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b淋巴細胞分離方法有哪些

發布時間:2022-12-14 08:56:03

『壹』 免疫細胞分類及分離方法是什麼

免疫細胞(immune cell)主要是指能識別抗原,產生特異性免疫應答的淋巴細胞等。淋巴細胞是免疫系統的基本成分,在體內分布很廣泛泛,主要是T、B淋巴細胞受抗原刺激而被活化(activation),分裂增殖、發生特異性免疫應答。除T淋巴細胞和B淋巴細胞外,還有K淋巴細胞和NK淋巴細胞,共四種類型。T淋巴細胞是一個多功能的細胞群。除淋巴細胞外,參與免疫應答的細胞還有漿細胞、粒細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞及單該吞噬細胞系統的細胞。免疫細胞分離技術
1、淋巴細胞的分離
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋後,沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細胞分離液的試管內(注意勿與分離液混合,然後2000r/min 水平離心20min,管內分為4 層,自上而下依次為血漿,單個核細胞,顆粒白細胞、紅細胞(圖2—1)。用毛細管伸至單個核細胞層中(位於細胞分離液與血漿的界面上),沿管壁輕輕吸出全部細胞。然後用Hanks 液洗兩次,每次2000r/min 離心10min,最後用RPMI l640 培養液將細胞配成2×106/m1 的細胞懸液備用。
2、T 細胞及B 細胞的分離
將淋巴細胞懸液通過尼龍棉柱,B 細胞粘附於尼龍棉上,T細胞則不粘附,先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱,流下的細胞懸液含有豐富的T 細胞。然後用力反復擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細胞,並用少量的RPMI l640 培基洗脫,此細胞懸液含有豐富的B 細胞。尼龍柱(塑料管)的長短和尼龍棉的多少,視分離細胞的多少而定。

3、CD4 細胞及CD8 細胞的分離
(1)CD4 細胞的分離:將一定量的T 細胞懸液通過一根SephDdexC—10 柱,然後用少量的RPMll640 培養洗滌,收獲的細胞懸液約含85%的CD4 細胞。
(2)CD8 細胞分離:用Tris 緩沖液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg/m1)包被一平皿表面,然後放置4℃過夜,沒有包被上的抗體用PBS 洗凈。然後將已標記有抗CD8 單克隆抗體的T 細胞(細胞濃度為1×l07/m1)3m1 加入上述的平皿內,4℃放置2 小時,用PBS 輕輕洗凈末粘附的細胞,然後用毛細管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細胞經洗滌後懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細胞亦可用此法分離。
4、單核巨噬細胞的分離
單核巨噬細胞有粘附塑料或玻璃表面的特性,而淋巴細胞則無此特性,藉此可將這兩類細胞分開,其方法簡述如下。將待分離的細胞懸液(如實物動物的腹腔液)加入適當大小的塑料或玻璃平皿內,置於37℃ C02 溫箱內溫育1 小時,然後用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面,去除非粘附細胞,再將粘附有細胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷,收集粘附的單核巨噬細胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細胞,可重復上述過程。

『貳』 求人外周血B、T淋巴細胞的分離方法

目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。
方法:
1.在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻,用滴管沿管壁緩慢疊加於分層液面上,注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鍾。
3.離心後管內分為三層,上層為血漿和Hank's液,下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液,在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色雲霧層狹窄帶(如下圖),單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外,還含有血小板。

4.用毛細血管插到雲霧層,吸取單個核細胞。置入另一短中管中,加入5倍以上體積的Hank's液或RPMI1640,1500rpm×10分鍾,洗滌細胞兩次。
5.末次離心後,棄上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2%台盼蘭染液混合,於血球計數板上,計數四個大方格內的細胞總數。
單個核細胞濃度(細胞數/1毫升細胞懸液)=
4個大方格內細胞總數
──────────×104×2(稀釋倍數)
4
6.細胞活力檢測:死的細胞可被染成蘭色,活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。
活細胞數
活細胞百分率=──────×100%
總細胞數
用本法分離PBMC,純度在90%以上,收獲率可達80~90%,活細胞百分率在95%以上。

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