現（如產奶量）的性種效率。據估計，對種公畜先進行標記選擇再進行後裔測定，選擇反應可友提高10%~15%；同胞選擇結合MAS可提高40%左右。綜合多個遺傳標記與性狀信息的選擇指數，可使選擇反應提高50%~200%。在雜交育種中利用標記選擇，可以預測和充分利用雜種優勢。分子遺傳標記還可應用於早期選擇以及篩選和檢測很大的群體，以選擇出具有所需基因型的群體。
例如豬產仔數這一低遺傳 力性狀，用傳統方法改良進展甚微。Rothschild等在1994年發現雌激素受體（ESR）基因是豬產仔數的主效基因之一，該座位在中國梅山豬合成系中可以控制1.5頭總產仔數和1頭活產仔數。在中國二花臉雜交群中，中國農業大學不但證實了Rothschild等人的研究結果，同時還發現了另外一個控制豬產仔數的主效基因座位——FSHβ，這個基因座位可以控制2.0頭總產仔數和1.5頭活產仔數。
雖然，MAS可提高選擇的有效性和年遺傳改進量，但MAS的效能亦受到很多因素的影響，除性狀的遺傳力、選擇強度、被選群體大小之外，決定因素是遺傳標記與QTL的連鎖程度。Zhang（1992）指出，利用與QTL十分緊密連鎖的遺傳標記，可將每個QTL特異地檢測出，最終對遺傳標記的選擇會相當於對QTL本身的選擇。因此，要提高MAS的效能，必須獲得與QTL緊密連鎖的遺傳標記。目前，通過建立豬資源家系，已經將一些與生長、胴體、肉質和繁殖等相關的QTL定位在某些微衛星附近，如3號染色體上微衛星Sw2427—Sw251區域與豬的日增重、4號染色體上S0101—S0107區域與背膘腹脂、7號染色體上S0064—S0066區域與胴體組成和初生重有著很大的相關性。可以預見，隨著更多與QTL緊密連鎖遺傳標記的發現，MAS在實際育種中將會得到更我更有效的應用。

G. 什麼是分子標記分子標記的種類

分子標記的概念有廣義和狹義之分。廣義的分子標記是指可遺傳的並可檢測的DNA序列或蛋白質。狹義分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。
分子標記（Molecular Markers），是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態性的直接的反映。與其他幾種遺傳標記——形態學標記、生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有的優越性有：大多數分子標記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發育的不同階段，不同組織的DNA都可用於標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；表現為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術的發展，DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用於遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。

