高效液相色譜中的色譜方法有哪些

1. 高效液相色譜分析法的類型

在吸附色譜中，樣品的極性官能團牢固地保留在填料的吸附活性中心上，非極性烴基幾乎不予保留。所以，要清楚地辨別極性功能團的種類、數量和位置。通常，樣品能用吸附色譜分離的應是能溶解於有機溶劑並是非離子型的，強離子樣品是不適宜的。
吸附色譜所使用的流動相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎，按照樣品的極性加上乙醇，然而，最好是使所加入醇的濃度為10%或更少一些。如有可能，可進一步減小百分數。因為高濃度的醇會減少填料的吸附活性，減弱吸附能力，並使重現困難。 1.正相分配色譜
正相分配色譜適用於不溶於水而溶於有機溶劑且帶有極性基團的樣品，但正相分配色譜不適合於離子型物質。
2.反相分配色譜
這種方法應用非常廣泛，應用的范圍也很廣，在反相分配色譜中，樣品的非極性部分起保留作用。
通過使用的流動相是水—甲醇和水—乙腈，通過加入甲醇或乙腈的量的不同來調節分離，但如果樣品帶有離子型基團，需要在流動相中加入鹽或調節流動相的PH值，例如，如果樣品有一個—COOH 基團，使流動相的PH值是偏向酸性的，由於抑制了—COOH基團的電離而加強了保留。這個方法叫離子抑止法，如果樣品有強離子基，有時候採用在流動相中加入適當抗衡離子以形成離子對的離子對法。
在調節PH值中，保持PH值在填料說明書手冊中所規定的范圍內，大多數化學鍵式的二氧化硅使用在PH=2-9，然而，當加入鹽以後，最好使其PH=7.5-8或更小的，多孔聚合物填料能應用非常廣泛的PH值。 這個方法是用填料的固定相的離子交換基團和樣品的離子基團之間的離子交換來分離樣品組分的，按照所交換的離子分成陽離子交換和陰離子交換。
離子交換色譜使用於能溶於水的離子型物質。在離子交換色譜中，流動相的鹽的濃度、PH及鹽的種類等都對保留值有很大的影響。在高效液相色譜的離子交換中所用的鹽有磷酸鹽、醋酸鹽和硼酸鹽。因為氯化物會腐蝕不銹鋼儀器，在高效液相色譜中不能使用NaCl或其他的氯化物鹽類。根據測量波長有些鹽也不能使用，例如，醋酸吸收大約在210nm，當檢測處在短波端的時候，用醋酸作流動相是不合適的。 凝膠色譜不同於以上三種分離方法。凝膠色譜是根據分子大小用分子篩效應來分離樣品組分的。這個方法也叫排阻色譜或粒度排阻色譜。具有一定孔徑的多孔性合成聚合物經常用作填料。
因為在樣品中，小尺寸的分子深深地滲透到微孔中，所以遲流出，而大尺寸的分子沒有滲透到微孔中，就很快流出。通常合成樹脂的分離使用有機溶劑作流動相，叫做凝膠滲透色譜。
凝膠色譜依樣品的性質又可分為凝膠滲透和凝膠過濾。
1.凝膠滲透色譜
凝膠滲透色譜（GelPermeationChromatography），簡稱GPC。此一類的色譜，使用於有機性溶媒的樣品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用的洗脫液有THF，Chloroform等等。
2.凝膠過濾色譜
凝膠過濾色譜（GelFiltrarionChromatography），簡稱GFC。此一種類的層析法，使用於水溶媒的試劑中，如蛋白質、澱粉及水性合成高分子等等，而所用的溶液有水、緩沖液等等。
凝膠的種類很多，按其原料來源可分為有機膠和無機膠。按其制備的方法又可分為均勻、半均勻和非均勻三種凝膠。而根據凝膠的強度又可分為軟膠、半硬膠和硬膠三大類。根據它對溶劑的適用范圍又可分為親水性、親油性和兩性凝膠等等。