H. DNA分子標記的種類有哪些，各有何特點

主要介紹以下四種：
1 RFLP ：該技術由Grodzicker等於1974年創立特定生物類型的基因組DNA經某一種限制性內切酶完全酶解後,會產生分子量不同的同源等位片段,或稱限制性等位片段RFLP標記技術的基本原理就是通過電泳的方法分離和檢測這些片段凡是可以引起酶解位點變異的突變,如點突變（新產生和去除酶切位點）和一段DNA的重新組織（如插入和缺失造成酶切位點間的長度發生變化）等均可導致限制性等位片段的變化,從而產生RFLP該技術包括以下基本步驟：DNA提取；用DNA限制性內切酶消化；凝膠電泳分離限制性片段；將這些片段按原來的順序和位置轉移到易操作的濾膜上；用放射性同位素或非放射性物質標記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱 Southern雜交）；放射性自顯影或酶學檢測顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態性
RFLP標記的主要特點有：（1）遍布於整個基因組,數量幾乎是無限的；（2）無表型效應,不受發育階段及器官特異性限制；（3）共顯性,可區分純合子和雜合子；（4）結果穩定可靠；（5）DNA需要量大,檢測技術繁雜,難以用於大規模的育種實踐中
2 RAPD ：由Williams等於1990年創立其基本原理與PCR技術一致
PCR技術是一種體外快速擴增特異基因或DNA序列的方法,由Mullis等於1985年首創該技術在試管中建立反應體系,經數小時後,就能將極微量的目的基因或某一特定的DNA片段擴增數百萬倍其原理與細胞內發生的DNA復制過程相類似,首先是雙鏈DNA分子在鄰近沸點的溫度下加熱時便分離成兩條單鏈DNA分子,然後DNA聚合酶以單鏈DNA為模板,並利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互補鏈,以上過程為一個循環,每一個循環的產物可以作為下一個循環的模板,經過20-30個循環後,介於兩個引物間的特異DNA片段以幾何數得以大量復制
RAPD標記技術就是用一個（有時用兩個）隨機引物（一般8-10個鹼基）非定點地擴增基因組DNA,然後用凝膠電泳分開擴增片段遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結合區域發生DNA片段插入缺失或鹼基突變,就有可能導致引物結合位點的分布發生相應的變化,導致PCR產物增加缺少或發生分子量變化若PCR產物增加或缺少,則產生RAPD標記
RAPD標記的主要特點有：（1）不需DNA探針,設計引物也無須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數共顯性）,不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術簡便,不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術；（4）DNA樣品需要量少,引物價格便宜,成本較低；（5）實驗重復性較差,結果可靠性較低
3 AFLP ：由Zabeau和Vos於1993年發明AFLP標記是選擇性擴增基因組DNA酶切片段所產生的擴增產物的多態性,其實質也是顯示限制性內切酶酶切片段的長度多態性,只不過這種多態性是以擴增片段的長度不同被檢測出來該技術結合了RFLP的穩定性和PCR技術的簡便高效性,同時又能克服RFLP帶型少信息量小以及RAPD技術不穩定的缺點其基本技術原理和操作步驟如下：首先用限制性內切酶酶解基因組DNA,形成許多大小不等的隨機限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭（Oligo nuleotide adapter）；然後根據接頭序列設計引物,由於限制性片段太多,全部擴增則產物難以在膠上分開,為此在引物的3端加入1-3個選擇性鹼基,這樣只有那些能與選擇性鹼基配對的片段才能與引物結合,成為模板被擴增,從而達到對限制性片段進行選擇擴增的目的；最後通過聚丙烯醯胺凝膠電泳,將這些特異性的擴增產物分離開來
AFLP標記的主要特點有：（1）由於AFLP分析可以採用的限制性內切酶及選擇性鹼基種類數目很多,所以該技術所產生的標記數目是無限多的；（2）典型的AFLP分析,每次反應產物的譜帶在50-100條之間,所以一次分析可以同時檢測到多個座位,且多態性極高；（3）表現共顯性,呈典型孟德爾式遺傳；（4）分辯率高,結果可靠；（5）目前該技術受專利保護,用於分析的試劑盒昂貴,實驗條件要求較高
4 SSR（SSLP） ：由Moore等於1991年創立SSR即微衛星DNA,是一類由幾個（多為1-5個）鹼基組成的基序（motif）串聯重復而成的DNA序列,其長度一般較短,廣泛分布於基因組的不同位置,如（CA）n（AT）n（GGC）n等重復不同遺傳材料重復次數的可變性,導致了SSR長度的高度變異性,這一變異性正是SSR標記產生的基礎盡管微衛星DNA分布於整個基因組的不同位置,但其兩端序列多是保守的單拷貝序列,因此可以根據這兩端的序列設計一對特異引物,通過PCR技術將其間的核心微衛星DNA序列擴增出來,利用電泳分析技術就可獲得其長度多態性,即SSR標記
SSR標記的主要特點有：（1）數量豐富,廣泛分布於整個基因組；（2）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標記,可鑒別出雜合子和純合子；（4）實驗重復性好,結果可靠；（5）由於創建新的標記時需知道重復序列兩端的序列信息,因此其開發有一定困難,費用也較高.

I. 法庭科學中常用的DNA遺傳標記有哪些類型

目前法醫dna分析使用的dna遺傳標記主要有：短串聯重復序列（STR）、單核苷酸多態（SNP）和微小插入缺失（Indel）三種。其中STR是目前應用最多的標記。

J. 遺傳標記有哪些

遺傳標記是指在遺傳分析上用作標記的基因，也稱為標記基因。在重組實驗中多用於測定重組型和雙親型。作為標記基因，其功能不一定研究得很清楚，但應突變性狀是明確的，所以容易測定。對於微生物，雖多用與生化性狀有關的基因，但對高等生物則多用與形態性狀有關的基因，也有用著絲粒作為遺傳標記的。在微生物遺傳學中，遺傳標記還區分為選擇性標記（或稱選擇性基因）和非選擇性標記（或稱選擇性基因）二類。

遺傳標記指可追蹤染色體、染色體某一節段、某個基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它具有兩個基本特徵，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。

遺傳標記包括形態學標記、細胞學標記、生物化學標記、免疫學標記和分子標記五種類型。