2. 高效液相色譜常用什麼色譜法

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利於樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用於分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

色譜法的基本原理
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動的一相稱固定相；移動的一相稱流動相。
分類：
根據流動相分—以氣體作流動相—氣相色譜——固定相為液體 氣-液色譜
固定相為固體 氣-固色譜
—以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜
固定相為固體 液-固色譜
—當流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜

根據固定相的附著方式
—固定相裝在圓柱管中—柱色譜
—固定相塗敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜）
—液體固定相塗在紙上—紙色譜（平板色譜）

根據分離機理
—分配色譜—樣品組分的分配系數不同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同

根據極性
—流動相極性＞固定相極性-反相色譜
—流動相極性＜固定相極性-正相色譜

氣相色譜只適合分析較易揮發、且化學性質穩定的有機化合物，而HPLC則適合於分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。所以，HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。

一、吸附色譜（adsorption chromatography）
又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。

分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。

固定相： 固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。

流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
應用： 對於極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農葯異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。

二、分配色譜
原理： 固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現分離。
固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。
根據極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上塗布的是極性固定液；
流動相是非極性溶劑；
可分立極性較強的水溶性樣品；
弱極性組分先洗脫出來。

反相分配色譜—固定相載體上塗布的是非極性或弱極性固定液；
流動相是極性溶劑；
強極性組分先洗脫出來。
液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不大為人們所採用。

三、鍵合相色譜

考慮分配色譜法中固定液的缺點，因此將各種不同的有機關能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。
鍵合固定相優點：○ 對極性有機溶劑有良好的化學穩定性
○使色譜柱的柱效高、壽命長
○實驗重現性好
○幾乎適於各種類相的有機化合物的分離，尤其是k』寬范圍的樣品
○可以梯度洗脫
根據極性不同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。
適於分離脂榮、水溶性的極性、強極性化合物

反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性
固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其極性很小。
適於分離非機性、弱極性離子型樣品，
是當今液相色譜的最主要分離模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。

反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。

四、體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）
原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯醯胺等）作固定相，依據樣品分子量大小達到分離目 的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞， 在柱中被強滯留，後被洗脫。

根據樣品性質分類：凝膠過濾（GFC）—用於分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝膠滲透（GPC）—用於分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。

SEC主要依據分子量大小進行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關。因此不採用改變流動相的組成來改善分離度。

五、離子交換色譜
（ion exchange chromatography, IEC）
分離原理：使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用於陽離子的分離；帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用於陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離

3. 高效液相色譜的原理及分析方法

原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
分析方法：
綜述
色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進化學鍵合固定相反應
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鍾內記錄完畢。 2.系統適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子.
色譜柱的理論板數
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖化學鍵合固定相應用
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。

4. 高效液相色譜法的原理是什麼

高效液相色譜法的原理是以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測。

高效液相色譜法有「四高一廣」的特點：

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，一般小於1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

(4)高效液相色譜中的色譜方法有哪些擴展閱讀

高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有「柱外效應」。

在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

空間排阻色譜法以凝膠(gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。

溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。

在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。

5. 高效液相色譜常用什麼色譜法

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法.1．液固色譜法 使用固體吸附劑,被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分...

6. 第二十章：高效液相色譜法

與經典色譜比較優點：

與氣相色譜比較：

按固定相聚集狀態：液液色譜法、液固色譜法

按分離機制：分配、吸附、離子交換、分子排阻四類基本機制

其他分離機制：親和色譜法、手性色譜法、膠束色譜法、電色譜法、生物色譜法

目前最常用固定相是化學鍵和相，稱為化學鍵和色譜法

鍵合相：通過化學反應將有機基團鍵合在載體表面構成的固定相

正相NP、反相RP

採用氰基、氨基等作為固定相，非極性或弱極性溶劑為流動相。

分離極性至中等極性分子行化合物

分離機制一般認為是分配，也有認為是吸附如形成氫鍵的

一般規律：劑型強的組分容量因子k大，後出。流動相極性增強洗脫能力增強

十八烷基硅烷、辛烷基硅烷等，有時也用弱極性或中等極性

流動相以水作為基礎溶劑再加一定量極性調整劑

分離機制有爭論，多種理論模型

影響組分保留行為的主要因素：

分離非極性至中等極性組分

離子對色譜法（IPC）分正相和反相，正相已經少用。

反相離子對色譜法（RP-IPC）是把離子對試劑加入到含水流動相中，使被分析組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子生成不帶電荷的中性離子，使組分k增加，用於分離可離子化或離子型化合物

用於生物鹼類、兒茶酚胺類、有機酸類、維生素類、抗生素類葯物分析

離子色譜法：將離子交換色譜與電導檢測器相結合分析各種離子的方法

可以分析無機和有機陰陽離子，氨基酸、糖類、DNA和RNA的降解產物

分為抑制型（雙柱型）、非抑制型（單柱型）

對於X ^- 離子：

雙柱型使用兩根離子交換柱，一根為分離柱，填有低交換容量的陰離子交換劑，另一根為抑制住，填有高交換容量的陽離子交換劑，兩者串聯。進入分離柱的組分X ^- 按正常離子交換色譜分離，在進入抑制柱，除去組分中的OH ^- 從而使本底電導率降低，利於較大電導率HX的檢測。

非抑制型可使用更低交換容量的固定相，濃度很低、電導率很低的流動相，這樣本底電導率低，試樣離子被洗脫後可直接被電導檢測器檢測

利用手性固定相（CSP）、手性流動相添加劑（CMPA）分離分析手性化合物的對映異構體的色譜方法。還有間接法（加入手性試劑使一對對映體轉變為非對映體用常規方法分離）。

環糊精（CD）也是一種手性選擇劑，分離機制主要是由於分子內熟睡空腔的動銷和多手性中心的作用，如果對映體能被空腔緊密包絡，而且與CD分子外沿的仲醇基作用，則被固定相保留，兩對映體與CD作用程度不同從而分離。

親和色譜法（AC）利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從復雜試樣中分離和分析能產生轉移性親和作用的物質的一種色譜方法。選擇性最高。

要求：顆粒細且均勻、傳質快、機械強度高、耐高壓，化學穩定性好

液固：全多空硅膠、高庚子多空微球

應用最多的是化學鍵和相

要求：化學穩定性好；適宜溶解度；與檢測器相適應；純度高；粘度低

使用前經微孔濾膜過濾，除去固體顆粒，還要脫氣處理

分離方程式：

選擇合適的溶劑強度使組分k在最佳范圍內，選擇合適種類的溶劑改善選擇性使α增大獲得良好分離度R>1.5

在化學鍵和色譜中溶劑洗脫能力即溶劑強度直接與它的極性相關。

溶劑極性用溶劑極性參數表示 ，用以表示正相色譜中洗脫能力

反相鍵合相色譜溶劑強度用另一強度因子S表示

混合溶劑可以用P或S的加權平均表示

HPLC速率理論方程：

盡可能減小柱外死體積

（349頁圖）

高效液相色譜儀一般由高壓輸液系統、進樣系統、色譜柱分離系統、檢測系統和數據處理系統組成

分類：

要求：靈敏度高、雜訊低、線性范圍寬、重復性好、適用范圍廣

紫外檢測器UVD：不破壞樣品，只能檢測有紫外吸收物質、對流動相有限制

熒光檢測器FD：靈敏度更高，只適用於產生熒光物質，體內葯物分析常用

電化學檢測器ECD：極譜、庫侖、安培、電導。電導用於離子檢測，安培應用廣泛，靈敏度高適用於痕量組分分析，凡是具有氧化還原活性的都能進行檢測

蒸發光散射檢測器ELSD：適用於揮發性低於流動相的組分，用於糖類、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、三醯甘油及甾體；對各種物質幾乎有相同響應；但是靈敏度低，流動相必須是揮發性不能含有緩沖鹽。

儀器自動化：

採集和分析色譜數據：

中心計算機控制系統：

超高效液相色譜法UPLC：藉助於HPLC理論及原理，利用小顆粒固定相，非常低的系統體積及快速檢測手段等技術，使分離度、分析速度、檢測靈敏度及色譜峰容量大大提高，從而全面提升了液相色譜的分離分析效能。

操作條件比較（355表）

優點：分析速度快；分離效能高；靈敏度高——小顆粒技術和整體化儀器設計

van Deemter方程，可以發現固定相粒度越小，分離度越大。同時粒度越小，最佳流動相線速度越大，並有更寬優化范圍，因此降低粒度可以提高分析速度。但是會增加系統柱壓差，受到固定相機械強度和色譜儀系統耐壓性限制

常用外標和內標，少用歸一化。對葯品中雜質含量測定常用主成分自身對照法

主成分對照法分為不加校正因子和加校正因子兩種：

注意進行色譜系統適用性試驗：理論塔板數、分離度、拖尾因子和重復性

7. 高效液相色譜的使用方法

高效液相色譜儀操作步驟如下：
1)．
過濾流動相，根據需要選擇不同的濾膜.
2)．
對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鍾。
3)．
打開hplc工作站（包括計算機軟體和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統。
4)．
進入hplc控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)．
有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。
6)．
調節流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。
7)．
設計走樣方法。
8)．
進樣和進樣後操作。
9)．
關機時，先關計算機，再關液相色譜。
10)．
填寫登記本，由負責人簽字。
11)．
流動相均需色譜純度，水用20m的去離子水。
12)．
柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
13)．
所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
14)．
壓力不能太大，最好不要超過2000
psi。
高效液相色譜法（HPLC）又稱「高壓液相色譜」、「高速液相色譜」、「高分離度液相色譜」、「近代柱色譜」等。它是在生化和分析化學中常用的柱層析儀。
高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。
該方法有效方便快捷地解決化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中得出想要的數據，成為重要的分離分析技術。

8. 高效液相色譜法的主要類型有哪些

高效液相色譜法分為：液-固色譜法、液-液色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法。
1、液-固色譜法（液-固吸附色譜法）
固定相是固體吸附劑，它是根據物質在固定相上的吸附作用不同來進行分配的。
①液-固色譜法的作用機制
吸附劑：一些多孔的固體顆粒物質，其表面常存在分散的吸附中心點。
流動相中的溶質分子X（液相）被流動相S帶入色譜柱後，在隨載液流動的過程中，發生如下交換反應：
X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用機制是溶質分子X（液相）和溶劑分子S（液相）對吸附劑活性表面的競爭吸附。
吸附反應的平衡常數K為：
K值較小：溶劑分子吸附力很強，被吸附的溶質分子很少，先流出色譜柱。 K值較大：表示該組分分子的吸附能力較強，後流出色譜柱。
發生在吸附劑表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色譜分離的基礎。
②液-固色譜法的吸附劑和流動相
常用的液-固色譜吸附劑：薄膜型硅膠、全多孔型硅膠、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚醯胺等。
一般規律：對於固定相而言，非極性分子與極性吸附劑（如硅膠、氧化銅）之間的作用力很弱，分配比k較小，保留時間較短；但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強，分配比k大，保留時間長。
對流動相的基本要求： 試樣要能夠溶於流動相中 流動相粘度較小
流動相不能影響試樣的檢測
常用的流動相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。
③液-固色譜法的應用
常用於分離極性不同的化合物、含有不同類型或不；數量官能團的有機化合物，以及有機化合物的不同的異構體；但液-固色譜法不宜用於分離同系物，因為液-固色譜對不同相對分子質量的同系物選擇性不高。
2、液-液色譜法（液-液分配色譜法）
將液體固定液塗漬在擔體上作為固定相。
①液-液色譜法的作用機制 溶質在兩相間進行分配時，在固定液中溶解度較小的組分較難進入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定液中溶解度較大的組分容易進入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達到分離的目的。
液-液色譜法與液-液萃取法的基本原理相同，均服從分配定律：K=C固/C液 K值大的組分，保留時間長，後流出色譜柱。
②正相色譜和反相色譜
正相分配色譜用極性物質作固定相，非極性溶劑（如苯、正己烷等）作流動相。 反相分配色譜用非極性物質作固定相，極性溶劑（如水、甲醇、己腈等）作流動相。
一般地，正相色譜是固定液的極性大於流動相的極性，而反相色譜是固定相的極性小於流動相的極性。正相色譜適宜於分離極性化合物，反相色譜則適宜於分離非極性或弱極性化合物。
③液-液色譜法的固定相 常用的固定液為有機液體，如極性的β，β′氧二丙腈（ODPN），非極性的十八烷（ODS）和異二十烷（SQ）等。
缺點：塗漬固定液容易被流動相沖掉。 採用化學鍵合固定相則可以避免上述缺點。
使固定濃與擔體之間形成化學鍵，例如在硅膠表面利用硅烷化反應：形成Si-O-Si-C型鍵，把固定液的分子結合到擔體表面上。
優點：
化學鍵合固定相無液坑，液層薄，傳質速度快，無固定液的流失。 固定液上可以結合不同的官能團，改善分離效能。 固定液不會溶於流動相，有利於進行梯度洗提。
④液-液色譜法的應用
液-液色譜法既能分離極性化合物，又能分離非極性化合物，如烷烴、烯烴、芳烴、稠環、染料、留族等化合物。化合物中取代基的數目或性質不同，或化合物的相對分子質量不同，均可以用液-液色譜進行分離。
3、離子交換色譜法
原理：離子交換色譜法是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的被測離子進行可逆交換，由於被測離子在交換劑上具有不同的親和力（作用力）而被分離。
①離子交換色譜法的作用機制
聚合物的分子骨架上連接著活性基團，如：-SO3-，-N（CH3）3+等。為了保持離子交換樹脂的電中性，活性基團上帶有電荷數相同但正、負號相反的離子X，稱為反離子。
②溶劑和固定相
兩種類型：多孔性樹脂與薄殼型樹脂。
多孔性樹脂：極小的球型離子交換樹脂，能分離復雜樣品，進樣量較大；缺點是機械強度不高，不能耐受壓力。
薄殼型離子交換樹脂：在玻璃微球上塗以薄層的離子交換樹脂，這種樹脂柱效高，當流動相成分發生變化時，不會膨脹或壓縮；缺點是但柱子容量小，進樣量不宜太多。
③離子交換色譜法的應用
主要用來分離離子或可離解的化合物，凡是在流動相中能夠電離的物質都可以用離子交換色譜法進行分離。
廣泛地應用於：無機離子、有機化合物和生物物質(如氨基酸、核酸、蛋白質等)的分離。 4.凝膚色譜法（空間排阻色譜法）
凝膠是一種多孔性的高分子聚合體，表面布滿孔隙，能被流動相浸潤，吸附性很小。凝膠色譜法的分離機制是根據分子的體積大小和形狀不同而達到分離目的。
①凝膠色譜法的作用機制
體積大於凝膠孔隙的分子，由於不能進入孔隙而被排阻，直接從表面流過，先流出色譜柱；小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受排阻，然後又從孔隙中出來隨載液流動，後流出色譜柱；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。
凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進行分離的一種色譜分析方法。
②凝膠色譜法的固定相
軟質凝膠、半硬質凝膠和硬質凝膠三種。
③凝膠色譜法的應用特點
保留時間是分子尺寸的函數，適宜於分離相對分子質量大的化合物，相對分子質量在400～8×105的任何類型的化合物。
保留時間短，色譜峰窄，容易檢測。
固定相與溶質分子間的作用力極弱，趁於零，柱的壽命長。
不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在10%以上時才能得到分離。

9. 高效液相色譜有幾種定量方法其中那種是比較精確的定量方法並簡述

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法